Name: 동시에 듀얼 카메라 방출 분할 시스템을 사용하여 두 개의 배출 채널의 실시간 이미지를 캡처 : 응용 프로그램은 접착 셀에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 학습하세요 이중 카메라 방출 분할 시스템을 사용한 평행 플레이트 유동 챔버 접착 분석법으로 실시간 이중 색상 영상을 획득하는 방법을. 이 기술은 고해상도 살아있는 세포 이미징에 활용됩니다.

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저자는 통찰력 토론과 원고 검토를 위해 박사 더글러스 게츠 (학과 화학 및 생명 공학, 오하이오 대학) 박사 파비안 Benencia (바이오 메디컬학과, 오하이오 대학) 감사드립니다. 우리는 또한 도움이 기술 토론 (W. Nuhsbaum 주) 박사 크리스토퍼 Huppenbauer 감사합니다. 이 작품은 건강의 국립 과학 재단 (CBET-1106118)과 국립 연구소 (1R15CA161830-01)에서 교부금에 의해 지원되었다.

1. 소프트웨어 설치 <ol><li> StreamPix에게 SimulPix 모듈 또는 수집하고 흑백 CCD 카메라로 캡처 한 이미지를 결합 할 수있는 다른 이미징 소프트웨어와 5 멀티 카메라 소프트웨어를 구입합니다. </li><li> StreamPix 5에 대한 최소 요구 사항은 다음과 같습니다 : 1 기가 바이트 RAM 이상 2.4 GHz의 이상으로 코어 2 듀오를 장착 한 PC를. 지원 IEEE 디지털 또는 아날로그 카메라와 호환 프레임 그래버. 윈도우 XP/7/Vista 32 또는 64 비트. 해상도 1,024 × 768 이상을 지원하는 모니터. 좋은 2D 성능의 그래픽 어댑터 (OCU는 16 배 이상을 표현 권장) 및 RAID-O 구성을 기록 7,200 RPM 하드 디스크 드라이브. </li></ol> 2. 두 가지 색상을 동시에 실시간 이미징 가능 듀얼 카메라 시스템의 설치 <ol><li> MICR의 비디오 포트에 DC2 C-마운트 어댑터를 밀어 현미경에 DC2 배광 방출 스플리터, 또는 유사한 듀얼 카메라 방출 분할 장치를 연결합니다장치의 이색의 하우징에 액세스 할 수 있는지 등을 oscope. </li><li> 여성 C-마운트 (1)에 두 개의 흑백 CCD 카메라를 삽입하고 여성 2 C-마운트합니다. 동일한 카메라가 바람직하다. 유사 카메라가 사용될 수 있지만, 호환성은 내부 하드웨어, 가장 중요한 CCD 이미지 센서에 의존한다. </li><li> 두 카메라에서 이미지를 표시하는 이미징 소프트웨어를 사용합니다. 다음 단계 (2.3.1 - 2.3.4) SimulPix 모듈 StreamPix 5에 적용 및 기타 멀티 카메라 이미징 소프트웨어에 적용 할 수 있어야합니다. <ol><li> 오픈 StreamPix 5 작업 리본에서 &quot;작업 공간&quot;을 선택합니다. </li><li> 열기 &quot;작업 공간 관리자&quot;화면의 오른쪽에 위치하며, &quot;새로운 작업 공간&quot;을 선택합니다. </li><li> 카메라의 이름을 지정하면, 소프트웨어가 미리 채워진 목록에서 그래버를 선택하라는 메시지를 따르십시오. 카메라 모델과 일치하는 그래버를 선택하고 두 번째 카메라 작업 영역에 대해 반복합니다. 병합 된 작업 공간의 경우, 한 번 더 반복하지만 오류 M &quot;모든 카메라는 사용중인&quot;essage가 나타납니다. 이 메시지는 정상입니다. </li><li> 병합 작업 영역이로드되면, 작업 영역 1, 작업 영역 2에서의 뷰잉 스크린의 오른쪽에있는 도킹 패널 병합 작업 영역에 카메라를 할당. </li></ol></li><li> 듀얼 카메라 방출 분할 시스템에 카메라를 맞 춥니 다. <ol><li> 밝은 필드 또는 PlanApo 40X 목표 (또는 그 이상)를 사용하여 제조 업체에서 제공하는 교정 그리드와 위상 대조적으로 카메라를 맞 춥니 다. </li><li> 현미경 단계에 제조업체에서 제공 한 금속 코팅 보정 그리드를 배치, 현미경의 접안 렌즈로 빛을 전송하고, 현미경의 무대에서 그리드를 광장. </li><li> 초점 그리드를 가져옵니다. </li><li> 치환하지만, 카메라 1 (수동 카메라)를 정렬, 이색 주택을 제거하지 마십시오. 비닝없이 자동으로 조정하지 않고 그리드를 표시합니다. C-마운트 포트 1에 포커스 조절 다이얼을 사용하여 이미지를 초점. </li><li> 이중 channe에 이색 주택을 눌러L 취득 장치에 완전히 이미지가 모두 카메라에 다이크로 분할되도록. </li><li> 푸 세 64분의 5 &quot;나사를 설정하고 격자의 방향이 C-마운트 포트 2에 초점 조절 다이얼을 사용하여. 두 이미지에 동일한 때까지 여성 C-마운트에 대한 두 번째 카메라를 회전, 카메라에서 이미지를 가져 초점 2. </li><li> 이미징 소프트웨어의 병합 된 작업 공간에 결합 된 화상을 이용하여 얼라인먼트를 마무리. 이것은 하나 보정 그리드의 두 영상의 실시간 의사 색조 오버레이를 참조 할 수있다. DC2의 우측에만 R / L 노브를 사용하여 조합 된 이미지의 위치를​​ 조정한다. 이미지의 왼쪽 / 오른쪽 수직 경계가 정확하게 정렬 될 때까지이 노브를 조정합니다. </li><li> 수평 눈금 막대가 제대로 정렬 될 때까지 두 번째 이미지의 위 / 아래 정렬을 조정하기 위해 U / D 노브를 사용합니다. </li><li> 위 / 아래 정렬하는 동안 약간의 카메라 회전은 세 64분의 5 &quot;인치 SCRE를 풀어, 올바른이 문제가 발생하는 경우WS 카메라 2 회전에 표시된 이미지가 제대로 정렬 될 때까지. </li></ol></li></ol> 3. 평행 판 유량 용기 접착 분석에 대한 암 세포의 준비 <ol><li> 최소 필수 배지 (MEM)에서 배양 BT-20 유방암 세포는 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신을 37 ° C에서와 CO 2는 앞서 2 바와 5.0 %로 매체를 완료 보충. </li><li> 수확 암 묽은 트립신 처리를 가진 세포는 혈구와 세포를 계산합니다. </li><li> 세척 및 칼슘 및 마그네슘 (DPBS +)와 DPBS에서 소 혈청 (BSA)에서 0.1 % 알부민 10 7 세포 / ml로 세포를 일시. </li><li> 0.1 % BSA DPBS +에서 소정의 최적의 농도로, 기본 항체 정제 된 마우스 항 - 인간 CD24 정제 쥐 HECA-452 (안티 sialofucosylated 항원)을 희석. 30 분 9, 10에 대한 세포를 품어. </li><li> 1,200 rpm에서 원심 분리기 세포 세포 펠렛을 구하십시오. ASPI일차 항체를 평가하고, 0.1 % BSA, admin으로 +로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 0.1 % BSA DPBS + 소정 최적의 농도 차 항체, 염소 항 - 마우스 IgG AlexaFluor 568 (방출 최대 603 NM), 및 염소 항 - 쥐의 IgM AlexaFluor 488 (방출 최대, 519 nm의), 희석. 30 분 동안 세포를 품어. </li><li> 0.1 % BSA DPBS + 10 6 세포 / ml에서 0.1 % BSA DPBS +에 두 번 세포를 세척하고 일시 중지합니다. </li></ol> 4. 평행 판 유량 용기 접착 분석에 대한 반응성 기판의 제조 <ol><li> 35mm 조직 배양 접시 안에 맞는 평행 판 유량 용기의 입구와 출구 포트에 튜브 두 개의 길이를 연결합니다. 한 튜브는 지정된 유량 유체를 철회 할 주사기 펌프, 0.1 % BSA DPBS +와 다른 정지 표지 세포의 저장소에 연결됩니다. </li><li> 유량 용기 1 진공 라인을 연결합니다. </li><li> 35mm 조직 배양 디에 유량 용기의 위치를SH E-셀렉틴 (E-CHO)를 발현하는 중국어 햄스터 난소 세포의 단층을 함유. CHO-E 세포는 37 ° C에서 MEM 완전 배지에서 성장과 5.0 %의 CO 2했다. </li><li> 적절한 진공 밀봉 1을 보장하기 위해 유량 용기 및 / 또는 흐름 챔버 가스켓을 조정합니다. </li><li> 적절한 도장과 기포 형성 (1)의 더 시각적 인 증거를 유량 용기 어셈블리를 모니터링, 저수지에서 유체를 철회. </li><li> 현미경 (라이카 DMI 6000B)에 유량 용기 어셈블리를 놓고 1. </li></ol> 5. 두 가지 색의 이미지 수집 <ol><li> 라이트 가이드에 높은 강도의 빛과 쌍을 생성하는 전원 라이카 EL-6000 소형 광원, 또는 유사한 장치. 원하는 색 / 강도의 형광 물질을 자극하기 위해, 조합 필터 큐브, 즉 G / R (그린 / 레드) 필터 큐브를 통해 빛을 통과 거꾸로 현미경을 사용합니다. </li><li> 이색 하우징 (우울) 올바른 운영 위치에 있고 확인바이 패스 모드에 있지. </li><li> 형광 모드에서 현미경을 운영하고 (빨강, 녹색 /) 적절한 형광 필터 큐브를 선택합니다. </li><li> 카메라 1의 노출 시간과 이득 결정 (적색, 620 ± 60 nm의) 카메라 2 (녹색, 535 ± 40 nm 정도). <ol><li> 모두 적색 및 녹색 발광 채널의 이미지를 얻기 위해 이색 우울. 단지 적색 형광 물질로 표지 된 세포와 유동 챔버 분석을 사용하여 이미징 소프트웨어의 &quot;라이브 설정&quot;에서 카메라 (1)의 노광 시간을 조정하여 적색 채널에 화상을 얻었다. </li><li> 카메라 1의 노출 시간에 2 번 카메라의 노출 시간을 맞 춥니 다. 이미지는 녹색 채널에서 관찰되는 경우, 블리드 - 스루 아티팩트가 존재하고 두 카메라의 노출 시간이 감소 될 필요가있다. </li><li> 비쳐 아티팩트가 더 이상 녹색 채널에 보일 때까지 노출 시간을 감소시키지 카메라 1과 카메라 2에 상응하는 노출 시간을 유지. 이미지 visibilit을 개선하기 위해 카메라 1의 게인을 조정필요한 경우 빨간색 채널 Y. </li><li> 단지 녹색 형광으로 표지 된 세포와 5.4.3하지만, 카메라 (1)에 의해 수집 된 빨강 채널에서 비쳐 유물없이 녹색 채널의 이미지 셀에 카메라 2 노출 시간을 정의 - 반복 5.4.1 단계를 반복합니다. </li><li> Retitrate 항체 비쳐 유물 (11)를 제거하거나 카메라 1과 카메라 2의 노출 시간이 상당히 다른 경우 예를 들어, 이미지가 일시적으로 잘못 정렬 될 수 있습니다 합병이 할 수없는 경우. </li></ol></li><li> 동시에 흐름 챔버 실험에서 두 개의 흑백 CCD 카메라에서 촬영 된 이미지를 볼 수 이미징 소프트웨어를 사용합니다. </li><li> Streampix 5 SimulPix 모듈 또는 다른 소프트웨어 패키지를 사용하여 두 카메라에서 수집 한 이미지를 병합합니다. </li><li> 필요한 경우 공간적으로, 병합 된 이미지를 정렬 SimulPix 또는 다른 소프트웨어의 디지털 보정 조정을 사용합니다. 이미지는 수평, 수직의 SimulPix 모듈을 보정 할 수있다, 및 회전 조정. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

듀얼 카메라 방출 분할 시스템은 세포 또는 분자 운동이 급속 응용 프로그램에서 높은 품질의 이미지를 캡처하는 데 필요한, ​​공간 시간 및 광학 해상도를 가지고 있습니다. 대표적인 결과를 생성, 소프트웨어 설정 및 카메라 설정을 포함하여 듀얼 카메라 방출 분할 시스템의 매개 변수는, 압연 부착 세포가 공간적으로 시간적으로 정렬 된에 병합 된 이미지 시퀀스를 얻기 위해 최적화되었다. 어긋남이 모두 녹색과 적색 채널에서 롤 관찰 하나의 셀이 병합 된 작업 공간에서 두 개의 롤링 세포로 나타날 수 있습니다 제대로 조사 물리적 현상을 전달하지 않는 이미지, 예를 초래할 수 있으므로이 최적화 단계는 중요합니다. 프로토콜의 단계 2.4에 설명 된 것처럼 카메라가 물리적으로 정렬 할 때 공간 정렬은 듀얼 카메라 방출 분할 시스템의 설치에 달성해야한다. 이미지 존을의 공간 맞춤 디지털 교정카메라에 의해이라는 군은 이미징 소프트웨어 (단계 5.7 및 그림 5)에서 디지털 맞춤 설정을 통해 (들),...

이러한 면역 염색과 같은 세포 표면 분자를 분석하는 방법은, 화학적으로 표적 분자의 검출을 허용 형광체에 접합되는 프로브를 사용한다. 라이브 세포 이미징 및 유체 흐름 기반 세포 부착 분석법은 일반적으로 셀룰러 및 / 또는 분자 레벨 1, 2에서 생리적 과정을 포착하도록 설계된 모노크롬 CCD 카메라로 기록된다. 이 카메라는 빠른 프레임 속도 (초당 30 프레임 이상)을 제공하고, (- 빠른 프레임 속도와 짧은 노출 시간에) 뛰어난 시간 해상도를 제공, 매우 민감하다. 그러나, 흑백 카메라는 이미지를 수집하기 위해 (하나의 형광을 검출) 하나의 배출 채널을 캡처 할 수 있습니다. 단일 카메라 발광 분리 시스템은 다수의 발광 채널을 캡처 혼입하지만 종종 시야를 감소시키고 모든 채널을 이미징하는 동일한 노출 시간을 필요로 할 수있다. multip로 표지 세포의 전체 컬러 스펙트럼을 캡처하려면르는 컬러 카메라가 대안으로 사용될 수 있으며, 형광체. 그러나, 컬러 카메라는 특정 응용 프로그램에서 라이브 셀 이미징에 원하는 시간 해상도를 제공 일반적으로 할 수 없습니다. 또 다른 촬상 장치는 높은 시간 해상도를 유지하면서 다수의 파장에서 이미지 생균에 유익되는 애플리케이션을 위해 필요하다. 주요한 실험 애플리케이션은 세포 잠재적 반응성 기판 1, 3 위에 생리학 관련 조건으로 관류되는 평행 평판 유동 챔버 부착 분석법이다. 특정 세포 표면 분자를 표현 흐름에있는 세포 접착과 같은 부착 분자 또는 표면 흡착 된 세포 외 기질 단백질 (4, 5)을 발현하는 세포의 단층으로서 기판 상에 롤있다. 롤링 세포는 두 번째의 분수에 회전 및 병진 운동을 겪을 수있다. 롤링과 같은 세포 표면 분자의 클러스터를 부착 한 세포에 대한 분자의 특징도 potenti있을알은 세포 표면에 활성 개편을 받아야합니다. 따라서, 영상 시스템은 뛰어난 시간 해상도를 제공해야합니다 (초 이상 초당 30 프레임 및 노출 시간 &quot;거의 0&quot;) 셀이 6, 7 롤링의 단계별 진행 상황을 보여줍니다 이미지 시퀀스를 생성 할 수 있습니다. 듀얼 카메라 발광 분리 시스템은 다수의 형광으로 표지 된 세포 이미징을위한 이러한 요구를 충족시킬 수있다. 이중 사진기 방출 분할 시스템보기의 전체 필드를 유지하면서 동시에 두 개의 공간적으로 동일하지만 형광 고유의 이미지를 캡처하는 두 개의 유사한 카메라에 필터 형광 채널을 분할. 이 기술은 각 채널에서 실시간으로 촬영 된 화상의 직접적인 비교를 가능하게하고, 사용자가 신속하게 다른 이미징 기능과 카메라 모델 사이를 전환 할 수있다. 이 기능은 더 나은 시스템을 캡처 할 수있는 하나의 카메라에서 이미지 캡처 설정을 조정하는 데 유용합니다다른 강도, 수명, 그리고 멸종 계수 8 형광. 이미징 소프트웨어와 결합, 듀얼 카메라 방출 분할 시스템은 여러 파장의 라이브 셀 이미징 분석의 실시간 기록을 허용하고 세포 행동을 연구하기 위해 형광을 사용하여 시험 관내 분석을 향상시킬 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">시약/재료</td></tr><tr><td>BT-20 세포</td><td>ATCC</td><td>HTB-19</td><td></td></tr><tr><td>CHO-E 세포</td><td>R. Sackstein 박사(Brigham and Women')의 선물 s 병원, 하버드 의과대학)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM </td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30024.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신 / 0.1% EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30031.01</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+</td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>HECA-452 단클론 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>555946</td><td></td></tr><tr><td>Anti-human CD24 monoclonal 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>555426</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rat IgM AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21212</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG AlexaFluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11004</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[헤더]</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>EXi Blue Fluorescence Microscopy Digital CCD Camera</td><td>Q Imaging</td><td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Retiga EXi FAST 1394 Digital CCD Camera</td><td>Q Imaging</td><td>RET-EXi-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>DC2 Emission Splitter</td><td>Photometrics</td><td>DC2</td><td></td></tr><tr><td>도립 형광 현미경</td><td>Leica</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>Streampix 5 소프트웨어</td><td>Norpix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

동시에 듀얼 카메라 방출 분할 시스템을 사용하여 두 개의 배출 채널의 실시간 이미지를 캡처 : 응용 프로그램은 접착 셀에

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

세포막의 특정 분자를 검출하는 다색 면역 형광 현미경 동적 유동 조건 하에서 세포 부착을 규제 메커니즘을 조사하는 평행 판 유동 챔버 분석법으로 연결될 수있다. 예를 들어, 다 형광으로 표지 된 암세포는 암 전이의 메커니즘을 모델링하는 잠재적 반응성 기판을 통해 관류 될 수있다. 그러나 실시간 라이브 세포 분석을위한 이미지 수집의 멀티 채널 단일 카메라 시스템 및 컬러 카메라 전시 단점. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 동시에 유량 용기에 형광 표지 세포의 실시간 이미지 시퀀스를 캡처하는 듀얼 카메라 방출 분할 시스템을 사용했다. 듀얼 카메라 발광 분할 시스템 필터 정의 파장함으로써 동시에이 공간적으로 동일하지만 형광 특정 화상 촬영이 모노크롬 CCD 카메라로 배열한다. 이어서, psuedocolored 1 채널 이미지는 단일로 결합실시간 세포가 관심 영역에 걸쳐 빠른 속도로 이동하는 여러 표적 분자를 공개 할 수 순서를 합병했다.

병렬 플레이트 흐름 챔버 접착 분석은 동시에 두 개의 발광 채널에서 실시간 이미지 시퀀스를 캡처 한 듀얼 카메라 방출 분할 시스템 (그림 1)를 설명하는 데 사용되었다. 듀얼 카메라 방출 분할 시스템은 형광 항 - 인간 CD24과 HECA-452 (sialofucosylated 항원을 검출) 단일 클론 항체 및 적절한 보조 항체 (그림 2)으로 표시 한 BT-20 세포를 발견했습니다. 일부 압연 세포가 빨간 신호 (CD24) 아직 발견 할 수없는 녹색 신호 (HECA-452)이 표시, 다른 사람은 녹색 신호 탐지 빨간 신호를 표시하고, 또 다른 세포는 (그림 2) 신호 빨간색과 녹색을 모두 표시됩니다. 합병 배출 채널은 BT-20 세포에 압연 및 CHO-E 단층에 부착 (그림 3과 4)의 표면에 CD24 및 sialofucosylated 분자의 분포와 colocalization을을 공개했다. 듀얼 카메라 방...

두 가지 색상의 형광 현미경을위한 듀얼 카메라 방출 분할 시스템은 뛰어난 광학 및 시간 해상도, 병렬 플레이트 흐름 챔버 접착 분석을 포함하여 특정 살아있는 세포 분석의 요구 사항과 실시간 이미지 시퀀스를 생성합니다. 소프트웨어가 동시에 취득한 발광 채널의 이미지를 병합하기 위해 사용될 때, 모조 착색 이미지 시퀀스가​​ 생성된다.

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

본 절차의 전반적인 목표는 이중 카메라 방출 분할 시스템을 사용하여 두 가지 색상의 실시간 이미지 시퀀스를 동시에 기록함으로써 평행판 유동 챔버 부착 분석을 수행하는 것입니다. 이를 위해, 먼저 이미징 설정의 두 카메라를 정렬합니다. 그다음, 세포와 반응성 기판을 준비하고 평행판 유동 챔버를 설치합니다.그 다음, 두 가지 색상의 이미지 획득을 위해 카메라 설정을 보정하고 카메라 정렬에 필요한 디지털 보정을 수행합니다. 이어서 이미지 시퀀스를 캡처하며, 이를 통해 높은 시간 분해능으로 이색 이미지가 획득됨을 확인합니다. 단일 카메라 시스템에 비해 듀얼 카메라 방출 분할 시스템의 장점은 각 카메라에 서로 다른 노출 시간을 할당할 수 있으며 전체 시야를 그대로 유지할 수 있다는 점입니다.이 기술은 세포 표면의 접착 분자 국소화가 세포 이동, 염증 및 암 전이와 같은 동적인 생물학적 과정에 어떠한 영향을 미칠 수 있는지와 같이, 세포 접착 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 다음 절차에는 도립 에피 형광 현미경(inverted epi fluorescence microscope)이 필요합니다. 이 장비에는 라이트 가이드와 결합된 고강도 광원, 조합 필터 큐브 및 듀얼 카메라 방출 분할 카메라 시스템이 갖춰져 있어야 합니다.현미경 설정은 단색 CCD 카메라로 캡처한 이미지를 수집하고 결합할 수 있는 이미징 소프트웨어가 실행 중인 컴퓨터에 연결되어 있어야 합니다. 본 과정에서는 simul picks 모듈이 포함된 stream picks five multi-camera 소프트웨어가 사용되었습니다. 작업 리본에서 stream picks five를 열고 workspace를 선택하여 시작하십시오.그런 다음 화면 오른쪽 끝에서 워크스페이스 관리자(workspace manager)를 열고 새 워크스페이스(new workspace)를 선택하십시오. 카메라의 이름을 지정한 후, 소프트웨어 안내에 따라 미리 작성된 목록에서 카메라 모델과 일치하는 그래버(grabber)를 선택하면, 워크스페이스에 작은 카메라 아이콘이 나타나 카메라 피드가 수신되고 있음을 나타냅니다. 이제 현미경으로 촬영된 객체를 화면에서 확인할 수 있습니다.두 번째 카메라 작업 영역에 대해 이 과정을 반복한 후, 병합된 작업 영역에 대해 다시 한 번 반복하면 모든 카메라가 사용 가능한 상태가 됩니다. 이때 오류 메시지가 나타날 수 있으며, 이는 정

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

따라서, 그것이 관여 단백질의 공간적 및 시간적 행위를 파악하는 것이 중요 신호 전달 이해하기 위해, 플라즈마 막 내에서 또는 세포 내 위치에 두 단백질의 compartmentalization 크게 신호 결과에 영향을 미칠 수있는 규제 메커니즘입니다. 우리는 여기서 T 세포의 신호 전달을 연구하는 TIRF 현미경 기반 시스템을 설명하지만, 광범위하게 적용됩니다.

실시간, TCR의 동시 이미징 및 관련 신호 전달 단백질에 대한 TIRF 현미경 기법

포스터 공명 에너지 전달은 (걱정) 현미경 기자 등 다양한 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 강력한 기술이다. 여기 어떻게 사용자 정의 epifluorescence를 구축하는 것은 상업적으로 이용 가능한 구성 요소와 방법을 실험을 안달을 위해 사용하는 방법에서 영상 시스템을 초조해 설명합니다.

Unimolecular 바이오 센서를 사용하여 라이브 세포에서 이벤트를 신호의 실시간 모니터링을위한 현미경을 안달

출처: Bello-Gamboa, A. et al., 인간 면역학적 시냅스 이미징.J. Vis. 특급(2019년) 이 비디오는 형광 현미경을 사용하여 항원 제시 세포와 보조 T 림프구 사이의 면역학적 시냅스 형성에 대한 체외 연구를 보여줍니다. 보조 T 림프구의 T 세포 수용체는 항원 제시 세포의 항원-MHC-II 복합체와 상호 작용하여 면역학적 시냅스를 형성한 후 시냅스를 향한 분비 소포 이동이 이어지며, 이는 형광 현미경으로 시각화됩니다.

보조 T 세포와 항원 제시 세포 사이의 면역학적 시냅스 형성

출처: Kulkarni, M. et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (2015)이 비디오는 형질전환 마우스 망막의 원뿔 광수용체에서 칼슘 역학을 모니터링하기 위해 이광자 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 망막 절편을 준비하고, FRET 기반 칼슘 바이오센서를 이미징하고, 형광 변화를 분석하여 배경 조명 및 빛 자극 하에서 칼슘 수치를 정량화하는 단계를 간략하게 설명합니다.

마우스 망막 원뿔 광수용체의 칼슘 역학을 모니터링하기 위한 이광자 현미경 검사

우리는 T 세포 활성화 과정 중에 단백질 역학에 대한 통찰력을 제공하는 라이브 세포 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 정량적 인 결과는 T 세포 활성화에 걸쳐 복잡한 형성 신호를 따라 열매를 산출하는 T 세포의 확산 분석, 공 촛점 현미경 및 이미징 분석의 결합 사용을 보여줍니다.

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

우리는 형광 광 활성화 국소화 현미경(FPALM)을 사용하여 세포 내에서 여러 유형의 형광 표지 분자를 동시에 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 설명된 기술은 단일 세포 내에서 수십 나노미터의 정밀도로 수천 개에서 수십만 개의 개별 형광 표지 단백질의 국소화를 산출합니다.

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징)

여기, 우리 살아있는 세포의 세포에 단일 막 단백질의 다 색 지역화에 대 한 프로토콜을 제시. Fluorophores 연결할 자체 라벨 단백질 사용 됩니다. 단백질, 세포 기관이 동일한의 다른 막 구획에 있는 ~ 18의 정밀도로 지역화할 수 nm.

살아있는 포유류 세포의 세포에서 단일 막 단백질의 다 색 지역화 현미경

여기에 우리가 현재 기존의 피 형광 이미징, 단일 분자 검출 기반 슈퍼 해상도 이미징, 및 다중 색상 단일 분자 검출 병합, 통합된 현미경 시스템 구축의 실용적인 가이드 포함 단일 분자 형광 공명 에너지 비용 효율적인 방법으로 하나의 설정으로 이미지를 전송 합니다.

실시 한 형광 현미경으로 여러 영상 모드

신속 하 고 높은 해상도 허용 하는 고급 현미경, 고립 된 플라즈마 멤브레인와 주변 세포내 볼륨의 이미지를 제시 한다. 회전 디스크 및 총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 한 설정의 통합 3.5까지 높은 수집 속도에서 라이브 이미징 실험을 허용 이미지 스택 당 s.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

우리는 살아있는 세포의 혈장 막에서 리간드 결합에 의해 유도된 mEGFP 태그-수용체 올리고머의 평균 올리고머 상태의 측정을 위한 이미징 접근법을 기술한다. 이 프로토콜은 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 검사법과 숫자 및 밝기(N&amp;B) 분석을 기반으로 합니다.

총 내부 반사 형광 현미경 검사법에 의해 살아있는 세포에 있는 세포 표면 수용체의 올리고머화 역학 은 수 및 밝기 분석과 결합됩니다

이 프로토콜은 적극적으로 수축심장 trabecula ex vivo에서sarcomere, 칼슘 및 거시적 기하학적 기하학적 데이터의 컬렉션을 제공합니다. 이러한 동시 측정은 세 가지 이미징 양식의 통합에 의해 가능하게됩니다.

동시 브라이트필드, 형광, 및 수축 심장 Trabeculae Ex Vivo의 광학 일관성 지형 이미징

학습하세요 이중 카메라 방출 분할 시스템을 사용한 평행 플레이트 유동 챔버 접착 분석법으로 실시간 이중 색상 영상을 획득하는 방법을. 이 기술은 고해상도 살아있는 세포 이미징에 활용됩니다.

동시에 듀얼 카메라 방출 분할 시스템을 사용하여 두 개의 배출 채널의 실시간 이미지를 캡처 : 응용 프로그램은 접착 셀에

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