Name: 개발 체외 분석은 중간 엽 세포를 시행 한 상피 - 중간 엽 전환의 수축 기능을 평가하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: 배우세요 상피-중간엽 전환 후 중간엽 세포의 수축 기능을 평가하는 젤 수축 분석법을 A-549 폐 상피 세포를 이용하여. 이 기법은 염증성 질환 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

기술적인 도움을 주신 Tadashi Koyama 박사님께 감사드립니다. 이 작업은 JSPS KAKENHI Grant Numbers 23249045, 15K09211, 15K19172의 일부 지원을 받았습니다. 일본 후생노동성(Ministry of Health, Labour and Welfare)의 호흡 부전 연구 그룹(Respiratory Failure Research Group)에 대한 보조금; 일본 알레르기 질환 및 면역학 연구를 위한 보조금.

1. 준비 및 문화 폐 상피 세포의 <ol><li> 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 배양 A549 인간 폐 상피 세포 (접착 세포 라인) 100 μg의가 / ㎖ 스트렙토 마이신, 10 % 우 태아 혈청 (FBS), 100 IU / ml의 페니실린, 및. </li><li> 분리 한 배양 접시에서 세포 배양 배지를 버리고, 5 회 세척 - 포스페이트 완충 식염수 10 ㎖ (PBS). 세척 후 즉시 PBS를 대기음. </li><li> 3 분 동안 CO 2 2ml의 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (0.05 %)를 첨가하고, 37 ℃에서 5 % 부화. </li><li> 세포 배양액을 원심 분리를 150 × g에서 4 분 동안 RT에서 튜브를 포함하는 원심 분리 튜브에 세포를 수집한다. </li><li> 세포를 세포 배양 배지 2 ㎖에 재현 탁하고 세포 펠렛을 계산하기위한 샘플을 제거한다. 세포 생존을 확인 트리 판 블루 염색과 혈구를 이용하여 세포의 수를 계산. </li><li> 종자에 A549 세포0.5의 밀도로 10cm 폴리스티렌 플레이트 - 겔 수축 검정 용 배지 10 ㎖, 1.0 × 106 세포 / 접시. 0.5의 밀도로 6 웰 폴리스티렌 플레이트에 세포를 시드 - 1.0 × 105 세포 / 웰으로 EMT 확인 용 배지 2 ㎖. 24 시간 동안 CO 2, 37 ℃에서 세포를 인큐베이션하고, 5 %. </li></ol> 2. EMT 절차 <ol><li> 단계 1.6에서 시드 젤의 수축 분석에 대한 판에 TGF-β1 (5 μg의 / ㎖)의 10 μL와 TNF-α의 10 μL (10 μg의 / ㎖)를 추가합니다. 단계 1.6에서 시드 EMT 확인에 대한 판에 TGF-β1 (5 μg의 / ㎖)의 2 μL 및 TNF-α의 2 μL (10 μg의 / ㎖)를 추가합니다. 48 시간 동안 CO 2를 37 ° C에서 품어 5 %. </li></ol> PCR 및 웨스턴 블로 팅에 의한 EMT 절차 3. 확인 <ol><li> 위상차 현미경을 사용하여 처리 된 세포의 (모양을 스핀들에 자갈 돌 등으로부터) 형태의 변화를 확인합니다. 참고 : 규범을알 A549 세포는 상피 세포의 특징 인 자갈 돌 같은 삼각형 모양의 외관을 가지고 있지만, TGF-β1 및 TNF-α로 자극 한 후, 세포를 길게 나타나 스핀들 즉 중간 엽 세포 14,15과 유사한 형상. </li><li> 이러한 E-cadherin의 같은 상피 마커의 발현을 평가하고, PCR 또는 웨스턴 블롯 이용한 N-cadherin의, 멘틴 및 α-평활근 액틴과 같은 중간 엽 마커. <ol><li> RNA 추출 키트 (16)를 사용하여 세포로부터 전체 RNA를 추출하고 제조 업체의 프로토콜에 따라 역전사 효소 (17)를 사용하여 cDNA를 합성. </li><li> 실시간 PCR 시스템 (18) 및 제조자의 지시에 따라 모노머 시아닌 염료 PCR 키트를 사용하여 mRNA 수준의 발현을 측정한다. GAPDH에 대한 특이 적 프라이머 (글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 탈수소 효소), ACTA2 (알파 - 액틴 2) CDH1 (헤린-1, E-cadherin의) 및 VIM (멘틴)는 표 1에 나타내었다 </st&gt; 룽. </li><li> 를 Lyse 용균 완충액 (표 2) 1 % 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 용액을 사용하여 세포. 단백질 분석 키트 (19, 20)를 사용하여 모든 샘플의 단백질 농도를 측정하고, 폴리 아크릴 아미드 겔에 단백질의 동일한 양이 적용된다. <ol><li> SDS 겔 전기 영동하고 PVDF 막 (21)에 단백질의 반 건조 전송을 수행합니다. 2 시간 - 1 버퍼를 차단에서 일차 항체와 멤브레인을 품어. 배양 후, 세척 버퍼로 두 번 멤브레인을 씻고 두 번째 항체 막 1 시간을 품어. 참고 :이 연구에 사용 된 항체 희석을위한 재료 / 장비의 표를 참조하십시오. 버퍼를 차단의 구성 요소에 대한 표 2를 참조하십시오. </li><li> 두 번 세척 버퍼 막 씻으십시오. 감기 CCD 카메라 11,23를 사용하여 웨스턴 블로 팅 검출 키트 (22) 멤브레인의 사진을 촬영합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. 평가 EMT 젤 수축 분석 <ol><li> 세포 배양 용기로부터의 조정 배지를 흡인하고, 5 잘 세척 - 죽은 세포를 제거하기 위해 PBS 10 ㎖. 세척 후 즉시 PBS를 대기음. </li><li> 3 분 동안 CO 2를 0.05 % 트립신 / EDTA 2 ㎖를 추가하고 37 ° C에서 품어 5 %. </li><li> DMEM 150 × g에서 4 분 동안 RT에서 트립신 억제제 (1 ㎎ / ㎖), 원심 튜브를 보충 함유하는 원심 분리 튜브에 세포를 수집한다. </li><li> 증류수로 1 형 콜라겐 겔을 혼합 한 DMEM을 농축하여 4 × 1.75 ㎎ / ㎖의 콜라겐 농도를 달성하기 위해 볼륨을 조절하고, 1 × DMEM 농도. 이 단계 동안 얼음에 젤 매체를 유지해야합니다. 주 : 겔 배지 6 ㎖의하려면, 잘 3.5 mL의 1 형 콜라겐 겔 (3 ㎎ / ㎖) 1.5 × 4 농축 DMEM ml의 증류수 1ml를 혼합. </li><li> PBS 500 μL에있는 세포 펠렛을 resuspend 세포 계수에 대한 샘플을 제거합니다. 카운트트리 판 블루 염색하여 혈구를 이용하여 세포의 수는 세포 생존을 확인한다. </li><li> 부드럽게 세포 3.0 × 105 세포 / 웰의 밀도 (6.0 × 105 세포 / ㎖)을 달성하지만, 신속하게 겔화없이 피펫 팅하여 혼합 볼륨을 조정 겔 배지를 추가한다. </li><li> 스트레이트 원통 형상을 신속하고 신중 24- 웰 미처리 플레이트의 각 웰에 0.5 ml의 혼합물을 분배. 기포가 젤 (그림 1A)를 오염 할 수 있도록하지 않도록주의하십시오. 세포를 포함하는 겔 매체는 점성 쉽게 잘에서 젤 및 양식 초승달 모양 할 수 있습니다. </li><li> 37 ℃ 세포 배양기에서 15 분 동안 플레이트를 인큐베이션, 5 % CO 2, 95 % 습도 완전히 겔. </li><li> 한 방향으로 원주를 그리는 방법으로 멸균 주걱을 움직여서 깨지 않고 접시에서 겔을 분리. 주걱을 사용하여 부드럽게 60mm 조직 배양 접시에 겔을 전송할또는 TGF-β1 (5 NG / mL) 및 TNF-α (10 ng의 / ㎖)이없는 DMEM / 1 % FBS 함유하는 5 ㎖. </li><li> 부드럽게 젤이 매체에 떠 보장하기 위해 요리를 흔들어. 37 ° C, 5 % CO 2 및 95 % 습도에서 세포 배양기에서 인큐베이션. </li></ol> 젤 크기의 5. 측정 <ol><li> 영상 분석 시스템을 사용하여 0, 24, 48, 72 시간 후, 콜라겐 겔 크기를 측정한다. <ol><li> 겔 문서 시스템 (그림 2A)를 켜고 빛을 차단 캐비닛에 요리를 시작했습니다. 그런 다음 캐비닛의 요리의 뚜껑을 벗어. </li><li> 관련 겔 분석 소프트웨어를 엽니 다. 캐비닛의 젤의 이미지를 표시하려면 메뉴 바에서 &quot;이미지 수집 버튼&quot;을 클릭합니다. 그 후, 젤 (그림 2B)의 사진을 찍을 메뉴 바에서 &quot;획득&quot;을 클릭합니다. </li><li> 측정 영역을 메뉴 표시 줄 (그림 2C)에서 &quot;검색 버튼&quot;을 클릭하고 조정 (노란색 원 전마우스를 드래그하여 n 개의 그림 2C). 그런 다음, 메뉴 바의 &quot;자동 검색 버튼&quot;을 클릭합니다 (그림 2D에서 버튼을 참조). 이 소프트웨어는 자동으로 히트 맵 (그림 2D)를 보여주는 젤을 감지합니다. </li><li> 화상 처리에 의한 젤의 윤곽을 추출하고 개요 (그림 2E)에 의해 둘러싸인 영역을 계산하기 위해 &quot;OK&quot;를 클릭합니다. 면적을 산출 한 후, 산출 된 영역이 별도의 팝업 창에 표시된다. 참고 : 젤 이미징 동안 서로 겹치는 경우, 부드럽게 멸균 피펫 팁을 사용하여 젤을 이동합니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.</a> The Journal of pathology. 214, 199-214 (2008).</li>
<li>Hardie, W. D., Glasser, S. W., Hagood, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+the+pathogenesis+of+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in the pathogenesis of lung fibrosis.</a> The American journal of pathology. 175, 3-16 (2009).</li>
<li>Kovacic, J. C., Mercader, N., Torres, M., Boehm, M., Fuster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+and+endothelial-to-mesenchymal+transition%3A+from+cardiovascular+development+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal and endothelial-to-mesenchymal transition: from cardiovascular development to disease.</a> Circulation. 125, 1795-1808 (2012).</li>
<li>Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transitions+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.</a> Cell. 139, 871-890 (2009).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> The Journal of clinical investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li>
<li>Forino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta1+induces+epithelial-mesenchymal+transition%2C+but+not+myofibroblast+transdifferentiation+of+human+kidney+tubular+epithelial+cells+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+experimental+pathology%22%5BJournal%5D)">TGFbeta1 induces epithelial-mesenchymal transition, but not myofibroblast transdifferentiation of human kidney tubular epithelial cells in primary culture.</a> International journal of experimental pathology. 87, 197-208 (2006).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+miR-200+in+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Participation of miR-200 in pulmonary fibrosis.</a> The American journal of pathology. 180, 484-493 (2012).</li>
<li>Reynolds, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+inflammation+and+fibrosis%3A+an+alveolar+macrophage-centered+perspective+from+the+1970s+to+1980s%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Lung inflammation and fibrosis: an alveolar macrophage-centered perspective from the 1970s to 1980s.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 171, 98-102 (2005).</li>
<li>Camara, J., Jarai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+in+primary+human+bronchial+epithelial+cells+is+Smad-dependent+and+enhanced+by+fibronectin+and+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrogenesis+%26+tissue+repair%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition in primary human bronchial epithelial cells is Smad-dependent and enhanced by fibronectin and TNF-alpha.</a> Fibrogenesis & tissue repair. 3, 2(2010).</li>
<li>Kamitani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+stimulation+with+TGF-beta1+and+TNF-alpha+induces+epithelial+mesenchymal+transition+in+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+archives+of+allergy+and+immunology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous stimulation with TGF-beta1 and TNF-alpha induces epithelial mesenchymal transition in bronchial epithelial cells.</a> International archives of allergy and immunology. 155, 119-128 (2011).</li>
<li>Mikami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+beta+receptor+signaling+induces+IL-8+production+in+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin beta receptor signaling induces IL-8 production in human bronchial epithelial cells.</a> PloS one. 9, e114791(2014).</li>
<li>Yamauchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+enhances+both+epithelial-mesenchymal+transition+and+cell+contraction+induced+in+A549+human+alveolar+epithelial+cells+by+transforming+growth+factor-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+lung+research%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha enhances both epithelial-mesenchymal transition and cell contraction induced in A549 human alveolar epithelial cells by transforming growth factor-beta1.</a> Experimental lung research. 36, 12-24 (2010).</li>
<li>Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts%2C+myofibroblasts%2C+and+wound+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts, myofibroblasts, and wound contraction.</a> The Journal of cell biology. 124, 401-404 (1994).</li>
<li>Ramos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-1+reverts+epithelial-mesenchymal+transition+induced+by+TGF-%7Bbeta%7D1+through+MAPK%2FERK+kinase+pathway+%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">FGF-1 reverts epithelial-mesenchymal transition induced by TGF-{beta}1 through MAPK/ERK kinase pathway .</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 299, L222-L231 (2010).</li>
<li>Ren, Z. X., Yu, H. B., Li, J. S., Shen, J. L., Du, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suitable+parameter+choice+on+quantitative+morphology+of+A549+cell+in+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+reports%22%5BJournal%5D)">Suitable parameter choice on quantitative morphology of A549 cell in epithelial-mesenchymal transition.</a> Bioscience reports. 35, (2015).</li>
<li>Brinkmann, V., Kinzel, B., Kristofic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-independent+activation+of+human+CD4%2B+45RO-+T+cells+by+anti-CD28+plus+IL-2%3A+Induction+of+clonal+expansion+and+priming+for+a+Th2+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">TCR-independent activation of human CD4+ 45RO- T cells by anti-CD28 plus IL-2: Induction of clonal expansion and priming for a Th2 phenotype.</a> Journal of immunology. 156, 4100-4106 (1996).</li>
<li>Krug, M. S., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-strand+cDNA+synthesis+primed+with+oligo%28dT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">First-strand cDNA synthesis primed with oligo(dT).</a> Methods in enzymology. 152, 316-325 (1987).</li>
<li>Morozumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+pathogens+in+clinical+samples+from+patients+with+community-acquired+pneumonia+by+real-time+PCR+with+pathogen-specific+molecular+beacon+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of pathogens in clinical samples from patients with community-acquired pneumonia by real-time PCR with pathogen-specific molecular beacon probes.</a> Journal of clinical microbiology. 44, 1440-1446 (2006).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay%3A+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Analytical biochemistry. 175, 231-237 (1988).</li>
<li>Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W., et al. Electroblotting from polyacrylamide gels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUrsitti%2C+JA+%22Current+protocols+in+protein+science%22">Current protocols in protein science</a>. Chapter 10, Unit 10.7(2001).</li>
<li>Kricka, L. J., Voyta, J. C., Bronstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescent+methods+for+detecting+and+quantitating+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescent methods for detecting and quantitating enzyme activity.</a> Methods in enzymology. 305, 370-390 (2000).</li>
<li>Noguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrative+analysis+of+the+tumorigenic+role+of+TAZ+in+human+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+cancer+research+%3A+an+official+journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">An integrative analysis of the tumorigenic role of TAZ in human non-small cell lung cancer.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 20, 4660-4672 (2014).</li>
<li>Kasai, H., Allen, J. T., Mason, R. M., Kamimura, T., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta1+induces+human+alveolar+epithelial+to+mesenchymal+cell+transition+%28EMT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+research%22%5BJournal%5D)">TGF-beta1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition (EMT).</a> Respiratory research. 6, 56(2005).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+type+II+TGF-beta+receptor+tyrosine+dephosphorylation+controls+SMAD-dependent+profibrotic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated type II TGF-beta receptor tyrosine dephosphorylation controls SMAD-dependent profibrotic signaling.</a> The Journal of clinical investigation. 124, 3295-3310 (2014).</li>
<li>Saito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+expression+profiling+reveals+target+genes+of+TGF-beta+and+TNF-alpha+possibly+mediated+by+microRNAs+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">An integrated expression profiling reveals target genes of TGF-beta and TNF-alpha possibly mediated by microRNAs in lung cancer cells.</a> PloS one. 8, e56587(2013).</li>
<li>Dvashi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+magnesium+dependent+1A+governs+the+wound+healing-inflammation-angiogenesis+cross+talk+on+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase magnesium dependent 1A governs the wound healing-inflammation-angiogenesis cross talk on injury.</a> The American journal of pathology. 184, 2936-2950 (2014).</li>
<li>Hallgren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+ROCK1+dependent+contractility+in+fibroblast+from+chronic+obstructive+pulmonary+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Enhanced ROCK1 dependent contractility in fibroblast from chronic obstructive pulmonary disease patients.</a> Journal of translational medicine. 10, 171(2012).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-9+activates+TGF-beta+and+stimulates+fibroblast+contraction+of+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-9 activates TGF-beta and stimulates fibroblast contraction of collagen gels.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 306, L1006-L1015 (2014).</li>
<li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+induces+human+lung+fibroblast-mediated+collagen+gel+contraction+via+histamine+H1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+lung+research%22%5BJournal%5D)">Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor.</a> Experimental lung research. 40, 222-236 (2014).</li>
<li>Kohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGD%282%29+modulates+fibroblast-mediated+native+collagen+gel+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">PGD(2) modulates fibroblast-mediated native collagen gel contraction.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 27, 375-381 (2002).</li>
<li>Muir, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophageal+epithelial+cells+acquire+functional+characteristics+of+activated+myofibroblasts+after+undergoing+an+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Esophageal epithelial cells acquire functional characteristics of activated myofibroblasts after undergoing an epithelial to mesenchymal transition.</a> Experimental cell research. 330, 102-110 (2015).</li>
<li>Zhong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endoplasmic+reticulum+stress+in+epithelial-mesenchymal+transition+of+alveolar+epithelial+cells%3A+effects+of+misfolded+surfactant+protein%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Role of endoplasmic reticulum stress in epithelial-mesenchymal transition of alveolar epithelial cells: effects of misfolded surfactant protein.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 45, 498-509 (2011).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cytokines+augments+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+A549+cells+by+up-regulating+TbetaR-I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility+and+the+cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cytokines augments TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in A549 cells by up-regulating TbetaR-I.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 65, 935-944 (2008).</li>
</ol>

저자는 공개 할 관심의 충돌이 없습니다.

본 연구에서 개발 된이 프로토콜은 두 단계를 포함한다. 첫 번째 단계에서는 두 번째 단계는 겔 수축 분석법 동안, EMT를 유도하기 위해 실행된다. 이 세포는 EMT을받은 것을 확인하는 것이 중요하기 때문에, 2 단계는 형태 학적 및 유전자 발현의 변화에​​ 훌륭한 보완을 제공합니다. 이전 연구 A549 세포 EMT는 TGF-β1을 24 만에 의한 것으로 나타났다; 우리는 이전에 10보고 그러나, TNF-α 치료는 EMT 및 중간 엽 세포 마커의 인수 향상시킵니다. TGF-β 매개 EMT의 메커니즘 SMAD 의존 (25)이라고 생각된다. TNFα는 젤의 수축의 증대로 연결 TGF-β1에 의한 EMT을 향상시킵니다. 이는 TGF-β1 유도 EMT의 향상을위한 TNFα의 메커니즘 된 Smad2 링커 영역의 인산화가없는 것으로 알려져있다, 또한 규제 26 시그널링 MAPK. 따라서 본 연구에서 개발 된 프로토콜은 STIMUL 포함TGF-β1 및 TNF-α...

섬유화 간질 성 폐 질환, 심장 섬유증, 간경변, 단말 신부전, 전신성 경화증,자가 면역 질환 한 각종 만성 진행성 질환의 발병에 관여된다. 간질 성 폐 질환 중 특발성 폐 섬유증 (IPF)은 만성 진행성 질환이며, 불량한 예후를 보여줍니다. IPF의 병리학 적 특징은 예후와 관련된 활성화 된 섬유 아세포 및 근섬유로 이루어진 섬유 아세포 초점의 개발이다. 이러한 폐 섬유 아 세포의 기원은 원래 주민 폐 섬유 아 세포를 포함하고 골수에서 섬유 세포를 순환 여러 중간 엽 세포에서 파생 할 것을 제안한다. 최근 상피 간엽 전이 (EMT)는 간엽 세포 (2)의 형성과 관련이 제안되었으며, 섬유 성 질환의 발병에 기여. 그것은 생각된다 EMT는 종양의 침윤과 전이 3를 포함하여 태아의 발달 과정에서 중요한 역할을, 상처 치유, 암의 진행을한다. EMT의 방법에 따라, 상피 세포는 E-cadherin의 상피 마커의 손실에 의해 중간 엽 세포의 능력을 획득하고, 그러한 멘틴 같은 중배엽 마커, 및 α-평활근 액틴 (SMA) -4,5- 의해 발현. 이전 연구 EMT 처리가 신장 6 및 7에서 폐 섬유증 조직의 발달과 관련되었다는 증거를 나타내었다. 또한, 만성 염증은 섬유 성 질환 (8)을 촉진; 또한, 종양 괴사 인자 상과 부재 (14) (TNFSF14; LIGHT)와 같은 염증성 사이토 카인, 종양 괴사 인자 (TNF) -α 및 인터루킨 1β는 EMT 9-12을 향상시키는 것으로 나타났다. 콜라겐 겔 수축 분석법, 섬유 아세포 타입 I에 포함 된 콜라겐 계 세포 수축 분석법콜라겐 겔 삼차원, 수축의 평가를위한 시험 관내 모델에서 이상적이다. 수축성 섬유 아세포의 특성 함수 중 하나이며 정상 상처 복구 및 섬유증 (13)에 기여한다. 이 분석에서, 섬유 아세포의 부착이 어떤 조건 하에서 기계적 장력을 생성하도록되어 I는 인테그린 의존성 메커니즘을 통해 입력 콜라겐, 결과적으로 조직의 수축을 유도하는 것으로 생각된다. 여기서, 겔 수축 분석법의 개발이 EMT을받은 세포의 수축 기능의 획득을 평가하도록 적응 될 것으로보고있다. 이 보고서는이 변형 분석이 EMT을 시행 한 중간 엽 세포의 수축력을 평가하기에 적합 함을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>시그마 알드리치</td><td>11965-092</td><td>A549 매체</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>변형 성장 인자-&베타; 1, 인간, 재조합</td><td>Wako Laboratory 화학 물질</td><td>209-16544</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 TNF-&알파;</td><td>R& D 시스템</td><td>210-TA/CF</td><td></td></tr><tr><td>E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb</td><td>세포 신호 기술</td><td>#3195</td><td>1:3,000 희석</td></tr><tr><td>Vimentin (D21H3) 토끼 mAb</td><td>세포 신호 기술</td><td>#5741</td><td>1:3,000 희석</td></tr><tr><td>Anti-&alpha;-Tubulin 항체</td><td>sigma aldrich</td><td>T9026</td><td>1:10,000 희석</td></tr><tr><td>단클론 Anti-Actin, &알파;-평활근 항체& 주의;</td><td>sigma aldrich</td><td>A5228</td><td>1:10,000 희석</td></tr><tr><td>Anti-N-cadherin 항체</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>#610920</td><td>1:1,000 희석</td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (secondary antibody)GE</td> <td>Healthcare</td><td>NA931-100UL</td><td>1:20,000 dilution</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (secondary antibody)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>1:20,000 희석</td></tr><tr><td>차단 시약</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN418</td><td>2% TBS-T</td></tr><tr><td>6 웰 클리어 플랫 바닥 TC 처리 멀티웰 세포 배양 플레이트, 뚜껑</td><td>corning</td><td>#353046</td><td></td></tr><tr><td>100mm 세포 배양 접시</td><td>TPP</td><td>#93100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 분말</td><td>생명 기술</td><td>12100-046</td><td>4&times; DMEM</td></tr><tr><td>유형 1 콜라겐 젤</td><td>Nitta 젤라틴</td><td>Cellmatrix 유형 I-A</td><td></td></tr><tr><td>24 웰 세포 배양 플레이트</td><td>AGC TECHNO GLASS</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>젤 문서화 시스템&nbsp;</td><td>ATTO</td><td>AE-6911FXN</td><td>겔 이미저</td></tr><tr><td>겔 분석 소프트웨어</td><td>ATTO</td><td>Densitograph, ver.</td><td>AE-6911FXN</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드</td><td>라이프 기술</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>24 웰 플레이트, 비처리</td><td>IWAKI</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루 솔루션, 0.4%</td><td>라이프 테크놀</td>로지스 <td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>RNA 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>역전사 효소</td><td>생명 기술</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>실시간 PCR 시스템</td><td>Stratagene</td><td>Mx-3000P</td><td></td></tr><tr><td>SYBR 녹색 PCR 키트</td><td>Qiagen</td><td>204145</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 (100x)</td><td>생명 과학 기술</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인</td><td>ATTO</td><td>2392390</td><td></td></tr><tr><td>단백질 분석 키트</td><td>bio-rad</td><td>5000006JA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>폴리아크릴아미드 겔</td><td>ATTO</td><td>2331810</td><td></td></tr><tr><td>웨스턴 블로팅 검출 시약</td><td>GE 헬스케어</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>콜드 CCD 카메라</td><td>ATTO</td><td>Ez-Capture MG/ST</td><td></td></tr><tr><td>트립신 억제제</td><td>시그마 알드리치</td><td>T9003-100MG</td><td></td></tr><tr><td>폴리옥시에틸렌 (20)소르비탄 모노라우레이트</td><td>Wako Laboratory chemicals</td><td>163-11512</td><td></td></tr><tr><td>폴 리 옥시 에틸렌 (9) 옥 티 페닐 에테르</td><td>와코 연구소 화학 물질</td><td>141-08321</td><td></td></tr></tbody></table>

개발<em&gt; 체외</em&gt; 분석은 중간 엽 세포를 시행 한 상피 - 중간 엽 전환의 수축 기능을 평가하는

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

섬유증은 간질성 폐질환과 같은 다양한 만성 진행성 질환의 발병에 관여하는 경우가 많습니다. 병리학적 특징은 섬유아세포 병소(fibroblastic foci)의 형성이며, 이는 질병의 중증도와 관련이 있습니다. 섬유아세포 병소(fibroblastic foci)로 구성된 중간엽 세포(mesenchymal cell)는 원래 상주하는 폐내 섬유아세포(intrapulmonary fibroblast) 및 골수에서 순환하는 섬유세포(circulating fibrocyte)를 포함한 여러 세포 공급원에서 유래하는 것으로 제안되었습니다. 최근에는 상피-중간엽 전이(EMT)를 겪은 중간엽 세포도 섬유증의 발병에 기여하는 것으로 여겨지고 있습니다. 또한 EMT는 성장 인자 β 변형시켜 유도할 수 있으며, EMT는 종양 괴사 인자 α와 같은 전염증성 사이토카인에 의해 강화될 수 있습니다. 겔 수축 분석법은 섬유아세포의 특징적인 기능 중 하나이며 상처 복구 및 섬유화에 기여하는 수축성 평가를 위한 이상적인 체외 모델입니다. 여기에서는 EMT를 받은 중간엽 세포의 수축 능력을 평가하기 위한 겔 수축 분석법의 개발을 입증합니다.

EMT 동안, 상피 세포는 E-cadherin의 같은 상피 마커를 잃게 및 멘틴 및 α-평활근은 4,5를하는 걸 같은 중간 엽 마커의 발현을 얻을 수 있습니다. TGF-β1 및 TNF-α와 A549 인간의 폐 상피 세포의 배양은 EMT를 유도한다. 정상 A549 세포의 모양은 상피 세포 (도 3a)의 특성 인 형상 및 삼각형 등 자갈 돌로 있지만, TGF-β1 및 TNF-α로 자극 한 후, 외관 간엽 비슷 긴 스핀들 형상으로 변경 세포 (그림 3B). 상피와 중간 엽 마커의 발현은 세포 EMT을받은 것을 확인 평가 하였다. 상대 mRNA 발현은 ΔΔCt 방법으로 계산 하였다. 개별 데이터가 가사 g 인 글리 세르 알데히드 -3- 포스페이트 데히드로게나 (GAPDH)에 대한 규격화 ...

여기에서는 상피-중간엽 전이를 거친 중간엽 세포에서 수축 기능을 평가하기 위한 겔 수축 분석법의 개발 및 적용에 대해 설명합니다.

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

이 절차의 전반적인 목표는 체외 염증성 사이토카인 유도 상피 중간엽 전이(EMT)를 거친 중간엽 세포의 수축성을 평가하는 것입니다. 이 중간엽은 특발성 폐섬유증 또는 중증 천식에서 기도 리모델링과 같은 염증성 면역 반응에 의해 유도되는 EMT 후 기본 세포 기능의 변화입니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 특정 장치가 필요하지 않고 높은 함량을 보여주는 것입니다 Demontating 절차는 제 연구실의 대학원생 인 Hideyuki Takeshima와 Kosuke Makita가 될 것입니다.A-549 인간 폐 상피 세포 배양액을 5-10밀리리터의 PBS로 세척하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 섭씨 37도에서 트립신-EDTA 2밀리리터와 5%의 이산화탄소로 부착 세포를 분리합니다. 3분 후, 세포 배양 배지가 들어 있는 원뿔형 튜브로 세포 현탁액을 옮기고 원심분리기에서 세포를 스핀다운합니다.펠릿을 세포 배양 배지 2밀리리터에 재현탁시키고 계수를 위해 작은 엘로콰트를 예약합니다. 그런 다음 10 센티미터 당 중간 폴리스테렌 접시의 10 밀리리터에 0.5-1 곱 10 세포를 파종하고 24 시간 동안 세포 배양을 배양합니다. EMT 유도의 경우 다음날 10마이크로리터의 TGF 베타 1 및 TNF 알파로 세포를 처리하고 플레이트를 다시 48시간 동안 인큐베이터에 반환합니다.4일차에는 emt 유도 배양액을 5-10밀리리터의 pbs로 세척한 다음 방금 시연한 것처럼 트립신-EDTA로 세포를 분리합니다. 다음으로, tryspsin 억제제가 보충된 DMEM의 세포 현탁액을 스핀다운하고 펠릿을 500마이크로리터의 pbs에 재현탁합니다. 그런 다음 세포를 계수하고, 웰 당 5 번째 세포에 3 배 10의 밀도로 신선하게 제조 된 젤 배지를 첨가하고, 겔화 전에 피펫으로 용액을 부드럽지만 빠르게 혼합합니다.즉각적이지만 조심스럽게 0.5밀리리터의 세포를 처리되지 않은 24웰 플레이트의 각 웰에 깔끔한 원통형 형태로 분배합니다. 그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 15분 동안 넣습니다. 겔이 완전히 응고되면 멸균된 주걱을 각 겔 바깥쪽을 한 방향으로 원을 그리며 움직여 플레이트에서 겔이 깨지지 않고 분리되도록 합니다.젤을 제거할 때 웰 안에서 주걱을 앞뒤로 움직이지 않도록 주의하세요. 그런 다음 주걱을 사용하여 TGF 베타 1 및 TNF 알파 유무에 관계없이 1% FBS가 보충된 5밀리리터의 DMEM이 포함된 개별 16mm 조직 배

development-an-vitro-assay-to-evaluate-contractile-function

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 / β - catenin Wnt와 cardiogenic 유도하는 동안 BMP 신호 활성화를위한 중요한 시간 윈도우를 식별하는 마우스 ES 세포 기반 분석의 사용을 설명합니다. 방법은 안정 cardiogenic 효율성을 단정 표준화된 플랫폼을 제공하고, 다른 세포 lineages의 연구에 적용됩니다.

Cardiogenic 유도 효율을 Quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이

두개골 mesenchyme 가능성이 신경 주름 상승을위한 원동력을 제공 극적인 morphogenic의 움직임을...

두개골 Mesenchyme의 셀룰러 행동을 평가하기위한 Explant 분석

간단한 방법은 세포 유형의 다양한 중간 엽 전이 (EMT)에 상피의 유도에 대해 설명한다. 면역 세포에 의한 EMT 상태에있는 세포의 분석 방법이 포함되어 있습니다.

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

선택적 접합 조절은 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에서 필수적인 세포 프로그램인 상피-중간엽 전이(EMT)에 기여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서는 EMT 중 선택적 접합을 감지하기 위해 유도 가능한 EMT 모델을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

상피 - 간엽 전환시 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 검출

여기에서는 외성장 배양 분석으로 일차 마우스 심외막 세포를 분리하고 생체 외 심장 배양 시스템을 사용하여 표피 유래 세포(EPDC)의 기능적 이동을 평가하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 EMT(epicardial epithelial-to-mesenchymal transition) 및 운동성의 유전적 및 화학적 조절자를 식별하는 데 적합합니다.

심 외막 파생물 문화 분석 및<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 심 외막 유래 세포 마이그레이션 평가

상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)는 암이 침습적이 될 수 있도록 합니다. EMT를 조사하기 위해 혈청과 효소가 없는 신경줄기세포(NSC) 기반 체외 모델을 설명합니다. 이 표준화된 시스템을 통해 세포 이동, 유전자 및 단백질 발현에 대한 정량적 및 정성적 평가를 수행할 수 있습니다. 이 모델은 신약 개발에 적합합니다.

약 발견에 적합 EMT 조사를위한 효소 - 및 혈청이없는 신경 줄기 세포 배양 모델

소 각막 내피 세포의 일차 배양 각막 내피 간엽 전이의 메커니즘을 조사 하였다. 또한, 래트 각막 내피 cryoinjury 모델 생체 내 각막 내피 간엽 전환을 증명 하였다.

생체 외 및 생체 내 모델에서 각막 내피 세포 - 중간 엽 전이를 공부하기

epicardium 세포와 심근 벽에 성장 요소를 제공 하 여 개발 및 심장의 수리에 중요 한 역할을 하고있다. 여기, 우리는 연구와 그들의 발달 및 성인 특성의 비교 문화 인간의 기본 epicardial 셀 하는 방법을 설명 합니다.

분리와 인간 성인 그리고 태아 심장 표본에서 파생 하는 기본 Epicardial 세포의 문화

우리는 실리콘 고무 (PDMS)로 제작 된 높은 처리량 견인력 분석방법을 제시한다. 이 새로운 분석은 다양한 생물학적 및 생물 의학 적 과정 및 질병 동안 세포 수축성의 물리적 변화를 연구하는 데 적합합니다. 우리는 상피-중간엽 전이 동안 수축성의 TGF-β 의존적 증가를 측정함으로써 이 방법의 유용성을 입증한다.

PDMS를 이용한 높은 처리량 견인력 현미경 검사법은 상피-중간엽 전이에 대한 성장 인자-β 변환의 용량 의존적 효과를 밝혀냅니다.

이 연구는 형광 단백질 마이크로패턴의 시각화된 변위를 기반으로 단일 세포 수축력의 단순화되고 핸드오프 정량화를 위해 마이크로웰 형식으로 형광 표지된 엘라스토머 수축성 표면(FLECS) 기술을 활용하기 위한 유연한 프로토콜을 제시합니다.

마이크로 패턴화된 엘라스토머를 이용한 단일 세포 수축성의 단순화된 고처리량 분석

이 프로토콜은 3D 엔지니어링된 심장 및 골격근 조직을 생성하는 방법을 제공하고 전임상 약물 스크리닝 양식에서의 사용을 설명합니다. 설명된 방법은 자기 감지 시스템을 사용하여 24개의 조직을 동시에 동시에 평가할 수 있습니다.

확장 가능한 3D 엔지니어링 근육 조직의 전임상 약물 테스트

배우세요 상피-중간엽 전환 후 중간엽 세포의 수축 기능을 평가하는 젤 수축 분석법을 A-549 폐 상피 세포를 이용하여. 이 기법은 염증성 질환 연구에 활용됩니다.

개발

더 많은 동영상 탐색