동시에 듀얼 카메라 방출 분할 시스템을 사용하여 두 개의 배출 채널의 실시간 이미지를 캡처 : 응용 프로그램은 접착 셀에

이 절차의 전반적인 목표는 듀얼 카메라 방출 분할 시스템을 사용하여 병렬 플레이트 플로우 챔버 접착 분석을 수행하여 실시간 이미지 시퀀스를 두 가지 색상으로 동시에 기록하는 것입니다. 이를 위해 이미징 설정에 있는 두 대의 카메라가 먼저 정렬됩니다. 다음으로, 셀과 반응성 기판을 준비하고 병렬 플레이트 흐름 챔버를 설정합니다.

그런 다음 두 가지 컬러 이미지 획득을 위해 카메라 설정을 보정하고 카메라 정렬에 필요한 디지털 보정을 수행합니다. 그런 다음 높은 시간 해상도를 가진 이중 색상 이미지를 획득했음을 보여주는 이미지 시퀀스를 캡처합니다. 단일 카메라 시스템에 비해 듀얼 카메라 방출 분할 시스템의 장점은 각 카메라에 다른 노출 시간을 할당할 수 있고 전체 시야가 유지된다는 것입니다.

이 기술은 세포 표면에 있는 접착 분자의 국소화가 세포 이동, 염증 및 암 전이와 같은 동적 생물학적 과정에 어떤 영향을 미칠 수 있는지와 같은 세포 접착 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 다음 절차에는 도립 에피 형광 현미경이 필요합니다. 여기에는 라이트 가이드에 결합된 고강도 광원, 조합 필터 큐브 및 듀얼 카메라 방출 분할 카메라 시스템이 장착되어야 합니다.

현미경 설정은 흑백 CCD 카메라로 캡처한 이미지를 수집하고 결합할 수 있는 이미징 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터에 연결해야 합니다. 여기서 스트림 픽 5 멀티 카메라 소프트웨어는 simul picks 모듈과 함께 사용됩니다. 먼저 작업 리본에서 스트림 선택 5개를 열고 작업 영역을 선택합니다.

그런 다음 화면 맨 오른쪽에서 작업 공간 관리자를 열고 새 작업 공간을 선택합니다. 카메라 이름을 지정한 후 소프트웨어 프롬프트에 따라 미리 채워진 목록에서 선택하고 카메라 모델과 일치하는 그래버를 선택하면 작업 공간에 작은 카메라 아이콘이 나타나 카메라 피드가 수신되었음을 나타냅니다. 현미경으로 이미지화한 물체를 이제 화면에서 볼 수 있습니다.

두 번째 카메라 작업 공간에 대해 이 프로세스를 반복한 다음 병합된 작업 영역에 대해 이 프로세스를 한 번 더 반복하면 모든 카메라가 사용 중입니다. 오류 메시지가 나타납니다. 이 메시지는 작업 공간 1과 2에서 보기 화면의 오른쪽에 있는 도킹 패널의 병합된 작업 공간으로 카메라를 할당하는 정상적인 것입니다.

작업 공간 1과 2의 이미지는 병합된 작업 공간에서 두 개의 의사 색상 이미지로 겹쳐집니다. 이 절차에서 가장 어려운 부분은 카메라 정렬입니다. 성공을 보장하기 위해 제조업체의 지침을 꼼꼼하게 따르면 제조업체 슬라이드를 사용합니다.

듀얼 카메라 방출 분할 시스템에서 카메라를 정렬하려면 명시야 또는 위상차 광을 현미경 접안렌즈로 보냅니다. 제조업체가 제공한 금속 코팅된 보정 그리드를 현미경 스테이지에 놓고 현미경 스테이지에서 그리드를 정사각형으로 만듭니다. 비닝 없이 자동 스케일링 없이 그리드를 표시하고 초점을 맞춘 다음 이동하되 카메라 1을 정렬하기 위해 이색성 하우징을 제거하지 마십시오.

그런 다음 해산 포트 1의 초점 조정 다이얼을 사용하여 이미지의 초점을 다시 맞춥니다. 다음으로, 이색성 하우징을 듀얼 채널 획득 장치에 완전히 밀어 넣어 이미지가 이색성에 의해 두 카메라로 분할되도록 합니다. 3 5 60 4인치 고정 나사를 풀고 C 마운트 포트 2의 초점 조정 다이얼을 사용하여 그리드의 방향이 두 이미지에서 동일할 때까지 암 CM 마운트 포트 2에서 두 번째 카메라를 회전하고 카메라 2의 이미지에 초점을 맞춥니다.

정렬을 완료하려면 DC 2의 오른쪽에 있는 RL 노브를 사용하여 오른쪽 리프트까지 결합된 이미지 위치를 조정합니다. 이미지의 수직 경계는 병합된 작업 공간에서 정확하게 정렬됩니다. 그런 다음 UD 노브를 사용하여 수평 그리드 막대가 제대로 정렬될 때까지 두 번째 이미지의 상하 정렬을 조정합니다.

상향 정렬 중에 카메라가 약간 회전하는 경우 카메라 2의 3 5 60 4인치 나사를 풀고 표시된 이미지가 제대로 정렬될 때까지 회전하여 이 문제를 해결하십시오. 첨부 문서에 설명된 대로 LOR 5 68 및 4 88 2차를 사용하여 안티 CD 24 및 TECA 4 5 2로 염색하여 병렬 플레이트 흐름 챔버 접착 분석을 위한 BET 20 유방암 세포를 준비하고, 병렬 플레이트 흐름 챔버의 저장소로 디스펜싱 세포를 염색한 후 적절한 단색 대조군을 준비해야 합니다. 두 개의 별도 길이의 튜브를 흐름 챔버의 입구 및 출구 포트에 연결합니다.

하나의 튜브는 0.1% PSA를 함유한 DPBS plus에 현탁된 라벨링된 세포가 포함된 저장소에 연결됩니다. 다른 튜브를 주사기 펌프에 연결하면 지정된 유속으로 유체를 회수합니다. 진공 라인을 플로우 챔버에 연결하고 렉틴 또는 cho e 세포를 발현하는 중국 햄스터 난소 세포의 단층이 들어 있는 35mm 조직 배양 접시 위에 플로우 챔버를 배치합니다.

적절한 진공 밀봉을 보장하기 위해 플로우 챔버와 플로우 챔버 개스킷을 조정하십시오. 저장소에서 유체를 빼내고 적절한 밀봉을 위해 흐름 챔버 어셈블리를 모니터링합니다. 마지막으로, 플로우 챔버 어셈블리를 현미경에 놓고 광원의 전원을 켜고 수동 검사로 현미경을 설정합니다.

이색성 하우징이 올바른 눌린 작동 위치에 있고 바이패스 모드에 있지 않은지 확인하십시오. 수동으로 형광 모드로 변경하고 녹색 빨간색 형광 필터 큐브를 선택하여 노출 시간과 게인을 별도로 결정합니다. 카메라 1의 빨간색 형광과 카메라 2의 녹색 형광을 사용하여 세포를 이미지화합니다.

이미지를 얻기 위해 필요에 따라 dichroic을 수동으로 눌렀습니다. 다음으로, 붉은 식물상으로만 염색된 BT 20 세포의 현탁액을 증착합니다. 병렬 플레이트 흐름 챔버의 입구 포트에 연결된 저장소에 있는 4개의 접합 항체.

주사기 펌프를 사용하여 BT 20 셀을 병렬 플레이트 플로우 챔버의 choi 단층 위로 관류합니다. 이미징 소프트웨어의 라이브 설정에서 카메라 1의 노출 시간을 조정하여 빨간색 채널의 이미지를 얻습니다. 카메라 2의 노출 시간을 카메라 1의 노출 시간과 일치시킵니다.

녹색 채널에서 이미지가 관찰되면 아티팩트를 통한 블리드가 있는 것입니다. 이 경우 카메라 1과 카메라 2의 노출 시간을 동일하게 유지하고 녹색 채널에서 블리드 스루 아티팩트가 더 이상 보이지 않을 때까지 노출 시간을 줄이십시오. 필요한 경우 카메라 1의 게인을 조정하여 빨간색 채널의 이미지 가시성을 향상시킵니다.

그런 다음 저장소에서 남아 있는 BT 20 셀 현탁액을 제거하고 현탁액을 DPBS로 교체합니다. 주사기 펌프를 사용하여 BT 20 세포가 단층에서 더 이상 보이지 않을 때까지 초이 단층 위에 용액을 관류합니다. 녹색 플루오로 4개의 접합 항체로만 염색된 BT 20 세포의 현탁액으로 저장소를 다시 채웁니다.

녹색 단색 컨트롤을 사용하여 카메라 보정 프로세스를 반복합니다. 이번에는 카메라 2로 노출 시간을 정의하여 카메라 1이 수집한 빨간색 채널의 아티팩트를 통해 번짐 없이 녹색 채널의 셀을 이미지화합니다. 이미징 소프트웨어를 사용하여 플로우 챔버에 있는 두 개의 흑백 CCD 카메라에서 캡처한 이미지를 동시에 볼 수 있습니다. 실험.

스트림 선택의 simul pics 모듈을 사용하여 두 카메라에서 수집된 이미지를 병합합니다. simul pic 또는 대체 소프트웨어에서 디지털 보정 조정을 사용하여 병합된 이미지를 공간적으로 정렬할 수 있습니다. 필요한 경우 수평, 수직 및 회전 조정을 위해 simul PIC 모듈로 이미지를 수정할 수 있습니다.

이제 이 시스템을 사용하여 두 개의 컬러 이미지를 동시에 캡처할 준비가 되었습니다. 이 비디오에 설명된 이중 카메라 방출 분할 시스템을 시연하기 위해 병렬 플레이트 흐름 챔버 접착 분석이 사용되었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 시스템은 빨간색으로 표시된 anti-human CD 24와 녹색으로 표시된 SCO 관련 분자에 결합하는 HECA 4 52로 형광 표지된 BT 20 세포를 검출했습니다.

일부 롤링 셀은 빨간색을 표시했지만 녹색 신호는 표시하지 않았습니다. 다른 셀은 녹색 신호를 표시했지만 빨간색 신호는 표시하지 않았으며 다른 셀은 빨간색과 녹색 신호를 모두 표시했습니다. 여기. 카메라는 광학 및 시간 해상도를 유지하여 세포가 반응성 기질에서 흐름, 병합 방출 채널의 방향으로 굴러갈 때 세포의 특징을 추적하기 위해 광학 및 시간 해상도를 유지했으며, BT 20 세포의 표면에서 CD 24 및 sated 분자의 분포 및 공동 국소화를 보여주었으며, 세포는 CHO e 단층에 굴러 부착되어 부착되었습니다.

이 이미지는 CD 24와 sated 분자가 함께 국소화되고 빨간색과 녹색 의사 색상 방출 채널이 병합될 때 노란색에서 주황색 반점으로 나타나는 단일 BT 20 세포의 확대/축소를 보여줍니다. 함께 복용하면 됩니다. 이 정보는 듀얼 카메라 방출 분할 시스템이 세포가 시야를 통해 빠르게 이동하는 플로우 챔버 접착 분석과 같은 응용 분야에서 세포 및 분자 특성을 드러내는 데 필요한 공간적, 시간적, 광학적 해상도를 가지고 있음을 보여줍니다.

이 비디오를 시청한 후에는 듀얼 카메라 방출 분할 시스템을 설정 및 보정하는 방법 또는 병렬 플레이트 플로우 챔버 접착 분석을 두 가지 색상으로 실시간으로 이미징하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 방법은 형광을 사용하여 세포 거동을 연구하는 다른 in vitro assay에 적용할 수 있습니다.