Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Kimberly Young; Helena Morrison

doi:10.3791/57648

Microglia 형태학 Immunohistochemistry 조직 ImageJ를 사용 하 여 준비의 Photomicrographs에서 측정

JoVE Journal
Neuroscience

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Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia 형태학 Immunohistochemistry 조직 ImageJ를 사용 하 여 준비의 Photomicrographs에서 측정

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June 5, 2018

DOI: 10.3791/57648-v

Kimberly Young¹, Helena Morrison¹

¹College of Nursing,University of Arizona

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This article presents a protocol for quantifying microglia morphology using ImageJ, focusing on the analysis of immunohistochemically prepared brain tissue. The method aims to explore variations in microglial shape linked to neuroinflammatory conditions, addressing crucial aspects of microglial function in both health and disease.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Cell Biology
Immunology

Background

Microglia serve as the primary immune cells in the brain, responding to physiological changes.
Quantitative analysis of microglia morphology can provide insights into neuroinflammation.
This protocol utilizes non-proprietary software, ensuring accessibility for screening various brain regions.
High-throughput methods facilitate the detection of subtle morphological differences.

Purpose of Study

To enable detailed analysis of microglia morphology in healthy versus diseased brain states.
To employ continuous data metrics (e.g., cell ramification) for more precise assessments.
To address key neuroinflammatory questions regarding microglial form and function.

Methods Used

The analysis is performed on immunohistochemically prepared brain tissue utilizing ImageJ.
Techniques such as skeletonization and fractal analysis are employed to quantify microglial morphology.
Steps include adjustment of brightness/contrast, binary conversion, and applying various filters.
Statistical analysis and data trimming are detailed to ensure robust results.
Recommendations for isolating cells and analyzing specific regions of interest (ROIs) are included.

Main Results

Quantitative outputs include endpoints and branch length measures per cell across different conditions.
Initial findings show trends in microglial morphology that may vary based on injury state.
The analysis highlights the significance of morphological variability in microglial function during inflammation.
Inter-user variability impacts data significance but remains consistent in trend direction.

Conclusions

This study provides a detailed, reproducible protocol for assessing microglial morphology quantitatively.
It enhances understanding of microglial dynamics in health and disease, offering implications for neuroinflammatory research.
The outlined methods foster adaptability in analyses tailored to specific research needs.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of the ImageJ analysis protocol?

The ImageJ protocol allows for high-throughput analysis of microglial morphology without requiring proprietary software, making it accessible for broader applications.

How is the biological model implemented in this study?

The study utilizes immunohistochemically prepared brain tissues, allowing for assessment of microglial morphology in various cortical regions associated with neuroinflammation.

What types of data are gathered from the procedure?

Data collected includes metrics on cell ramification and complexity, as well as total endpoints and branch lengths, facilitating a quantitative understanding of microglial morphology.

Can the method be adapted for different research needs?

Yes, the protocol is designed to be flexible, allowing modifications to meet specific experimental requirements while maintaining the integrity of the morphological analysis.

What limitations should researchers consider?

Inter-user variability in protocol application can affect data significance; care should be taken to standardize methodology as much as possible to limit discrepancies.

Microglia 두뇌 면역 세포를 조사 하 고 양적 평가 될 수 있는 형태 론 적 변화를 통해 변경 된 두뇌 생리학에 반응 하는. 이 프로토콜 개요는 ImageJ 셀 분파, 복잡성, 모양 등 통계에 따라 연속 데이터 microglia 형태를 나타내는 분석 프로토콜을 기반으로 합니다.

이러한 골격 및 프랙탈 분석 방법의 전반적인 목표는 본질적으로 처리량이 많고 세포 모양의 작은 차이를 감지하기 위해 민감한 정량적 방법을 사용하여 IHC 준비 조직에서 미세아교세포의 형태를 측정하는 것입니다. 이 방법은 건강과 질병 중 미세아교세포 형태와 기능의 뉘앙스를 정의함으로써 신경 염증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 범주형 변수가 아닌 연속형 변수를 사용하여 미세아교세포 형태를 정량화한다는 것입니다.

여기에 설명된 방법은 독점 소프트웨어가 필요하지 않으며 뇌 영역 스크리닝 또는 세포별 분석에 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Kimberly Young입니다. 시작하기 전에 AnalayzeSkeleton 플러그인이 ImageJ 또는 Fiji에 다운로드되었는지 확인하십시오.

그런 다음 Iba1 면역염색된 뇌를 보여주는 30미크론 Z 스택을 엽니다. 형광 현미경 사진을 사용하는 경우 이미지가 8비트인지 확인하고 그레이 스케일로 변환하여 모든 양성 염색을 가장 잘 시각화합니다. 도구 모음을 사용하여 이미지(Image), 룩업 테이블(Lookup Tables), 회색(Grays)을 클릭합니다.

DAB 명시야 사진을 사용하는 경우 먼저 기본 설정으로 FFT 대역 통과 필터 플러그인을 사용하십시오. 프로세스, FFT, 대역통과 필터를 클릭한 다음 회색 음영으로 변환합니다. 이미지가 너무 어두워서 미세아교세포의 과정을 시각화할 수 없는 경우 도구 모음을 사용하여 이미지, 조정, 밝기/대비를 클릭합니다.

필요에 따라 최소 또는 최대 슬라이더를 히스토그램의 가장자리까지 조정하되 그 이상은 조정하지 않습니다. 밝기 조정은 데이터 분석에서 가장 큰 변동성을 생성하므로 가장 중요한 단계입니다. 그런 다음 프로세스, 필터, 언샵 마스크를 클릭하여 Unsharp Mask 필터를 실행하여 대비를 더욱 높입니다.

반점 제거 단계를 수행하여 언샵 마스크에서 발생하는 소금과 후추 노이즈를 제거합니다. 도구 모음을 사용하여 Process, Noise, Despeckle을 클릭합니다. Image, Adjust, Threshold를 선택하여 이미지를 바이너리로 변환합니다.

그런 다음 이진 이미지에 Despeckle 함수를 적용하여 남아 있는 단일 픽셀 잡음을 제거합니다. 그런 다음 Process, Binary, Close를 클릭하여 Close 기능을 적용하여 최대 2픽셀로 분리된 어두운 픽셀을 연결합니다. 그런 다음 Process(프로세스), Noise(노이즈), Remove Outliers(이상값 제거)를 클릭하여 이상값을 제거합니다.

나중에 사용할 수 있도록 이미지를 별도의 파일로 저장한 후 도구 모음을 사용하여 Process, Binary, Skeletonize를 클릭하여 이미지를 스켈레톤화합니다. 스켈레톤화된 이미지를 선택하고 Plugins, Skeleton, Analyze Skeleton을 클릭하고 브랜치 정보 상자를 선택하여 AnalyzeSkeleton 플러그인을 실행합니다. 결과 및 분기 정보 출력에서 데이터를 복사하여 Excel 스프레드시트에 붙여넣습니다.

Excel에서 데이터를 잘라 IHC 및 이미지 획득으로 인한 스켈레톤 조각을 제거합니다. ImageJ에서 스켈레톤화된 이미지를 열고 선 도구를 선택하여 데이터 세트에서 트리밍할 조각의 길이를 결정합니다. 평균 길이를 기록하면서 여러 조각을 측정하고 데이터 세트 전체에서 일관되어야 하는 컷오프 값을 결정합니다.

Excel 스프레드시트를 Sort and Filter(정렬 및 필터), Custom Sort(사용자 지정 정렬)를 클릭하여 사용자 지정 정렬합니다. 엔드포인트 복셀을 기준으로 가장 큰 복셀에서 가장 작은 복셀로, 새로운 레벨에서는 Mx 분기 PT를 기준으로 가장 큰 복셀에서 가장 작은 복셀로 정렬합니다. 최대 분기 길이가 차단 값보다 작은 두 개의 끝점을 포함하는 모든 행을 제거합니다.

엔드포인트 열의 데이터를 합산하여 이미지에서 수집된 총 엔드포인트 수를 계산합니다. 분기 길이별로 정렬한 후 분기 정보 데이터에 대해 반복합니다. 모든 데이터를 트리밍하고 합산한 후 각 이미지의 데이터를 해당 이미지의 미세아교세포의 수로 나눕니다.

최종 종점과 셀당 셀 및 분기 길이 데이터를 통계 소프트웨어에 입력합니다. FracLac 플러그인이 다운로드되었는지 확인합니다. 그런 다음 사각형 도구를 사용하여 ROI를 그립니다.

상자가 전체 셀을 캡처할 수 있을 만큼 충분히 크고 데이터 세트 전체에서 일관성을 유지할 수 있는지 확인합니다. ROI Manager 창에서 Update를 선택하여 ROI를 현미경 사진에서 임의로 선택한 셀에 고정합니다. 선택한 셀이 포함된 이진 이미지를 엽니다.

페인트 브러시 도구를 두 번 클릭하고 색상을 검은색으로 설정하고 필요에 따라 브러시 너비를 조정합니다. 일치하는 현미경 사진을 참조로 사용하여 Paintbrush를 사용하여 인접한 세포 프로세스를 제거하고, 단편화된 프로세스를 연결하고, 관심 세포를 분리합니다. 이진 셀이 분리되면 이진 파일을 저장합니다.

도구 모음을 사용하여 Process, Binary, Outline을 통해 이진 셀을 개요로 변환합니다. 도구 모음에서 Plugins, Fractal Analysis, FracLac을 클릭하여 도구 모음을 사용하여 FracLac을 열고 상자 계산을 위해 BC를 선택합니다. 그리드 디자인에서 숫자 G를 4로 설정합니다.

Graphics Options(그래픽 옵션)에서 메트릭 상자를 선택하여 셀의 볼록 껍질과 경계 원을 분석합니다. 완료되면 확인을 선택한 다음 스캔 버튼을 선택하여 선택한 이미지에 대해 상자 계산 스캔을 실행합니다. Hull and Circle Results 창에서 원하는 모든 데이터 결과를 복사합니다.

그런 다음 Box Count Summary 창에서 동일한 작업을 수행합니다. 복사된 데이터를 Excel 파일 또는 통계 소프트웨어로 전송합니다. 이 그래프는 손상되지 않고 손상된 피질 조직에서 세포당 미세아교세포 종말점과 세포당 처리된 길이의 요약 데이터를 보여줍니다.

이는 프로토콜이 적용된 분석의 결과입니다. 두 경우 모두 Students T Test를 사용하여 통계 분석을 수행했으며 3개의 이미지를 분석했습니다. 프로토콜 적용에서 사용자 간 가변성에 대해 주의를 기울여야 합니다.

이러한 차이점은 여기에 요약되어 있으며, 동일한 프로토콜을 적용하는 두 명의 독립적인 사용자가 동일한 데이터 세트를 분석했습니다. 추세는 전체적으로 비슷하지만 사용자 간 변동성은 데이터의 중요성에 영향을 미칩니다. 이 절차를 시도하는 동안 목표는 원본 현미경 사진을 대표하는 골격 또는 개요 모델을 얻는 것임을 기억하는 것이 중요합니다.

이는 단계가 연구자의 특정 요구에 맞게 수정될 수 있음을 의미합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 쉽게 구할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 면역조직화학 조직의 현미경 사진에서 미세아교세포의 형태를 빠르게 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.