간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

이 절차의 전반적인 목표는 상피에서 중간엽으로의 전이 또는 시험관 내 EMT의 유도를 위한 간단하고 재현 가능한 방법을 제공하는 것입니다. 이는 EMT 유도 배지 보충제의 존재 하에 관심 상피 세포 유형을 먼저 도금함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 초기 도금 후 3일 후에 배양 배지를 EMT 유도 배지 보충제를 함유한 신선한 배양 배지로 교체하는 것입니다.

마지막 단계는 면역 염색과 같은 다운스트림 특성 분석을 위해 초기 도금 후 5일 후에 세포를 수확하는 것입니다. 궁극적으로 결과는 광학 현미경, 면역 세포 화학, 서양 혈액 분석 어레이 또는 선택한 다른 분석 절차를 통해 세포가 중간엽 특성을 얻는 것을 보여줄 수 있습니다. TGF 베타 자극 또는 유전자 변형과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 방법이 유전자 변형과 달리 빠르고 쉬우며 다양한 세포 유형에서 EMT 유도를 허용한다는 것입니다.

이러한 기술의 의미는 암 전이의 치료 및 진단으로 확장됩니다. 이 기술을 통해 연구자들은 진단에 사용할 수 있는 전이성 세포의 일반적인 발현 시그니처를 개발할 수 있습니다. 또한 약물 스크리닝에 사용되는 세포를 제공합니다.

수조에서 관심 세포의 배양 배지를 섭씨 37도까지 가열하는 것으로 시작합니다. 다음으로, triple E express와 같은 해리 용액을 사용하여 세포를 수확합니다. 그런 다음 15ml 원뿔형 튜브의 Prewarm 배양 배지에 세포를 현탁시키고 400Gs에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다.

상층액을 폐기물 용기에 부어 조심스럽게 제거하고 Prewarm 배양 배지에 세포 펠릿을 현탁시킵니다. 지금 생존 가능한 세포를 세고십시오, 0.4%Triam 파란 해결책에 있는 세포 현탁액의 표본을 묽게 하십시오. 희석된 샘플 10마이크로리터를 혈구분석기에 놓고 생존 가능한 세포를 계수합니다.

생존 가능한 세포. 용액 플레이트에서 세포 밀도를 계산한 후 파란색으로 변하지 마십시오. 9-10, 1개의 XEMT 유도 매체 보충제를 포함하는 prewarm 배양 매체에서 평방 센티미터 당 000 세포는 조직 배양에 의하여 대우된 플레이트 또는 플라스크 배양을 이용했습니다.

도금된 셀은 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 처리되며 도립 광 현미경을 사용하여 매일 세포의 형태를 모니터링합니다. 3일 후, 배지를 하나의 XEMT 유도 배지 보충제를 포함하는 신선한 예열 배양 배지로 교체합니다. 도금 후 5일이 지나면 세포를 분석할 준비가 됩니다.

반전된 빛 아래에서 세포 형태 시각화 이제 현미경 세포를 고정하거나 수확하여 다운스트림 연구를 수행할 수 있습니다. 95% 에탄올이 함유된 페트리 접시에 커버 슬립을 넣어 24웰 플레이트용 멸균 12mm 커버 슬립을 준비합니다. 구부러진 집게를 사용하여 에탄올에서 덮개 미끄러짐을 부드럽게 제거합니다.

화염은 각 커버 슬립을 살균하고 24웰 플레이트 처리 중 하나의 웰로 이동합니다. 커버 슬립은 주의와 연습이 필요합니다. 다음으로 하나의 XEMT 유도 배지를 포함하는 0.5 밀리리터의 Prewarm 배양 배지. 세포에 보충교재 및 격판덮개 16 의 우물 당 000의 세포.

이제 앞에서 설명한 대로 세포를 성장시키고 공급합니다. 세포를 도금한 후 5일 후에 매체를 제거하고 하나의 XPBS에 4% 파라폼 알데히드를 웰당 300마이크로리터로 고정하여 실온에서 20분 동안 고정을 진행할 수 있습니다. 그런 다음 고정제를 제거하고 웰당 1개의 XPBS 500마이크로리터로 세포를 두 번 헹굽니다.

다음으로, 실온에서 한 시간 동안 웰당 400마이크로리터의 차단 버퍼에 고정된 세포를 배양합니다. 블록을 적용한 후 웰당 400마이크로리터의 차단 완충액에 제조업체가 권장하는 농도로 1차 항체를 준비합니다. 그런 다음 웰에서 블록 용액을 제거하고 항체 혼합물을 세포에 첨가합니다.

세포를 실온에서 3시간 동안 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 그리고 1차 항체가 형광 색소에 직접 접합되어 있다면 어둠 속에서 배양합니다. 다음으로, 1차 항체를 제거하고 0.1%BSA를 함유한 XPBS 1개의 웰당 500마이크로리터로 웰을 3회 세척하고 각 세척을 5분 동안 허용하고 필요한 경우 세포를 빛으로부터 보호합니다.

이제 필요한 경우 제조업체가 권장하는 농도로 2차 항체의 세포를 배양합니다. 1%BSA를 함유한 XPBS 1개의 웰당 400마이크로리터로 항체를 희석합니다. 한 시간 후에 빛을 차단한 실온에서 1시간 배양을 허용합니다.

세척 후 1차 항체를 제거하기 위해 했던 것처럼 세포를 세 번 세척합니다. 원하는 경우 세포에 DPI 카운터 염색을 적용합니다. 마지막으로, 탈이온수로 세포를 헹구고 장착 매체를 사용하여 슬라이드에 덮개를 뒤집어 장착합니다.

다시 말하지만, 커버 슬립을 취급할 때 주의하십시오. EMT 유도 배양 조건은 다양한 세포 유형에서 EMT를 유도하기 위한 강력한 방법을 제공합니다. 이것은 4개의 서로 다른 인간 세포주에서 테스트되었습니다.

EMT 유도 배지 보충제로 처리된 세포는 고전적인 상피 형태에서 중간엽 방추체 모양의 형태로 변화했습니다. e cadherin 및 fibronectin 발현에 대한 이중 염색은 빨간색으로 표시된 상피 마커 e cadherin의 하향 조절과 녹색의 중간엽 마커 fibronectin의 상향 조절을 입증했습니다. 이러한 클러스터는 E이며 여기에서 빨간색으로 표시된 양성일 수 있습니다.

클러스터는 EMT 유도 배지 보충제로 치료하면 사라졌습니다. 이는 녹색에서 피브로넥틴 발현이 증가한 것과 일치했습니다. 티 98.

G는 EMT 유도 전에 테린의 기초 수치가 매우 낮은 것으로 밝혀져 분석이 불가능했습니다. 그러나 이 마커를 사용하면 피브로넥틴 수치가 이러한 세포에서 EMT 유도와 함께 크게 증가하는 것으로 나타났습니다. e ad와 fibronectin의 발현 수준은 총 세포 용해물의 웨스턴 블로팅을 통해 추가로 확인되었습니다.

웨스턴 블롯은 HT 29 세포에서 총 EAD herrin 단백질 수치의 현저한 감소를 보여주지 않지만, EMT 상태를 추가로 평가하기 위해 면역화학에서 볼 수 있는 terrin의 표면 발현이 감소했으며, EMT 상태를 추가로 평가하기 위해 녹색의 menton과 빨간색의 달팽이의 특징인 중간엽 마커를 이전 결과와 일치하는 EMT 유도 전후에 분석했습니다. 본원에서 회색으로 표시된 Eki는 검사된 모든 세포주에서 하향 조절되었으며, 이는 EMT가 유도되었음을 나타냅니다. 또한, 5 49 T 98 G 및 MCF 10 A 세포에서 빨간색의 달팽이와 녹색의 menton의 상향 조절이 있었으며, CCF 7개의 인간 유방암 세포와 PanIN 인간 췌장암 세포는 모두 TGF 베타 신호전달만으로는 EMT에 진입하지 않는 것으로 보고되었습니다.

이러한 보고는 재조합 TGF 베타 1 단독으로 확인되었다. EMT 유도 배지 보충제 내 농도에서 세포는 상피 형태를 유지했으며 표면 E 일관성 수준은 대조군 세포와 유사했습니다. 대조적으로, EMT 유도 매체 보충제로 자극된 세포는 표면 E cadherin 수치가 급격히 감소하는 것을 보여주었습니다.

이 세포는 또한 더 많은 중간엽 형태를 얻었습니다. 중간엽 세포의 또 다른 특징은 이동 및 침입 능력입니다. 이는 96웰 BME 세포 침입 분석을 사용하여 분석되었습니다.

제조업체의 지침에 따르면, a 5 49 및 pan one 세포 모두에서 세포 이동의 현저한 증가가 관찰되었습니다. EMT 유도 후, 침습을 테스트하기 위해 기저막 추출물 코팅 필터로 동일한 분석을 수행했습니다. EMT 유도 세포는 처리되지 않은 세포에 비해 침입 능력이 크게 증가한 것으로 나타났습니다.

EMT의 강력한 유도는 이러한 세포에서 발생하는 유전자 발현 변화 및 신호 전달을 분석하는 데 유용합니다. MCF 7 및 5 49 세포의 용해물을 사용하는 상용 항체 기반 어레이를 사용하여 인산화된 MA 키나아제 패밀리 구성원의 수준을 분석했습니다. 두 세포 유형 모두 대조군에 비해 EMT 유도 세포에서 kreb irk 1 및 irk 2의 인산화가 증가한 것으로 나타났습니다.

A 5 49 세포는 또한 GSK 3 베타 인산화의 증가를 보여주었습니다. Mc 7 세포는 크렙 또는 1 및 DIRK 2의 인산화가 증가한 것 외에도 P 70 S 6 K 인산화가 증가된 것을 보여주었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 세포가 아닌 다른 세포 유형의 결과에 약간의 변동이 있을 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다.

EMT 유도에 동일한 다운스트림 경로를 사용하여 세포 유형 간 마커 발현에 차이를 유발합니다. 또한 EMT의 많은 마커는 엄격한 온/오프 상태를 보여주지 않으며 상피 세포의 기저 수치를 가질 수 있습니다. 이러한 마커는 이 절차에 따라 중간엽 전이 시 국소화의 증가 교환을 보여줄 수 있습니다.

약물 스크리닝과 같은 다른 방법은 어떤 화합물이 상피에서 중간엽으로의 전이를 조절할 수 있는지와 같은 추가 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 화합물은 암 및 섬유증 치료에 매우 유용할 수 있습니다.