Name: 간엽 전환을 유도하고 상피의 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 학습하세요 상피-간엽 전환(EMT) 유도 및 면역세포화학 분석법을 다양한 세포주에서. 이 방법은 암 전이 연구와 약물 스크리닝에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 도움이 토론과 원고 검토를 위해 줄리아 Hatler 마틴 Ramsden (R &amp; D 시스템)을 인정하고 싶습니다.

1. EMT 유도 <ol><li> 물을 욕조에 37 ° C 따뜻한 문화 미디어. 사용되는 배양 배지는 관심의 세포의 표준 배양에 사용되는 미디어와 동일합니다. 예를 들어, A549 인간 폐 암종 세포주는 10 % 소 태아 혈청 및 2mM의 글루타민 Kaighn의 F12에서 성장된다. </li><li> 해리 용액 (예를 들어 TrypLE 익스프레스)를 사용하여 그 수확 세포. </li><li> 15 ML 원뿔 튜브에 미리 예열 문화 매체에있는 세포를 일시 중단합니다. </li><li> 5 분 동안 400 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 폐기물 용기에 부어 뜨는을 제거합니다. </li><li> 예열 된 배양 배지에서 세포 펠렛을 중지. </li><li> 트리 판 블루를 사용하여 가능한 세포를 계산합니다. 세포 현탁액의 샘플을 제거하고, 0.4 % 트리 판 블루 용액으로 희석. 혈구에 희석 된 샘플의 10 μl를 놓고 가능한 세포 (파란색 설정하지 않는 세포)를 계산합니다. 셀 D를 결정하는 세포 수를 사용솔루션의 ensity. </li><li> 조직 문화 위에 플레이트 세포는 cm 2 당 0.9-1.0 × 10 4 세포를 플레이트 또는 플라스크를 처리. 예를 들어, 0.5 × 10 6 세포는 1X EMT 유도하는 미디어 보조 식품 (6 ㎖의 미디어 100mm 플레이트 당)를 포함하는 배지에서 100 mm 플레이트에 도금했다. </li><li> 문화는 37 ° C / 5 % CO 2 배양기에서 세포를 도금했다. 매일 세포 형태를 모니터링합니다. </li><li> 사흘 도금 후, 미디어를 제거하고 1X EMT 유도하는 미디어의 보충을 포함하는 신선한 예열 문화 용지로 교체합니다. 37 ° C / 5 % CO 2 배양기에서 배양을 계속합니다. </li><li> 닷새 도금 후, 세포 분석을위한 준비가되어 있습니다. 세포 형태는 거꾸로 빛을 현미경으로 시각화됩니다. </li></ol> 2. 면역 세포에 의해 단백질 발현 분석 <ol><li> 95 % 에탄올을 포함하는 배양 접시에 커버 슬립을 배치하여 24 - 웰 플레이트에 살균 12mm 커버 슬립을 준비합니다. 조심스럽게 우리 에탄올에서 커버 슬립을 제거바늘과 곡선 집게와 화염 소독을 보내고. 24 웰 플레이트 잘 하나에 멸균 커버 슬립을 놓습니다. 나머지 커버 슬립으로 반복합니다. </li><li> 1.7 - 1.1 절에 설명 된대로 세포 현탁액을 준비합니다. </li><li> 플레이트 1.6 × 10 4 세포 / 웰 0.5 ML 1X EMT 유도하는 미디어의 보충을 포함 예열 문화 미디어. </li><li> 성장과 섹션 1.9에 설명 된대로 세포를 공급 - 1.11. </li><li> 닷새 도금 후, 미디어를 제거하고 실온에서 20 분 동안 1X 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에 300 μL / 웰의 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정합니다. </li><li> 정착액을 제거하고 세포가 1X PBS 500 μL / 잘으로 2 배 헹군다. </li><li> 차단 완충액 400 μL / 웰에서 세포를 배양한다 실온에서 1 시간 동안 (1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 10 %의 정상 당나귀 혈청, 0.3 % 트리톤 X-100을 포함하는 1X PBS). </li><li> 제조업체에서 일차 항체에 품어 객실 temperatur를에서 3 시간 동안 버퍼를 차단하는 잘 개 / μL의 농도를 추천전자 또는 4 박 ° C에서 직접 형광 색소에 접합 차 항체를 사용하면, 어두운 곳에서 샘플을 배양한다. </li><li> 각 세척 5 분 동안 0.1 % BSA를 포함하는 1X PBS 500 μL / 잘 세포를 세 번 씻으십시오. 직접 형광 색소에 접합 차 항체를 사용하는 경우, 2.12 단계로 바로 진행한다. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 1 % BSA를 포함하는 1X PBS 400 μL / 웰의 제조업체에서 권장하는 농도 차 항체에 세포를 품어. </li><li> 각 세척 5 분 동안 0.1 % BSA를 포함하는 1X PBS 500 μL / 잘 세포를 세 번 씻으십시오. </li><li> 원하는 경우, DAPI 용액 핵 counterstain. </li><li> 탈 이온수에서 세포를 씻어 커버 슬립이 설치 미디어를 사용하여 슬라이드에 얼굴을 아래로 탑재합니다. </li></ol>

<ol><li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li>
<li>Thiery, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transitions+in+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression.</a> Nature Reviews Cancer. 2, 442-454 (2002).</li>
<li>Heuberger, J., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+of+cadherin-mediated+cell+adhesion+and+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Interplay of cadherin-mediated cell adhesion and canonical Wnt signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 1-23 (2010).</li>
<li>Onder, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+E-cadherin+promotes+metastasis+via+multiple+downstream+transcriptional+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways.</a> Cancer Research. 68, 3645-3654 (2008).</li>
<li>Tian, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin%2F%CE%B2-catenin+complex+and+the+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">E-cadherin/β-catenin complex and the epithelial barrier.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-6 (2011).</li>
<li>Scheel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+and+autocrine+signals+induce+and+maintain+mesenchymal+and+stem+cell+states+in+the+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Paracrine and autocrine signals induce and maintain mesenchymal and stem cell states in the breast.</a> Cell. 145, 926-940 (2011).</li>
<li>Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2-induced+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition.</a> Cell Research. 19, 156-172 (2009).</li>
<li>Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B21+induces+human+alveolar+epithelial+to+mesenchymal+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22EMT%29.+Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">TGF-β1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition.</a> EMT). Respiratory Research. 6, 56-70 (2005).</li>
<li>Miettinen, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+induced+transdifferentiation+of+mammary+epithelial+cells+to+mesenchymal+cells%3A+involvement+of+type+I+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TGF-β induced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells: involvement of type I receptors.</a> Journal of Cell Biology. 127, 2021-2036 (1994).</li>
<li>Pelton, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+genes+encoding+TGFs+%CE%B21%2C+%CE%B22%2C+and+%CE%B23+during+murine+palate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of genes encoding TGFs β1, β2, and β3 during murine palate formation.</a> Dev. Biol. 141, 456-460 (1990).</li>
<li>Taube, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core+epithelial-to-mesenchymal+transition+interactome+gene-expression+signature+is+associated+with+claudin-low+and+metaplastic+breast+cancer+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signature is associated with claudin-low and metaplastic breast cancer subtypes.</a> PNAS. 107, 15449-15454 (2010).</li>
<li>Roussos, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AACR+special+conference+on+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+progression+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">AACR special conference on epithelial-mesenchymal transition and cancer progression and treatment.</a> Cancer Research. 70, 7360-7364 (2010).</li>
<li>Polyak, K., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+between+epithelial+and+mesenchymal+states%3A+acquisition+of+malignant+and+stem+cell+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits.</a> Nature Reviews Cancer. 9, 265-273 (2009).</li>
<li>Brown, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+by+transforming+growth+factor-%CE%B21+of+epithelial+to+mesenchymal+transition+is+a+rare+event+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Induction by transforming growth factor-β1 of epithelial to mesenchymal transition is a rare event in vitro.</a> Breast Cancer Research. 6, 215-231 (2004).</li>
<li>De Falco, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+proteolysis+increases+CREB+phosphorylation+and+sustains+proliferation+of+thyroid+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CD44 proteolysis increases CREB phosphorylation and sustains proliferation of thyroid cancer cells.</a> Cancer Research. 72, 1449-1458 (2012).</li>
<li>Xie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Erk+pathway+is+required+for+TGF-%CE%B21-induced+EMT+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Activation of the Erk pathway is required for TGF-β1-induced EMT in vitro.</a> Neoplasia. 6, 603-610 (2004).</li>
<li>Bachelder, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+kinase-3+is+an+endogenous+inhibitor+of+Snail+transcription%3A+implication+for+the+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription: implication for the epithelial-mesenchymal transition.</a> Journal of Cell Biology. 168, 29-33 (2005).</li>
<li>Pon, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p70+S6+kinase+promotes+epithelial+to+mesenchymal+transition+through+Snail+induction+in+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells.</a> Cancer Research. 68, 6524-6532 (2008).</li>
<li>Wegner, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+changes+in+receptor+tyrosine+kinase+phosphorylation+using+antibody+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
</ol>

R &amp; D 시스템, 주식 회사는 비영리, 공공 회사입니다. 이 문서에 대한 생산 및 무료 액세스는 R &amp; D 시스템, 주식 회사에 의해 후원

EMT 유도에 대한 이전의 방법은 일반적으로 TGF-β 자극 또는 유전자 조작을 사용했습니다. 단독으로 TGF-β는 일부 세포 유형에서 EMT를 유도하는 것으로 하였지만, 지금은 TGF-β가 EMT에 필요한 것을 설명 하였지만, 이는 모든 세포 유형 6,14에 충분하지 않다. EMT 유도를 위해 유전자 조작을 사용하면 시간과 노동 집약적이다. 여기서 설명한 방법은 항 - 인간 E-카드 헤린, 항 인간 sFRP-1, 항 인간 DKK-1, 재조합 인간로 Wnt-5A하여 확실 EMT를 유도하는 재조합 인간 TGF-β1 등 요인의 조합을 사용한다. 요소의 조합은 E-카드 헤린 계 접착 EMT 유도 사를위한 중요한 단계를 차단하도록 설계로 Wnt-5A 단백질을 추가 할뿐만 아니라 Wnt의 억제제로 차단하는 항체를 이용하여 Wnt의 시그널링을 보강하고, sFRP-1 DKK -1. 로 Wnt 및 TGF-β 신호가 중간 엽 세포의 합계를 유도하고 유지하기 위해 분비 루프에서 역할을하는 것으로 나타났다전자 6. 이 유도 방식은 유전자 조작을 방지하고 혼자 TGF-β를 사용하는 것보다 더 효과적입니다. 중요한 사실은, 우리는 이전에 (그림 5) 14 TGF-β 자극에만 반응하지 않는 것으로 나타났다 MCF7 및 PANC-1 세포를 포함한 세포 유형에 EMT의 유도를 관찰 할 수 있습니다. EMT 유도하는 미디어 보충 쇼 이하 소형 증가 스핀들 모양의 형태 (그림 1)로 처리 된 세포. 또한 EMT (도 2 및도 3)의 특징입니다 피브로넥틴 발현의 증가와 함께 표면 E-cadherin의 동시 발현의 감소가있다. 이러한 멘틴과 달팽이 등의 추가 중간 엽 마커는 uninduced 컨트롤에 비해 EMT 유도 세포 (그림 4)에서 상향 조절된다. 향상된 이주 및 침윤 능력은 중간 엽 세포의 주요 기능적 특성이다. 체외에서 </em&gt; 마이그레이션 및 침입 분석은 EMT 유도하는 미디어의 보충으로 처리 된 세포는 (그림 6)를 마이그레이션하고 침략 크게 증가 능력을 보여 주었다. 그림 7과 같이 항체 어레이 발현 데이터를 사용하여 설명 된대로 EMT 유도를위한이 간단한 방법은 EMT 신호의 연구에 유용합니다. 상이한 세포 유형은 인산화 된 CREB의 증가 및 MCF7 및 A549의 EMT-유도 된 세포 모두에서 볼 ERK1 / 2와 EMT와 연관된 일반적인 식 서명을 구하는 전후 EMT 유도를 비교할 수있다. CREB의 S133 인산화 바인딩 DNA를 자극하고 TGF-β1에 의한 EMT (15)의 하류 행동을 보였다. ERK1 / 2의 인산화는 TGF-β1에 의한 EMT (16)의 하류 행동을 보였다. p70S6 대 A549 세포에서 GSK-3β 인산화의 증가와 같이 세포 유형 사이에서 신호 전달 경로의 차이도 설명 될 수있다MCF7에서 K 인산화. 세린 9에서 GSK-3β 인산화는 기능을 감소하고, GSK-3β는 프로 EMT 전사 인자, 달팽이 17을 억제하기 위해 표시되었습니다. 반면, p70S6K 달팽이 활동을 유도하고 인산화는이 단백질 18의 활성화와 연결되어 있습니다. 전반적으로, 특히 이전에 단독으로 TGF-β에 응답하지 않는 같이 세포 EMT의 간단하고 신뢰할 수있는 유도, EMT의 생물학을 이해 예후 마커로 사용하기 위해 일반적인 표현의 서명을 확인하고, 암에 대한 새로운 치료제를 개발하고 평가하는 데 유용합니다 및 섬유 성 질병.

중간 엽 전이 (EMT)에 상피는 편광 상피 세포는 높은 운동성, 섬유 아세포와 같은 중간 엽 세포의 결과로 다양한 변화를 겪게되는 과정이다. 이 프로세스는 마이그레이션 침공 증가 능력으로 인해, 유전자 발현 변화하고있는 adherens 접속점의 분해를 통해 부분적으로 발생한다. 생리 학적으로, EMT는 배아 발달과 상처 치유 동안 중요한 역할을한다. EMT에 적절한 제어의 손실 섬유증 및 암 1,2의 전이로 이어질 수 있습니다. 상피 세포의 표면 상에 E-카드 헤린의 감소는 EMT 3,4 통해 셀의 진행에 중요한 단계이다. E-카드 헤린 직접 인접 셀에 카데 단백질과 상호 작용하는 단일 통과 막 횡단 단백질이다. 세포 접착의 역할뿐만 아니라, E-cadherin의 영향을 세포 E-카데 린의 세포질 꼬리 사이의 상호 작용을 통해 신호규제 단백질의 다 다양한, 특히 β-catenin의. β-catenin의가있는 adherens 접속점의 안정화에 중요한 역할을한다. 정규 Wnt 신호 동안, β-catenin의는 E-cadherin의에서 해제하고이 Wnt 경로의 3,4,5의 하류 전사 인자 역할을하는 핵 옭. 핵에서 β-catenin이는 트위스트, 민달팽이, 피브로넥틴, 및 매트릭스 메탈로 3,6의 다양한 포함한 여러 EMT 관련 요인의 전사를 증가시킨다. Wnts 이외에, TGF-β 시그널링은 정상적인 발달 과정 및 질병 상태 모두에서 7,8,9 EMT 유도에 중요한 역할을하는 것으로 밝혀졌다. TGF-β는 구개 형성 과정과 개발 중심 (10)에서 발생하는 EMT에 참여하고있다. 또한 섬유증과 전이 7 암의 진행에 연루되어있다. 홍보는 여기에 설명 된 절차ovides 유전자 조작 없이도 세포 유형의 다양한 EMT의 일관된 유도. 이 절차는 E-cadherin의의 칵테일을 사용 sFRP-1 및 DKK-1 차단 항체로 Wnt-5a 및 TGF-β1 재조합 단백질. 이 칵테일은 Wnt의 및 TGF-β 신호를 강화하면서 E-cadherin의 기반 접착을 차단하도록 설계되어 있습니다. 강력한 EMT 유도하는 능력은이 과정의 생물학 방법과 치료 목적으로이를 조작하는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. EMT의 보통주 현재 마커, E-cadherin의 (EMT에서 하향 조절) 및 (EMT 상향 조절) 멘틴은 암에서 공동으로 표현을 발견 할 수 있으며, 따라서 잠재적 전이성 셀 (12)의 최적의 진단 마커를 제공하지 않습니다. 중요한 것은, EMT를 겪은 세포 유형의 다양한 분석은 암 및 섬유증 11에서 진단 목적으로 이용 될 수있는 공통 유전자 발현 서명을 개발하는 것이 유용하다. 또한, 최근의 연구가 보여준 그 EMT는 EMT를받은 세포는 이러한 세포 13를 표적 수있는 화합물을 확인하는 약물 스크리닝에 유용 할 수 있다는 것을 시사 암 줄기 세포의 형성에 역할을 할 수있다.

<table><tbody><tr>우리가 테스트한 관심 <td></td><td></td><td>상피 세포</td><td>: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7 및 PANC1</td></tr><tr><td>EMT 유도 매체 보충제</td><td>R& D 시스템</td><td>CCM017</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 TGF-&#946; 1</td><td>R& D Systems</td><td>240-B</td><td>는 10ng / ml</td></tr><tr><td>Anti-E-Cadherin NL557 복합 항체</td><td>R&에 사용됩니다. D 시스템</td><td>NL648R</td><td>은 면역세포화학을 위해 1:10 희석으로 사용됩니다</td></tr>.<tr><td> </td><td> D 시스템</td><td>MAB1838</td><td>0.1 &mu에서 사용됩니다. 웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>안티 Fibronectin</td><td>R & D Systems</td><td>MAB1918</td><td>10 &mu에서 사용됩니다. 면역세포화학의 경우 g/ml; 0.5 &mu에서 사용됩니다. 웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td> R&를 위한 g/ml<td>; D Systems</td><td>AF5718</td><td>0.2 &mu에서 사용됨; 웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 NL493 2차 항체</td> R&를 위한 g/ml<td>; D Systems</td><td>NL009</td><td>면역세포화학을 위해 1:200 희석으로 사용</td></tr><tr><td>당나귀 안티 염소 HRP 2차 항체</td><td>R& D Systems</td><td>HAF109</td><td>1:2000에 웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 HRP 2차 항체</td><td>R& D Systems</td><td>HAF007</td> 웨스턴 블로팅 EMT 3색 면역세포화학 키트 R&<td>에 1:2000에 사용됨</td></tr><tr><td></td><td> D Systems</td><td>SC026</td><td>제조업체에 따라 사용됨' s 지침. 이 키트에는 E-cadherin, Vimentin 및 Snail에 대한 직접 접합 항체가 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>96 웰 BME 세포 침입 분석</td><td>R& D Systems</td><td>3455-096-K</td><td>이 키트는 제조업체의 권장 사항에 따라 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>프로테옴 프로파일러 Human Phospho-MAPK Array Kit</td><td>R& D Systems</td><td>ARY002B</td><td>이 키트는 제조업체의 권장 사항에 따라 사용되었습니다19.</td></tr><tr><td>마운팅 미디어</td><td>R& D Systems</td><td>CTS011</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 트리판 블루 솔루션</td><td>Life Technologies</td><td>15350-061</td><td></td></tr><tr><td>1X 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>95% 에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>노멀 당나귀 혈청</td><td>Jackson Labs</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Roche Molecular Biochemicals</td><td>789-704</td>를 <td>1X PBS에 희석하여 10% 원액을 만들고,</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>P6148</td>을 <td>1X PBS에 4% 작업 농도로 희석합니다.</td></tr><tr><td>DAPI 솔루션</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>물에 용해하여 14.3mM의 원액을 만듭니다. 작업 솔루션은 1X PBS에서 스톡 용액을 1:5000 희석하는 것입니다.</td></tr><tr><td>세밀한 곡선 겸자</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>12mm 커버슬립</td><td>Carolina Biological</td><td>633009</td><td></td></tr><tr><td>무지방 분유</td><td></td><td></td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20]</td><td></td><td></td><td>웨스턴 블로팅 차단 및 세척</td></tr>용 <tr><td>PVDF 멤브레인</td><td></td><td></td><td>웨스턴 블로팅용 </td></tr><tr><td>4-20% SDS-page 젤</td><td></td><td></td><td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>ECL 기질</td><td></td><td></td>용 <td>웨스턴 블로팅</td></tr><tr><td>15ml 코니컬 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr>용 <tr><td>플레이트/플라스크, 조직 배양 처리된</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24웰 플레이트, 조직 배양 처리된</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫/피펫 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>피펫 보조제 / 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C 수조</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C/5%CO2 인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>도립광 현미경</td> 형광 현미경 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

중간 엽 전이 (EMT)로 상피를 개발하는 동안 적절한 형태 형성에 필수적이다. 이 과정의 Misregulation 섬유증의 주요 이벤트 및 전이 상태로 암의 진행으로 연루되어있다. EMT 기초가되는 과정을 이해하는 것은 조기 진단과 이러한 질병 상태의 임상 제어를 위해 필수적입니다. 체외 EMT 신뢰성 유도 진단용 공통 유전자 발현 서명을 확인하는 유용한 약물 발견을위한 도구 등이다. 여기에서 우리는 세포 유형의 다양한 EMT의 유도에 대한 간단한 방법을 설명한다. 세포 면역 세포에 의해 사전 및 사후 EMT 유도의 분석을위한 방법도 포함되어 있습니다. 또한, 우리는 항체 기반의 배열 분석 및 마이그레이션 / 침입 분석을 통해이 방법의 효과를 보여줍니다.

. T98G의 아교 모세포종 세포 HT29 결장 선암 세포 : 기재 EMT 유도 배양 조건은 세포 종류의 다양한 EMT의 유도를위한 강력한 방법을 제공하는 것은 (1)과 (2)가 서로 다른 4 개의 인간 세포주의 형태학 및 마커의 발현 수준을 입증 피규어 , A549 폐 암종 세포 및 MCF10A 유방 상피 세포. 중간 엽, 스핀들 모양의 형태 (- 1H도 1E)에 - EMT 유도하는 미디어의 보충으로 치료받은 세포는 고전 상피 형태 (1D도 1a)로 변경되었습니다. EMT-유도 된 세포는 uninduced 세포에 비해 덜 조밀하게 꽉 식민지로 포장 나타났다. Uninduced MCF10A 샘플은 더 느슨하게 포장 세포에 의해 둘러싸여 단단히 포장 된 클러스터를 포함. 이 단단히 포장 된 클러스터 (그림 2D) E-cadherin의 긍정적이었고, EMT 유도하는 미디어 보록과 치료에 사라졌다장담 (그림 2H). EMT는 상피 마커와 중간 엽 마커의 상향 조절의 하향 조절에 의해 평가되었다. E-cadherin의 발현의 하향 조절은 일반적으로 서로 다른 세포 유형 3,4에 EMT 유도를 다음 관찰 2는 처리되지 않은 세포의 대부분 (그림 2A - 2D, 빨간색)에서 E-cadherin의 표면 발현을 보여줍니다 그림. 후 그것의 휴무에 비해 EMT 유도 (그림 2E - 하반기, 빨간색). 하나의 셀 라인, T98G는 이전의 분석을 배제 EMT 유도에 E-cadherin의의 매우 낮은 기저 수준이 밝혀졌다. 중간 엽 마커, 피브로넥틴의 상향 조절은 EMT 유도하는 미디어 보조 식품 (, 녹색 - - 2D도 2E 대 하반기도 2a)와 유도 후도 볼 수 있었다. E-카드 헤린 및 피브로넥틴의 발현 정도는 면역 세포 화학에 의해 본또한 전체 세포 용 해물의 서쪽 블로 팅 (그림 3)을 통해 확인되었다. 서양 얼룩은 E-cadherin의 및 면역 세포 화학 볼 피브로넥틴 표현의 상향 조절의 하향 조절을 확인했다. 밴드는 EMT 유도 다음 상대 배의 변화를 결정하는 농도계 및 GAPDH로 표준화를 사용하여 정량 하였다. E-cadherin의 레벨은 각각 A549 및 MCF10A 세포에서 6.4 및 3.4 배 감소 하였다. 피브로넥틴 수준은 각각 4.1를 4.6 증가, 2.3 T98G의 배, A549 및 MCF10A 세포했다. 서쪽 오점이 HT29 세포 포스트 EMT 유도에서 E-cadherin의 단백질 수준의 상당한 감소를 보여주지 않지만, 면역 세포 화학의 결과는 구별 할 수없는 E-cadherin의 (2 층 대 그림 2B)의 표면 발현의 감소를 보여 주 전체 세포 용 해물의 웨스턴 블로 팅. 더 EMT 상태, 추가로 알려진 마커를 평가하기 위해EMT 용의가 사전 및 사후 EMT 유도 분석 하였다. 이전 결과와 일치, E-cadherin의는 EMT이 유도되었음을 나타내는, 검사의 모든 세포 라인에서 하향 조절했다. 또한, 중간 엽 마커, 멘틴과 달팽이는 EMT 유도하는 미디어 보충 치료 (그림 4) 다음과 같은 A549, T98G, 및 MCF10A 세포에서 발현이 증가되었다. HT29 세포주는 이들 세포가 EMT 유도에 대한 대체 경로를 이용할 것을 나타낼 수있는 (데이터는 미도시)와 함께 또는 EMT 유도 있거나없는 이러한 간충직 마커의 발현을 보여주지 않았다. TGF-β가 특정 셀에 EMT를 유도하기에 충분 7,8,9을 컨텍스트들이지만, 다른 종류의 세포가 TGF-β (14)의 추가에 전적으로 응답하지 않습니다. MCF7 인간 유방암 세포 및 PANC-1 인간 췌장 암종 세포는 모두 단독으로 23 시그널링 TGF-β에 응답하지보고된다. 두 라인이 vitr에서 EMT을받을 수 있는지 여부를 확인하려면오, 세포 EMT 유도하는 미디어 보충의 면전에서 배양 하였다. 세포 EMT 유도하는 미디어 보충 내의 농도에서 혼자 재조합 TGF-β1 자극했다. 이러한 세포는 대조군 세포에서 본 것과 유사한 단단히 포장 세포의 콜로니 (데이터 미도시) 및 표면 E-카드 헤린 레벨 하였다 이루어진 그들의 상피 형태를 유지 (도 5C 및 5D도 5a 대 및 5B). 반면, EMT 유도하는 미디어 보충 자극 세포는 표면에 E-cadherin의 수준의 급격한 감소 (그림 5E 및 5 층)을 보여 주었다. 세포가 적은 컴팩트되었고 더 스핀들 조 (데이터는 도시되지 않음)로 이들 세포는 또한, 더 간엽 형태를 획득. 이러한 결과는 여기에 설명 된 EMT 유도 방법은 EMT의 형태와 TGF-β-I에 일반적으로 저항하는 세포 마커의 발현 변화를 촉진 할 수 있다는 것을 보여nduced EMT. 마커 발현의 변화에​​ 더하여, 중간 엽 세포의 또 다른 특징은 이주 및 침입하는 능력이다. 마이그레이션 및 제조업체의 지침에 따라 96 잘 BME 셀 침공 분석을 사용하여 분석 하였다 또는 EMT 유도하는 미디어의 보충없이 배양 된 세포의 침공. 간단히, 세포는 8.0 μm의 기공 필터 삽입을 포함 (50,000 세포 / 웰) 96 - 웰 플레이트에 접종 하였다. 48 시간 후, 마이그레이션은 필터를 통해 마이그레이션 한 세포의 AM 염색을 칼 세인에 의해 평가되었다. 각 샘플은 유사한 결과로 두 번 중으로 테스트되었습니다. 한 실험에서 대표 결과는 그림 6a에 표시됩니다. 세포 이동에 통계적으로 유의 한 증가 (P-값 &lt;0.003) EMT 유도 다음 두 A549과 PANC-1 세포를 볼 수 있었다. (즉, 세포 외 매트릭스와 마이그레이션)에 침입하는 이러한 세포의 능력을 평가하기 위해 동일한 분석했다지하 막 추출물 코팅 필터를 수행. EMT-유도 된 세포는도 6b에서와 같이 처리되지 않은 세포에 비해 침윤 기능에 통계적으로 유의 한 (P-값 &lt;0.001) 증가 하였다. EMT의 강력한 유도는 이들 세포에서 일어나는 유전자 발현의 변화와 신호의 분석에 유용합니다. 치료 및 치료 모두에서 세포 용 해물을 사용하여 항체 기반 어레이 분석은 단일 샘플에 다양한 분자의 발현을 분석하기위한 하나의 방법이다. 예를 들어, 우리는 유엔 유도 및 프로테옴 프로파일 인간의 인산화 MAPK 어레이 키트를 사용 MCF7 및 A549 세포 EMT 유도에서 해물의 인산화 MAPK의 가족 구성원의 수준을 분석했다. 배열이 유사한 결과를 독립적 인 EMT 유도 치료에서 두 번 실행되었다. 7 하나의 배열 대표 데이터를 보여줍니다. 두 종류의 세포가 CREB ​​(S133)의 인산화 증가를 전시, ERK1 (T2<html> 02/Y204)와 EMT-유도 된 세포에서 ERK2 (T185/Y187는) 컨트롤에 비교했다. 신호 이벤트의 차이가 아니라 두 종류의 세포 사이에서 관찰되었다. MCF7 세포를 증가 p70S6K (T421/S424) 인산화를 보인 반면, A549 세포, GSK-3 β (S9) 인산화의 증가를 보였다. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig1highres.jpg" fo:width="6in"/> 그림 1. EMT 유도하는 미디어 보충과 자극 후 중간 엽 형태의 유도 (A - D). 네 종류의 세포에서 상피 형태는 EMT 유도하는 미디어의 보충없이 표준 배양 배지에서 5 일 동안 문화를 다음 표시 (E - H).에있는 중간 엽 형태 네 종류의 세포는 5 일 동안 EMT 유도하는 미디어 보충 배양 지적했다. NT &quot;FO : 유지 - together.within 페이지 =&quot;항상 &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2.jpg" alt="그림 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig2highres.jpg" fo:width="6in"/> 그림 2. 상피 마커 발현과 EMT-유도 세포에서 간엽 마커 발현의 상향 조절의 하향 조절은. 세포는 상피 마커, E-카드 헤린 (레드)의 발현을 검출하기 위해 면역 형광에 의해 염색하고, 간엽 마커, 피브로넥틴 (그린). (A - D) 5 일 동안 EMT 유도하는 미디어의 보충없이 배양 제어 세포 (E -. H) 5 일 동안 EMT 유도하는 미디어 보충 배양 세포. 모든 세포는 DAPI (파란색)와 대조된다. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 서양 얼룩의 상피와 중간 엽 마커의 발현 확인<html> . (-) 5 일 동안 EMT 유도하는 미디어 보충 네 종류의 세포의 총 세포 용 해물의 alysis 웨스턴 블롯은 (EMT)와 함께 또는없이 처리, 표시. 왼쪽에 표시된 E-cadherin의, 피브로넥틴 및 GAPDH 부하 제어를위한 밴드입니다. 오른쪽에 표시된 크기 마커입니다. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 간엽 마커, EMT-유도 세포에서 멘틴 달팽이 상향 조절은. 세포는 상피 마커, E-카드 헤린 (그레이)의 발현을 검출하는 다색 면역 형광에 의해 염색하고, 간엽 마커, 비 멘틴 (그린) 및 달팽이 (레드) . (A - C) 5 일 동안 EMT 유도하는 미디어의 보충없이 배양 제어 세포. (D - F) 5 일 동안 EMT 유도하는 미디어 보충 배양 세포. 법이지 &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5.jpg" alt="그림 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50478/50478fig5highres.jpg" fo:width="6in"/> 그림 5. 5 일 동안 TGF-β1의 10 겨 / ㎖를 포함하는 배지에서 배양 5 일 동안 형 미디어 배양 TGF-β1 응답하지 않는 세포에서 EMT 유도. (A와 B) 세포. (C와 D) 세포. (E 5 일 EMT 유도하는 미디어 보충 배양 F) 세포. 모든 세포는 E-cadherin의 발현 (적색)에 염색 DAPI (파란색)와 대조된다. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig6.jpg" alt="그림 6"/> 그림 6. EMT-유도 세포 이동과 침윤 용량을 증가하고있다. 48 시간 동안 배양 한 후 8 μm의 기공 필터를 통해 마이그레이션 세포의 A. 평균 수. B. 평균 수48 시간 동안 배양 한 후 지하 막 추출물로 코팅 8 μm의 기공 필터를 통해 침입 할 수 있었다 세포. 오차 막대 3 우물에 표준 편차를 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/50478/50478fig7.jpg" alt="그림 7"/> EMT 유도의 그림 7. 항체 기반의 배열 발현 분석. A549 (A 및 C)에서의 용 해물과 함께 또는 EMT 유도하는 프레스 보충없이 배양 MCF7 (B 및 D) 세포는 인간 프로테옴 프로파일 인산화 MAPK 어레이 키트를 사용하여 어레이 분석에 사용 하였다. 반점은 강조하고 B는 다음 농도계를 사용하여 정량 하였다. 유엔 유도하는 EMT 유도 해물의 비교는 (C와 D) 아래에 해당하는 막대 그래프에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50478/50478fig7large.jpg" target="_blank">큰 그림을 &lt;보려면 여기를 클릭하십시오</a>/&gt;.

간단한 방법은 세포 유형의 다양한 중간 엽 전이 (EMT)에 상피의 유도에 대해 설명한다. 면역 세포에 의한 EMT 상태에있는 세포의 분석 방법이 포함되어 있습니다.

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

이 절차의 전반적인 목표는 인비트로(in vitro)에서 상피-간엽 이행 또는 EMT를 유도하기 위한 간단하고 재현 가능한 방법을 제공하는 것입니다. 이는 먼저 관심 있는 상피 세포 유형을 EMT 유도 배지 보충제가 포함된 상태에서 플레이팅함으로써 수행됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 최초 플레이팅 3일 후, 배양 배지를 EMT 유도 배지 보충제가 포함된 신선한 배양 배지로 교체하는 것입니다.마지막 단계는 면역 염색과 같은 후속 특성 분석을 위해 초기 도말 5일 후에 세포를 회수하는 것입니다. 최종적으로, 광학 현미경, 면역 세포 화학, western blood 분석 어레이 또는 선택한 다른 분석 절차를 통해 세포가 중간엽 특성을 획득했음을 확인할 수 있습니다. TGF beta 자극이나 유전자 변형과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 유전자 변형과 달리 빠르고 간편하며, TGF beta 자극에만으로는 반응하지 않을 수 있는 다양한 세포 유형에서 EMT 유도를 가능하게 한다는 점입니다.이 기술의 함의는 암 전이의 치료 및 진단으로 확장됩니다. 이 기술을 통해 연구자들은 진단에 활용될 수 있는 전이 세포의 공통 발현 시그니처를 개발할 수 있습니다. 또한, 약물 스크리닝에 사용할 수 있는 세포를 제공합니다.먼저 항온수조를 사용하여 대상 세포의 배양 배지를 37 °C로 가온합니다. 다음으로, Triple E Express와 같은 해리 용액을 사용하여 세포를 수확합니다. 그 후, 15 mL 원뿔형 튜브에 미리 가온된 배양 배지를 넣고 세포를 부유시킨 다음, 세포 현탁액을 400 ×g에서 5분간 원심 분리합니다.상층액을 폐기물 용기에 조심스럽게 따라내어 제거하고, 세포 펠릿을 미리 데워둔 배양 배지에 현탁합니다. 이제 생존 세포 수를 측정하기 위해 세포 현탁액 샘플을 0.4% Tripan blue 용액으로 희석합니다. 희석된 샘플 10 µL를 혈구계수기(hemocytometer)에 접종하고 생존 세포 수를 측정합니다.생존 세포. 용액 플레이트의 세포 밀도를 계산한 후 파란색으로 변하지 않습니다. 1X EMT 유도 배지 보충제가 포함된 예열된 배양 배지에서 cm²당 9,000~10,000개의 세포를 조직 배양 처리된 플레이트 또는 플라스크 배양에 사용합니다.플레이팅된 세포를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 배양하며 도립 광학 현미경을 사용하여 매일 형태를 관찰합니다. 3일 후, 배지를 1X EMT 유도 배지 보충제가 포함된 신선하게 예열된 배양 배지로 교체합니다. 플레이팅 5일 후에 세포를 분석할 수 있습니다.도립 광학 현미경으로 세포의 형태를 관찰합니다. 이제 세포를 고정하거나 수확하여 후속 연구에 사용할 수 있습니다. 95% ethanol이 담긴 페트리 접시에 커버슬립을 넣어 24웰 플레이트용 멸균 12 millimeter 커버슬립을 준비합니다. 곡선 핀셋을 사용하여 ethanol에서 커버슬립을 조심스럽게 꺼냅니다.화염 멸균한 각 커버슬립을 24웰 플레이트의 웰 하나에 옮깁니다. 커버슬립을 다룰 때는 주의와 숙련이 필요합니다. 다음으로 1X EMT 유도 배지가 포함된 0.5 milliliters의 예열된 배양 배지를 추가합니다. 세포에 보충물을 첨가하고 웰당 16,000 cells의 세포를 분주합니다.이제 이전에 설명한 대로 세포를 배양하고 먹이를 줍니다. 세포를 플레이팅한 5일 후, 배지를 제거하고 웰당 300 microliters의 4% Paraform aldehyde(1X PBS에 희석)를 사용하여 고정하며, 실온에서 20분 동안 고정 과정을 진행합니다. 그 후 고정액을 제거하고 웰당 500 microliters의 1X PBS로 세포를 두 번 헹굽니다.다음으로, 고정된 세포를 웰당 400 µL의 블로킹 버퍼에 넣고 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 블로킹 처리 후, 제조사 권장 농도에 따라 웰당 400 µL의 블로킹 버퍼로 1차 항체를 준비합니다. 그런 다음 웰에서 블로킹 용액을 제거하고 세포에 항체 혼합액을 첨가합니다.세포를 상온에서 3시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 1차 항체가 형광색소에 직접 접합된 경우에는 암소에서 배양하십시오. 다음으로, 1차 항체를 제거하고 0.1% BSA가 포함된 1X PBS 500 µL/well을 사용하여 웰을 3회 세척합니다. 각 세척 과정은 5분 동안 진행하며, 필요한 경우 세포가 빛에 노출되지 않도록 차단하십시오.이제 필요한 경우, 제조사에서 권장하는 농도의 2차 항체에서 세포를 배양합니다. 1% BSA가 포함된 1X PBS 400 µL를 각 웰에 넣어 항체를 희석합니다. 빛을 차단한 상태로 실온에서 1시간 동안 배양합니다.1차 항체를 제거했을 때와 동일하게 세포를 세 번 세척합니다. 필요한 경우, 세포에 DPI 대조 염색을 수행합니다. 마지막으로, 세포를 탈이온수로 헹구고 마운팅 매질을 사용하여 커버슬립을 슬라이드 위에 뒤집어 마운팅합니다.다시 한번, 커버슬립을 다룰 때 주의하십시오. EMT 유도 배양 조건은 다양한 세포 유형에서 EMT를 유도하는 강력한 방법을 제공합니다. 이는 네 가지 서로 다른 인간 세포주에서 테스트되었습니다.EMT 유도 배지 보충제로 처리한 세포는 전형적인 상피 세포 형태에서 중간엽 방추형 형태로 변화했습니다. e cadherin 및 fibronectin 발현에 대한 이중 염색 결과, 적색으로 표시된 상피 마커 e cadherin의 발현은 감소하고 녹색으로 표시된 중간엽 마커 fibronectin의 발현은 증가한 것으로 나타났습니다. 유도되지 않은 CF 10 A 샘플은 더 느슨하게 배치된 세포들에 둘러싸인 조밀하게 뭉쳐진 클러스터를 포함하고 있었습니다. 이러한 클러스터들은 적색으로 표시된 E could herein 양성 반응을 보였습니다.EMT 유도 배지 보충제를 처리하자 클러스터들이 사라졌습니다. 이는 녹색으로 표시된 fibronectin 발현의 증가와 일치했습니다. T 98.EMT 유도를 하기 전 G에서 terrin의 기저 수준이 매우 낮게 나타나 분석이 불가능했습니다. 그러나 fibronectin 마커를 통해, 이 세포들에서 EMT 유도 시 fibronectin 수준이 유의미하게 증가함을 확인하였습니다. e-cadherin과 fibronectin의 발현 수준은 전체 세포 용해물의 western blotting을 통해 추가로 확인되었습니다.웨스턴 블롯 결과에서는 HT 29 세포의 전체 EAD herrin 단백질 수준이 유의하게 감소하지 않았으나, 면역화학 분석을 통해 표면 발현의 감소가 확인되었습니다. EMT 상태를 추가로 평가하기 위해, EMT의 특징적인 중간엽 마커인 menton(녹색)과 snail(적색)을 EMT 유도 전후로 분석하였으며, 이는 이전 결과와 일치했습니다. 모든 조사 대상 세포주에서 gray 색상의 Eki herein이 하향 조절되어 EMT가 유도되었음을 나타냈습니다. 또한, 5 49 T 98 G 및 MCF 10 A 세포에서 snail(적색)과 menton(녹색)의 상향 조절이 관찰되었습니다. CCF seven 인간 유방암 세포와 PanIN 인간 췌장암 세포는 TGF beta 신호 전달만으로는 EMT가 유도되지 않는 것으로 보고되었습니다.이러한 보고 내용은 재조합 TGF beta one 단독 처리를 통해 확인되었습니다. EMT 유도 배지 보충제에 포함된 농도에서 세포들은 상피 세포의 형태를 유지하였으며, 표면 E-cadherin 수준은 대조군 세포와 유사했습니다. 반면, EMT 유도 배지 보충제로 자극된 세포들은 표면 E-cadherin 수준이 급격히 감소하는 모습을 보였습니다.이 세포들은 또한 더욱 중간엽 세포와 유사한 형태를 나타냈습니다. 중간엽 세포의 또 다른 특징은 이동 및 침습 능력입니다. 이는 96-well BME 세포 침습 분석법을 사용하여 분석되었습니다.제조사의 지침에 따르면, 5 49 및 pan one 세포 모두에서 세포 이동의 유의미한 증가가 관찰되었습니다. EMT 유도 후, 침습 능력을 테스트하기 위해 기저막 추출물(basement membrane extract)이 코팅된 필터를 사용하여 동일한 분석을 수행하였습니다. EMT가 유도된 세포는 처리되지 않은 세포에 비해 침습 능력이 유의미하게 증가한 것으로 나타났습니다.EMT의 강력한 유도는 이러한 세포에서 일어나는 유전자 발현 변화 및 신호 전달 분석에 유용합니다. MCF seven 및 5 49 세포의 용해물을 이용한 상용 항체 기반 어레이를 사용하여 인산화된 MA kinase 패밀리 구성원의 수준을 분석하였습니다. 두 세포 유형 모두 대조군과 비교하여 EMT가 유도된 세포에서 kreb irk one 및 irk two의 인산화가 증가한 것으로 나타났습니다.A 5 49 세포 또한 GSK three beta 인산화의 증가를 나타냈습니다. Mc seven 세포는 kreb or one 및 DIRK two의 인산화 증가와 더불어 P 70 S six K 인산화의 증가를 보였습니다. 이 절차를 수행할 때, 모든 세포가 아닌 서로 다른 세포 유형에 따라 결과에 일부 변동성이 있을 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다.우리는 세포 유형 간의 마커 발현 차이를 유발하는 EMT 유도를 위해 동일한 하위 경로를 사용합니다. 또한, 많은 EMT 마커들은 엄격한 온/오프 상태를 보이지 않으며 상피 세포에서 기저 수준으로 존재할 수 있습니다. 이러한 마커들은 본 절차에 따른 중간엽 전이 시 국소화의 상호 교환 증가를 보일 수 있습니다.약물 스크리닝과 같은 다른 방법들을 사용하여 어떤 화합물이 상피-간엽 이행(epithelial to mesenchymal transition)을 조절할 수 있는지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 찾을 수 있습니다. 이러한 화합물들은 암 및 섬유증 치료에 매우 유용할 수 있습니다.

induction-and-analysis-of-epithelial-to-mesenchymal-transition

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

선택적 접합 조절은 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에서 필수적인 세포 프로그램인 상피-중간엽 전이(EMT)에 기여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서는 EMT 중 선택적 접합을 감지하기 위해 유도 가능한 EMT 모델을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

상피 - 간엽 전환시 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 검출

여기에서는 상피-중간엽 전이를 거친 중간엽 세포에서 수축 기능을 평가하기 위한 겔 수축 분석법의 개발 및 적용에 대해 설명합니다.

개발<em&gt; 체외</em&gt; 분석은 중간 엽 세포를 시행 한 상피 - 중간 엽 전환의 수축 기능을 평가하는

상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)는 암이 침습적이 될 수 있도록 합니다. EMT를 조사하기 위해 혈청과 효소가 없는 신경줄기세포(NSC) 기반 체외 모델을 설명합니다. 이 표준화된 시스템을 통해 세포 이동, 유전자 및 단백질 발현에 대한 정량적 및 정성적 평가를 수행할 수 있습니다. 이 모델은 신약 개발에 적합합니다.

약 발견에 적합 EMT 조사를위한 효소 - 및 혈청이없는 신경 줄기 세포 배양 모델

우리는 여기에서 마이크로 RNA-200의 가족과 같은 grainyhead 2 (GRHL2)의 결합에 기초 이소성 발현 육종 세포에서 중간 엽 상피 전환 (MET)을 유도하는 세포 배양 방법을 제시한다. 이 방법은 암의 공격성과 치료에 대한 표현형 가소성의 생물학적 영향을 이해하기 더 적합합니다.

육종 세포의 중간 엽 상피 전환 유도

내 피 엽 전환 (EndMT)는 EndMT에 관련 된 세포 신호 경로 조사 하는 데 유용의 생체 외에서 유도 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 실험 모델에서 EndMT MS-1 내 피 세포에서 TGF-β와 치료에 의해 유발 됩니다.

내 피 엽 전환 성장 인자-β 신호 변환에 의해 유도 된의 분자 분석

우리는 실리콘 고무 (PDMS)로 제작 된 높은 처리량 견인력 분석방법을 제시한다. 이 새로운 분석은 다양한 생물학적 및 생물 의학 적 과정 및 질병 동안 세포 수축성의 물리적 변화를 연구하는 데 적합합니다. 우리는 상피-중간엽 전이 동안 수축성의 TGF-β 의존적 증가를 측정함으로써 이 방법의 유용성을 입증한다.

PDMS를 이용한 높은 처리량 견인력 현미경 검사법은 상피-중간엽 전이에 대한 성장 인자-β 변환의 용량 의존적 효과를 밝혀냅니다.

우리는 이 신호 통로에 관련시킨 단백질 및 유전자 발현을 공부해서 TGF β 신호 및 TGF-β 유도한 EMT를 조사하기 위하여 체계적인 워크플로우를 기술합니다. 방법은 서양 블로팅, 루시파라제 기자 분석, qPCR 및 면역 불피스테인링을 포함한다.

유방암과 정상 세포에서 TGF β 신호 및 TGF β 유도 된 상피 - 중간 엽 전환 연구

당사는 세포 형태 변화를 관찰하고 면역형성 염색을 이용한 발현 EndMT 관련 마커 변경을 검사함으로써 내피 세포에서 TGF-β2 유도 EndMT를 조사하는 방법을 설명합니다. CRISPR/Cas9 유전자 편집은 TGF-β2 유도 EndMT에서의 역할을 조사하기 위해 달팽이를 코딩하는 유전자를 고갈시키기 위해 기술및 사용되었다.

TGF-β 매개 내피- 중간엽 전환(EndMT)과 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 사용하여 EndMT 이펙터의 기능평가

어둠 / 빛으로 전환 시험은 마우스의 동작과 같은 불안을 측정하기 위하여 가장 널리 사용되는 검사 중 하나입니다. 여기, 우리가 테스트를 실시하는 방법에 대한 자세한 절차를 보여주는 동영상을 제시한다.

마우스에 대한 진한 / 라이트 전환 테스트

이 문서는 소설 프로토콜 및 시약 높은 컨텐츠 분석을 사용하여 뉴런과 astrocytes의 공동 문화 화합물과 치료의 neurotoxic 효과 민감한 측정을위한 설정에 대해 설명합니다. 결과는 높은 컨텐츠 분석 neurotoxicity 평가에 대한 흥미 진진한 소설 기술을 대표하는 것을 보여줍니다.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

학습하세요 상피-간엽 전환(EMT) 유도 및 면역세포화학 분석법을 다양한 세포주에서. 이 방법은 암 전이 연구와 약물 스크리닝에 활용됩니다.

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

더 많은 동영상 탐색