시차 주사 Fluorimetry를 사용하여 단백질 - 리간드 상호 작용의 결정

이 절차의 전반적인 목표는 단백질 리간드 상호 작용에 대한 해리 상수를 추정하는 것입니다. 이것은 먼저 지표 염료와 함께 리간드의 농도가 다른 단백질의 혼합물을 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 단백질의 풀림을 모니터링하기 위해 지표의 형광을 기록하면서 이러한 샘플을 가열하는 것입니다.

다음으로, 단백질 풀림 곡선은 일련의 용융 온도로 변환됩니다. 마지막 단계는 이러한 데이터를 적절한 모델에 맞추어 해리 상수를 추정하는 것입니다. 궁극적으로, 시차 주사 형광 측정법은 단백질과 리간드의 상호 작용을 더 잘 이해하는 데 사용됩니다.

등온선, 적정, 열량계 및 표면 플라즈마 공명과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 대부분의 기관에서 이미 사용할 수 있는 기기에서 적당한 양의 샘플만 사용하여 이 방법을 몇 시간 내에 완료할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 단백질에 대한 리간드의 친화력 및 상호 작용의 상대적 강도와 같은 단백질 화학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 사용할 표본의 선택과 데이터 분석이 모두 어려울 수 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

이 절차를 시작하기 전에 다음 해결 방법을 준비합니다. 이 표에 자세히 설명된 시약과 사용 가능한 가장 높은 농도에서 관심 리간드의 원액, 그리고 이 농도의 6개의 10배 희석액을 포함하는 혼합물. 이전 데이터에서 대략적인 해리 상수를 알고 있는 경우, kd의 위와 아래에 두 개 이상의 농도를 준비하십시오.

예제 테이블이 여기에 나와 있습니다. 혼합물 18 마이크로 리터를 8 개의 웰 각각에 분취하십시오. A-Q-P-C-R 플레이트에서 나머지 7 개의 웰 각각에 첫 번째 웰에 2 마이크로 리터의 용매를 추가하고 리간드 희석 시리즈의 각 구성원에 대해 2 마이크로 리터를 추가합니다.

플레이트를 잘 밀봉하기 위해 플레이트 위에 A-Q-P-C-R 씰을 놓습니다. 접시 중앙에 핸드 어플리케이터를 놓고 씰을 한쪽으로 매끄럽게 한 다음 플레이트의 다른 절반도 반복합니다. 기포를 제거하기 위해 500배 G에서 2분 동안 플레이트를 원심분리하십시오.

그런 다음 플레이트를 1단계 QPCR 기기에 놓습니다. 암석 필터에서 용융 곡선 옵션을 선택하고 빠른 램프 속도를 선택합니다. 기기 실행이 끝날 때 열 변성을 실행합니다.

화면에서 분석 버튼을 클릭합니다. 결과 파일을 저장합니다. 단백질 열 이동 소프트웨어를 엽니다.

properties 탭에서 새 스터디를 작성합니다.이름을 지정하고 조건 탭에서 리간드에 대해 자세히 설명합니다. 실험 파일 탭으로 이동하여 저장된 결과 파일을 가져옵니다.

각각의 내용을 설정합니다. 분석 탭으로 이동하여 분석 버튼을 눌러 결과를 분석합니다. 용매가 단독으로 있는 단백질이 이 그림에 표시된 것과 유사한 결과를 제공하는지 확인하십시오.

다음으로, 반복 통증의 결과에서 관찰된 용융 온도를 조사합니다. 이것이 리간드 농도가 증가함에 따라 용융 온도의 명확한 증가를 보여주는지 확인하십시오. 이러한 데이터는 함께 제공되는 논문에 설명된 대로 해리 상수에 대한 대략적인 값을 제공하는 데 사용됩니다.

이러한 용액은 해리 상수, 이 표에 자세히 설명된 마스터 믹스 및 15가지 농도의 리간드 스톡을 결정하는 절차에 필요하며, 이는 10배로 희석됩니다. 마지막 실험에서. 이상적으로는 추정된 kd보다 두 자릿수 이상 위와 아래에 있는 리간드 농도를 포함하고, 추정된 kd에 농도를 중심에 둡니다.

석 계열의 예가 여기에 나와 있습니다. 추정된 KD의 크기 순서 내에 있는 7개의 점에 초점을 맞추고 이 양쪽에 다른 4개의 점에 초점을 맞춥니다. 선택 항목이 있는 경우 포화 상태인 값에 더 많은 점을 포함합니다.

U 바닥 96웰 플레이트의 8개 웰 각각에 120마이크로리터의 마스터 믹스를 추가하여 마스터 믹스를 편리하게 분배할 수 있는 저장소 역할을 합니다. 그런 다음 8채널 피펫을 사용하여 18마이크로리터의 마스터 믹스를 PCR 플레이트의 한 컬럼에 분주합니다. 추가로 5개의 열에 대해 반복하여 플레이트에 6 x 8 패턴으로 총 48개의 채워진 웰을 제공합니다.

다음으로, 20마이크로리터의 리간드 줄기 또는 용매를 8개의 웰 각각에 추가합니다. 다른 U 바닥 96 웰 플레이트에서 8채널 피펫을 사용하여 8개의 서로 다른 리간드 스톡 또는 용매로 구성된 2마이크로리터를 흡입하고 이를 마스터 믹스로 채워진 PCR 플레이트의 한 열에 추가합니다. 동일한 8개의 리간드 또는 용매 스톡으로 반복합니다.

2개의 추가 컬럼의 경우 나머지 8개의 리간드 또는 용매 스톡의 2마이크로리터를 흡입하고 이를 플레이트의 네 번째 컬럼에 추가합니다. 두 개의 추가 열에 대해 이 작업을 반복합니다. 이렇게 하면 16개의 리간드 및 용매 샘플 모두에 대해 3중 샘플이 제공됩니다.

플레이트 위에 A-Q-P-C-R 씰을 놓습니다. 플레이트를 500배 G로 2분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 QPCR 기기에 놓고 기기 실행이 끝날 때 이전에 지정한 파라미터를 사용하여 열 변성을 실행합니다.

화면에서 분석 버튼을 클릭합니다. 결과 파일을 저장합니다. 단백질 열 이동 소프트웨어를 엽니다.

properties 탭에서 새 스터디를 작성합니다. 이 스터디에 이름을 지정하고 conditions 탭에서 리간드를 자세히 설명합니다. 실험 파일 탭으로 이동하여 저장된 결과 파일을 가져오고 각각의 내용을 설정합니다.

그럼 분석 탭으로 이동하여 분석 버튼을 누릅니다. 화면 왼쪽의 메뉴에서 replicates(복제) 탭을 선택하여 결과를 표시합니다. 삼중으로.

삼중이 얼마나 밀접한지에 따라 데이터의 신뢰성을 평가합니다. 삼중주가 재현성이 좋지 않은 경우. 원시 데이터를 자세히 검사합니다.

볼트맨 방법 또는 파생 방법을 모두 사용하여 데이터를 분석합니다. 용융 온도를 평가하려면 반복 결과 탭을 선택하고 반복 결과 플롯에서 플롯 기준 버튼을 tm, boltzmann 및 TM derivative 간에 전환합니다. 샘플에 대한 재현성을 높이는 방법을 선택합니다.

다중 전이를 보여주는 샘플의 경우 거의 항상 다중 용융 모드에서 derivative Method를 사용하는 것이 가장 좋습니다. 내보내기 탭을 사용하여 Excel에서 추가 조사를 위해 결과를 내보냅니다. Excel에서 리간드 농도와 용융 온도에 대한 표를 만들어 이 분석을 시작합니다.

GraphPad 프리즘 소프트웨어를 열고 XY 테이블을 작성합니다. X 열은 리간드 농도에 대해, Y 열에는 용융 온도 결과를 사용하여 데이터를 입력합니다. 분석 탭에서 비선형 회귀 곡선 피팅 옵션을 선택합니다.

올바른 모형을 입력하려면 새로 만들기를 선택하고 새 방정식을 만듭니다. 적절한 방정식을 단일 부위 리간드 결합으로 삽입합니다. 초기 값에 대한 규칙 상자를 선택하고 초기 값에 대한 규칙을 입력합니다.

파라미터 P를 단백질의 최종 농도를 입력하기 위해 상수와 동일한 것으로 제한합니다. 분석을 수행하려면 분석을 선택하고, 추가 분석을 선택하여 데이터를 협력 모형에 맞추거나 데이터를 곡선에 맞춥니다. 용융 온도의 이진 이동을 보여주는 것은 함께 제공되는 프로토콜 텍스트에 설명되어 있습니다.

이 방법은 헥소키나제와 포도당의 상호 작용을 측정하는 데 사용되었습니다. 초기 화면은 0.2에서 1.7 밀리몰 사이의 KD일 가능성이 있음을 시사합니다. 더 큰 화면의 결과는 KD가 1.2 플러스 또는 마이너스 0.1 밀리몰인 단일 결합 이벤트에 대한 모델에 잘 맞음을 보여주며, 추정되는 HETO SQUA L 전이효소 WCBM은 GTP에 결합할 때 강한 열 이동을 보여줍니다.

초기 검사는 200 - 500 마이크로몰의 KD를 제안했습니다. 상세한 실험은 120 플러스 또는 마이너스 20 마이크로몰의 명백한 KD를 시사합니다. 그러나, X축에 대해 로그 척도를 사용하는 경우, 동일한 데이터의 모델과 데이터 분석 사이에 상당한 불일치가 있으며, 협력 모델이 데이터에 매우 적합하다는 것을 보여주며, 이는 WCBM이 GTPA에 대한 결합에 있어 반협조적임을 암시하며, 이는 추정 GDP 60에서 다소 특이한 결과가 관찰됩니다. 옥시 베타 D mano, Heur two oh, 에이스 WCBI.

리간드가 없고 높은 리간드 농도에서 단순한 단상 용융 패턴이 관찰됩니다. 그러나 중간 리간드 농도에서는 두 개의 뚜렷한 용융 피크가 관찰됩니다. 두 세트의 피크 사이의 전이는 biphasic melting의 전체 농도 모델링 범위에 걸쳐 용량에 따라 달라집니다.

리간드 비율의 합으로, 자유 리간드 및 높은 리간드 결과는 데이터에 좋은 적합을 제공합니다. 이 적합도는 높은 리간드 농도에 대해 관찰된 결과를 완전 점유에 대해 외삽함으로써 개선됩니다. 리간드에 결합된 WCBI의 비율에 대해 얻은 데이터는 단순 결합 모델에 대한 우수한 적합성을 보여줍니다.

KD가 58 플러스 또는 마이너스 2 마이크로 몰인 경우 이 기술을 마스터하면 이 절차에 따라 적절하게 수행하면 반복을 포함하여 4시간 또는 5시간 내에 완료할 수 있습니다. 최상부 정맥 형광 및 등온 적정 열량측정법과 같은 다른 방법을 수행하여 온도 의존성 및 STA 기하학과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 차등 스캐닝 독감을 사용하여 상호 작용의 해리 상수에 대한 추정치를 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.