상피 - 간엽 전환시 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 검출

다음 실험의 전반적인 목표는 EMT 중 대체 접합의 변화를 감지하는 것입니다. 이것은 융합 단백질의 발현이 뒤틀리는 유도 가능한 EMT 모델을 활용하여 달성됩니다. 인간의 유방 상피 세포에서는 세포가 두 번째 단계로 타목시펜 치료에 EMT를 겪게 됩니다.

스플라이스 이소폼의 발현은 이소폼 특이적 프라이머 세트를 사용하여 정량적 R-T-P-C-R에 의해 분석되며, 이는 RNA 수준에서 선택적 스플라이싱 변화를 나타냅니다. 다음으로, 단백질 수준에서 스플라이스 이소형의 발현을 확인하기 위해 면역 블로팅에 의해 각 동형에 해당하는 단백질의 풍부도를 측정하고, 정량적 R-T-P-C-R 및 면역 블로팅 분석을 기반으로 EMT 중 관심 유전자의 선택적 스플라이싱의 변화를 보여주는 결과를 얻고, 이 방법은 RN 대체 스플라이싱 및 EMT 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어 EMT 중에 선택적 접합이 어떻게 조절되는지, 이 규정이 EMT 및 EMT 관련 병리학적 과정에 어떤 영향을 미치는지 등. 이 기술의 함의는 EMT가 종양 침습 및 전이를 촉진하는 데 중요한 역할을 하기 때문에 암 치료에 대한 의미입니다.

이 방법은 EMT 중 대체 접합에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 동형 특이적 MRA 검출 방법은 뉴런 분화 및 프로그램 세포 사멸에서 선택적 접합 연구와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 첫번째 단계는 강선전도 ER 융해 단백질을 표현하는 격판덮개 세포에 세포를 씨를 뿌리고, 중복에 있는 10 센티미터 조직 배양 접시로 세포를 씨를 뿌리기 위한 것이고, 다음으로, 준비하고 빛은 상피 mesenchymal 전이를 유도하기 위하여 Tamoxifen 해결책을 보호하고 비 tamoxifen에 의하여 대우된 통제 그룹을 위한 매체를 가진 20의 nanomolar tamoxifen 포함 매체를 가진 EMT 대우 세포는 외양 후에 2 일 후에 세포의 추가 세트에 0.01%ethanol를 추가합니다.

형태학적 변화를 기록하기 위해 10배 배율로 광학 현미경으로 사진을 찍습니다. 다음으로, 차가운 PBS로 세포를 씻으십시오. RNA 분리를 위해 플레이트의 절반에서 RNA 용해 완충액으로 세포를 긁어내고 단백질 분석 통로를 위해 다른 절반을 100마이크로리터의 얼음 저온 리파 완충액에서 앞서 보여준 것처럼 두 그룹의 세포를 긁어내고 20나노몰 타목시펜 또는 비히클로 지속적으로 처리합니다.

14일까지 격일로 이 단계를 반복하며, 이때 Tamoxifen을 처리한 트위스트 ER 세포는 방추체 모양의 중간엽 형태를 나타내야 합니다. 반면 차량 처리 대조군은 상피 형태와 같은 조약돌을 유지해야 합니다. 여기서 4개의 엑손 프렘 NNA는 엑손 함유 검출의 예로 사용됩니다.

가변 엑손 3 내부에 포워드 프라이머를 설계하고 인근 구성 엑손 4 내부에 리버스 프라이머를 설계합니다. 엑손 건너뛰기 이벤트를 특이적으로 증폭하기 위해 포함된 동형(isoform)을 포함하는 가변 엑손의 특정 증폭을 허용합니다. 구성 엑손 2와 엑손 4의 접합부에 걸쳐있는 설계 프라이머는 가변 엑손 3이 포함될 때 그렇지 않으면 파괴됩니다.

유전자의 총 전사체를 검출하고 준비가 되었을 때 두 개의 구성 엑손 내에서 게놈 DNA 또는 prem NA.Design 프라이머에서 증폭된 PCR 산물을 피하기 위해 구성적 엑손 4 내부에 다른 프라이머를 설계합니다. 표준 RNA 추출 절차에 따라 이전에 수집된 세포 샘플에서 RNA를 분리합니다. UV 흡수에 의한 RNA의 농도와 품질을 측정하여 첫 번째 가닥 CD NA를 합성하고 20 마이크로 리터의 최종 부피에서 역전사 효소 반응을 설정합니다.

RT 반응을 섭씨 42도에서 1시간 동안 수행한 다음 섭씨 70도에서 5분 동안 배양합니다. RT 효소를 실시간으로 비활성화합니다. PCR은 10 마이크로 리터의 사이버 그린 마스터 믹스, 0.1-1.0 마이크로 리터의 CD NA 템플릿, 5 개의 피코몰 정방향 및 역방향 프라이머로 구성된 20 마이크로 리터 반응을 설정했습니다.

40주기로 Real-Time PCR을 3회 실행합니다. 해리 곡선을 확인하고 각 프라이머 세트에 대해 단일 피크가 관찰되는지 확인합니다. 증폭 곡선의 2차 도함수 값을 계산하여 정량화 주기 값을 얻습니다.

이 공식과 같이 delta delta CQ 방법을 사용하여 유도되지 않은 샘플과 비교하여 유도된 샘플에서 타겟 mRNA의 상대적인 양을 계산합니다. 단백질 분석을 위해 수집된 세포를 원심분리하고 상층액을 수집하기 전에 약 10분 동안 얼음 위에 두십시오. 단백질 농도를 결정한 후, SDS 로딩에서 샘플을 희석하고, 10%SDS 페이지 겔로 20-40마이크로그램의 단백질을 버퍼링하고 로드합니다.

SDS 페이지 젤을 20밀리암페어에서 1.5시간 동안 실행합니다. 이 시간이 지나면 섭씨 4도의 습식 전달 시스템에서 85볼트에서 3시간 동안 단백질을 PVDF 멤브레인으로 전달합니다. 타겟 단백질의 분자량에 따라 전달 시간을 조정합니다.

다음으로, 30분에서 1시간 동안 5% 무지방 우유로 멤브레인을 차단합니다. 실온에서 1차 항체가 있는 멤브레인을 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 1차 항체는 구성적 엑손 코팅 영역에서 epitope를 인식하고 서로 다른 단백질 크기에 따라 slic isoform을 동시에 검출합니다.

동시에 면역 블로팅으로 EMT를 모니터링합니다. EMT 마커의 경우. eec, ahern, gamma catenin 및 occludin을 상피 마커로 사용하고 fibronectin n cadherin 및 menton을 중간엽 마커로 사용합니다.

다음날 5분 간격으로 TBST로 멤브레인을 3회 세척합니다. 다음으로, HRP conjugated secondary antibody를 실온에서 1 - 10, 000 희석으로 멤브레인을 배양합니다. 이 시간이 지나면 5분 간격으로 TBST로 멤브레인을 세 번 세척합니다.

마지막으로, 화학발광 검출 시스템으로 단백질을 시각화하고 멤브레인을 자동 방사선 촬영 필름에 노출시킵니다. 트위스트 유도 EMT는 상피 표현형과 같은 조약돌에서 길쭉한 섬유아세포 표현형으로의 전이를 특징으로 하며, 상피 마커, e cadherin, gamma catenin 및 occludin의 부재와 중간엽 마커, fibronectin n cadherin 및 vimentin의 상향 조절을 나타냅니다. 또한, EMT는 묘사된 세포 접합부에서 EC cadherin 국소화의 손실에 의해 평가되었습니다.

다음은 CD 44 스플라이스 이성질체 검출을 위한 프라이머 설계입니다. 프라이머 위치는 다양한 색상의 화살표로 표시됩니다. Q-R-T-P-C-R 분석 결과는 TAM 처리 14일 후 CD 44 V mRNA가 현저히 감소하고 CD 44 s mRNA가 증가함을 나타냅니다.

대조적으로, CD 44의 총 전사체는 Q-R-T-P-C-R의 결과와 일치하는 EMT 동안 변하지 않았으며, CD 44 V의 단백질 수준은 현저하게 감소한 반면, CD 44 s 단백질의 발현은 이 절차를 수행하는 동안 크게 상향 조절되었습니다. 이비인후과의 성공적인 유도가 매우 중요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 이비인후과에서는 이비인후과 마커의 세포 형태 발현 변화 감지, 세포 표면의 RIN 국소화 등 다양한 방법으로 이비인후과를 주의 깊게 확인해야 합니다.

이 절차에 따라, 리포터 관리 분석을 접합하는 것과 같은 다른 방법을 수행하여 이러한 작용 요소와 거래 요인이 개발 후 선택적 접합 조절에 어떤 영향을 미치는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 RNA 생물학, 발달 생물학 및 암 생물학 분야의 연구자들이 정상적인 발달 및 암 전이 중 EMT 과정에서 대체 접합 조절을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.