동시에 듀얼 카메라 방출 분할 시스템을 사용하여 두 개의 배출 채널의 실시간 이미지를 캡처 : 응용 프로그램은 접착 셀에

본 절차의 전반적인 목표는 이중 카메라 방출 분할 시스템을 사용하여 두 가지 색상의 실시간 이미지 시퀀스를 동시에 기록함으로써 평행판 유동 챔버 부착 분석을 수행하는 것입니다. 이를 위해, 먼저 이미징 설정의 두 카메라를 정렬합니다. 그다음, 세포와 반응성 기판을 준비하고 평행판 유동 챔버를 설치합니다.

그 다음, 두 가지 색상의 이미지 획득을 위해 카메라 설정을 보정하고 카메라 정렬에 필요한 디지털 보정을 수행합니다. 이어서 이미지 시퀀스를 캡처하며, 이를 통해 높은 시간 분해능으로 이색 이미지가 획득됨을 확인합니다. 단일 카메라 시스템에 비해 듀얼 카메라 방출 분할 시스템의 장점은 각 카메라에 서로 다른 노출 시간을 할당할 수 있으며 전체 시야를 그대로 유지할 수 있다는 점입니다.

이 기술은 세포 표면의 접착 분자 국소화가 세포 이동, 염증 및 암 전이와 같은 동적인 생물학적 과정에 어떠한 영향을 미칠 수 있는지와 같이, 세포 접착 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 다음 절차에는 도립 에피 형광 현미경(inverted epi fluorescence microscope)이 필요합니다. 이 장비에는 라이트 가이드와 결합된 고강도 광원, 조합 필터 큐브 및 듀얼 카메라 방출 분할 카메라 시스템이 갖춰져 있어야 합니다.

현미경 설정은 단색 CCD 카메라로 캡처한 이미지를 수집하고 결합할 수 있는 이미징 소프트웨어가 실행 중인 컴퓨터에 연결되어 있어야 합니다. 본 과정에서는 simul picks 모듈이 포함된 stream picks five multi-camera 소프트웨어가 사용되었습니다. 작업 리본에서 stream picks five를 열고 workspace를 선택하여 시작하십시오.

그런 다음 화면 오른쪽 끝에서 워크스페이스 관리자(workspace manager)를 열고 새 워크스페이스(new workspace)를 선택하십시오. 카메라의 이름을 지정한 후, 소프트웨어 안내에 따라 미리 작성된 목록에서 카메라 모델과 일치하는 그래버(grabber)를 선택하면, 워크스페이스에 작은 카메라 아이콘이 나타나 카메라 피드가 수신되고 있음을 나타냅니다. 이제 현미경으로 촬영된 객체를 화면에서 확인할 수 있습니다.

두 번째 카메라 작업 영역에 대해 이 과정을 반복한 후, 병합된 작업 영역에 대해 다시 한 번 반복하면 모든 카메라가 사용 가능한 상태가 됩니다. 이때 오류 메시지가 나타날 수 있으며, 이는 정상적인 현상입니다. 보기 화면 우측의 도킹 패널에서 작업 영역 1과 2의 할당된 카메라들을 병합된 작업 영역으로 지정하십시오.

워크스페이스 1과 2의 이미지는 병합된 워크스페이스에서 두 개의 의사 색상 이미지로 중첩됩니다. 이 과정에서 가장 어려운 부분은 카메라 정렬입니다. 성공적인 정렬을 위해 제조사 제공 슬라이드를 사용하며, 제조사의 지침을 세심하게 준수합니다.

이중 카메라 방출 분할 시스템의 카메라 정렬을 위해, 명시야 또는 위상차 조명을 현미경 접안렌즈로 보냅니다. 제조업체에서 제공한 금속 코팅 캘리브레이션 그리드를 현미경 스테이지 위에 놓고, 그리드를 스테이지 상에서 직각으로 맞춥니다. 비닝(binning)과 자동 스케일링 없이 그리드를 표시하고 초점을 맞춘 다음, 다이크로익 하우징을 제거하지 않고 위치를 이동시켜 첫 번째 카메라를 정렬합니다.

그런 다음 seamount 포트 1의 초점 조정 다이얼을 사용하여 이미지를 다시 초점 맞춥니다. 다음으로, 다이크로익 하우징을 듀얼 채널 획득 장치에 완전히 밀어 넣어 다이크로익에 의해 이미지가 두 카메라로 분할되도록 합니다. 3/60 4분의 1인치 무두 볼트를 풀고, 두 이미지의 그리드 방향이 동일해질 때까지 female CM 마운트 포트 2의 두 번째 카메라를 회전시킵니다. C 마운트 포트 2의 초점 조정 다이얼을 사용하여 두 번째 카메라의 이미지 초점을 맞춥니다.

정렬을 마무리하려면, DC two 우측의 RL 노브를 사용하여 병합된 작업 공간에서 이미지의 오른쪽 수직 경계가 정확하게 일치할 때까지 결합된 이미지 위치를 조정하십시오. 그런 다음 UD 노브를 사용하여 가로 그리드 바가 제대로 정렬될 때까지 두 번째 이미지의 상하 정렬을 조정하십시오.

상하 정렬 중에 카메라가 약간 회전한 경우, 카메라 2의 3 5 60 4분의 1인치 나사를 풀어 표시된 이미지가 제대로 정렬될 때까지 회전시켜 이 문제를 해결하십시오. 동반 문서에 기술된 대로 LOR 5 68 및 4 88 2차 항체를 사용하여 anti CD 24와 TECA 4 5 2로 염색하여 병렬 플레이트 유동 챔버 부착 분석을 위한 BET 20 유방암 세포를 준비하십시오. 염색 후 적절한 단일 색상 대조군을 반드시 준비하십시오. 세포를 병렬 플레이트 유동 챔버의 저장조에 분주하십시오. 유동 챔버의 입구 및 출구 포트에 두 개의 별도 튜브 길이를 연결하십시오.

하나의 튜브는 0.1% PSA가 포함된 DPBS에 현탁된 표지 세포가 들어 있는 리저버에 연결합니다. 다른 튜브는 지정된 유량으로 액체를 흡입하는 시린지 펌프에 연결합니다. 진공 라인을 유동 챔버(flow chamber)에 연결하고, 렉틴을 발현하는 중국 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cells) 또는 CHO E 세포의 단층이 포함된 35mm 조직 배양 접시 위에 유동 챔버를 배치합니다.

적절한 진공 밀봉이 이루어지도록 유동 챔버와 유동 챔버 가스켓을 조정합니다. 유동 챔버 어셈블리의 밀봉 상태를 확인하면서 저장조에서 액체를 추출합니다. 마지막으로, 유동 챔버 어셈블리를 현미경 위에 배치하고 광원과 현미경 설정을 켠 후 수동으로 검사합니다.

다이크로익 하우징(dichroic housing)이 올바르게 내려간 작동 위치에 있는지 확인하고, 바이패스(bypass) 모드가 아님을 확인하십시오. 수동으로 형광 모드로 변경하고 녹색-적색 형광 필터 큐브를 선택하여 노출 시간과 게인(gain)을 각각 결정하십시오. 카메라 1에서는 적색 형광을, 카메라 2에서는 녹색 형광을 사용하여 세포를 촬영하십시오.

이미지를 얻기 위해 필요에 따라 다이크로익 미러를 수동으로 조절했습니다. 다음으로, red flora만으로 염색된 BT 20 세포 현탁액을 주입합니다. 평행 플레이트 유동 챔버의 입구 포트에 연결된 저장조에 4종의 접합 항체를 넣습니다.

시린지 펌프를 사용하여 평행 플레이트 유동 챔버(parallel plate flow chamber) 내의 choi 단층 위로 BT 20 세포를 관류시키십시오. 이미징 소프트웨어의 라이브 설정에서 카메라 1의 노출 시간을 조정하여 적색 채널 이미지를 획득하십시오. 카메라 2의 노출 시간을 카메라 1의 노출 시간과 일치시키십시오.

녹색 채널에서 이미지가 관찰된다면 블리드 스루(bleed through) 아티팩트가 존재하는 것입니다. 이 경우, 카메라 1과 카메라 2의 노출 시간을 동일하게 유지하면서, 녹색 채널에서 블리드 스루 아티팩트가 더 이상 보이지 않을 때까지 노출 시간을 줄이십시오. 필요한 경우 카메라 1의 게인(gain)을 조정하여 적색 채널의 이미지 가시성을 높이십시오.

다음으로, 저장조에서 남아 있는 BT 20 세포 현탁액을 모두 제거하고 DPBS로 교체합니다. 시린지 펌프를 사용하여 BT 20 세포가 단층 위에서 더 이상 보이지 않을 때까지 용액을 단층 위로 관류합니다. 저장조에 녹색 fluoro four 결합 항체로만 염색된 BT 20 세포 현탁액을 다시 채웁니다.

녹색 단색 컨트롤을 사용하여 카메라 보정 과정을 반복합니다. 이번에는 카메라 1로 수집한 적색 채널의 블리드스루(bleed-through) 아티팩트 없이 녹색 채널에서 세포를 촬영할 수 있도록 카메라 2의 노출 시간을 설정합니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 유체 챔버 내의 두 대의 단색 CCD 카메라에서 캡처한 이미지를 동시에 확인합니다.실험.

stream picks의 simul pics 모듈을 사용하여 양쪽 카메라에서 수집한 이미지를 병합하십시오. simul pic 또는 대체 소프트웨어의 디지털 보정 조절 기능을 사용하여 병합된 이미지의 공간적 정렬을 수행하십시오. 필요한 경우, simul PIC 모듈을 통해 수평, 수직 및 회전 조정을 하여 이미지를 보정할 수 있습니다.

이제 두 가지 색상의 이미지를 동시에 캡처할 준비가 되었습니다. 본 영상에서 설명한 듀얼 카메라 방출 분할 시스템을 입증하기 위해 평행판 흐름 챔버 부착 분석법을 사용하였습니다. 여기에 표시된 것처럼, 시스템은 빨간색으로 표시된 anti-human CD 24로 형광 표지된 BT 20 세포와 초록색으로 표시된 SCO 관련 분자에 결합하는 HECA 4 52를 검출하였습니다.

일부 구르는 세포들은 녹색 신호 없이 적색 신호만을 나타냈습니다. 다른 세포들은 적색 신호 없이 녹색 신호만을 나타냈으며, 또 다른 세포들은 적색과 녹색 신호를 모두 나타냈습니다. 카메라는 반응성 기질 위에서 흐름 방향으로 구르는 세포가 회전하고 뒤집힐 때 세포의 특징을 추적할 수 있는 광학적 및 시간적 해상도를 유지했습니다. 병합된 방출 채널을 통해 CHO e 단층에 구르고 부착되는 BT 20 세포 표면의 CD 24 및 sated 분자의 분포와 공동 국소화를 확인했습니다.

이 이미지들은 CD 24와 sated 분자가 공국소화(co localize)되어 나타나는 단일 BT 20 세포의 확대 모습으로, 빨간색과 초록색의 가색(pseudo colored) 방출 채널이 병합되었을 때 노란색에서 주황색 점으로 나타납니다. 종합적으로, 이 정보는 듀얼 카메라 방출 분할 시스템이 세포가 시야를 통해 빠르게 이동하는 유동 챔버 부착 분석과 같은 응용 분야에서 세포 및 분자적 특징을 밝히는 데 필요한 공간적, 시간적 및 광학적 해상도를 갖추고 있음을 입증합니다.

이 영상을 시청한 후에는 듀얼 카메라 방출 분할 시스템을 설정 및 보정하는 방법과 평행판 유동 챔버 부착 분석을 두 가지 색상으로 실시간 이미징하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 방법은 세포 행동 연구에 형광을 사용하는 다른 인비트로(in vitro) 분석법에도 적용할 수 있습니다.