개발 체외 분석은 중간 엽 세포를 시행 한 상피 - 중간 엽 전환의 수축 기능을 평가하는

이 절차의 전반적인 목표는 체외 염증성 사이토카인 유도 상피 중간엽 전이(EMT)를 거친 중간엽 세포의 수축성을 평가하는 것입니다. 이 중간엽은 특발성 폐섬유증 또는 중증 천식에서 기도 리모델링과 같은 염증성 면역 반응에 의해 유도되는 EMT 후 기본 세포 기능의 변화입니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 특정 장치가 필요하지 않고 높은 함량을 보여주는 것입니다 Demontating 절차는 제 연구실의 대학원생 인 Hideyuki Takeshima와 Kosuke Makita가 될 것입니다.

A-549 인간 폐 상피 세포 배양액을 5-10밀리리터의 PBS로 세척하는 것으로 시작합니다. 다음으로, 섭씨 37도에서 트립신-EDTA 2밀리리터와 5%의 이산화탄소로 부착 세포를 분리합니다. 3분 후, 세포 배양 배지가 들어 있는 원뿔형 튜브로 세포 현탁액을 옮기고 원심분리기에서 세포를 스핀다운합니다.

펠릿을 세포 배양 배지 2밀리리터에 재현탁시키고 계수를 위해 작은 엘로콰트를 예약합니다. 그런 다음 10 센티미터 당 중간 폴리스테렌 접시의 10 밀리리터에 0.5-1 곱 10 세포를 파종하고 24 시간 동안 세포 배양을 배양합니다. EMT 유도의 경우 다음날 10마이크로리터의 TGF 베타 1 및 TNF 알파로 세포를 처리하고 플레이트를 다시 48시간 동안 인큐베이터에 반환합니다.

4일차에는 emt 유도 배양액을 5-10밀리리터의 pbs로 세척한 다음 방금 시연한 것처럼 트립신-EDTA로 세포를 분리합니다. 다음으로, tryspsin 억제제가 보충된 DMEM의 세포 현탁액을 스핀다운하고 펠릿을 500마이크로리터의 pbs에 재현탁합니다. 그런 다음 세포를 계수하고, 웰 당 5 번째 세포에 3 배 10의 밀도로 신선하게 제조 된 젤 배지를 첨가하고, 겔화 전에 피펫으로 용액을 부드럽지만 빠르게 혼합합니다.

즉각적이지만 조심스럽게 0.5밀리리터의 세포를 처리되지 않은 24웰 플레이트의 각 웰에 깔끔한 원통형 형태로 분배합니다. 그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 15분 동안 넣습니다. 겔이 완전히 응고되면 멸균된 주걱을 각 겔 바깥쪽을 한 방향으로 원을 그리며 움직여 플레이트에서 겔이 깨지지 않고 분리

젤을 제거할 때 웰 안에서 주걱을 앞뒤로 움직이지 않도록 주의하세요. 그런 다음 주걱을 사용하여 TGF 베타 1 및 TNF 알파 유무에 관계없이 1% FBS가 보충된 5밀리리터의 DMEM이 포함된 개별 16mm 조직 배양 접시에 젤을 부드럽게 옮깁니다. 마지막으로, 접시를 부드럽게 흔들어 겔이 배지에 떠 있는지 확인하고 겔을 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다.

처리되지 않은 a541 세포는 상피 세포의 특징인 조약돌과 같은 삼각형 모양의 모양을 나타냅니다. 그러나 TGF 베타 1 및 TNF 알파로 자극한 후 세포는 메싱크헤말 세포에서 관찰된 것과 유사한 긴 방추체 모양을 보여줍니다. EMT 전후 상피 및 메싱크헤말 마커 발현의 QRTCPR은 48시간 동안 염증성 사이토카인으로 처리된 A541 세포에서 CDH1의 발현이 현저히 감소하고 VIAM 및 ACTA2의 발현이 유의하게 증가했음을 나타냅니다.

또한, 이러한 사이토카인을 이용한 자극은 서양의 혈액 분석에 의해 결정된 E-cadherin 발현을 약화시키는 반면, vimentin N-cadherin 및 alpha smooth muscle actin의 발현은 유도됩니다. 겔 수축 분석에서 48시간 후 TGF 베타 1 및 TNF 알파 처리된 세포를 포함하는 겔은 PBS로 처리된 세포를 포함하는 대조 겔보다 작습니다. 실제로, 72시간 후에는 사이토카인 처리된 겔을 포함하는 겔의 크기가 겔 분석기로 측정된 조절된 겔에 비해 크게 감소합니다.

관찰된 바와 같이, 겔 수축 단계는 적절하게 수행되면 3시간 내에 완료될 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 겔 수축 분석을 수행하기 전에 EMT가 성공적으로 유도되었는지 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 관찰 후, 이 기술은 섬유증이나 폐 재형성과 같은 염증 상태에서 EMT 과정을 다양화할 수 있는 방법을 제공합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 EMT가 있는 세포를 일종의 쿠아젠터로 방출하고 배지에서 거품을 내는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.