Name: Microglia 형태학 Immunohistochemistry 조직 ImageJ를 사용 하 여 준비의 Photomicrographs에서 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 배우세요 ImageJ를 사용하여 면역조직화학적으로 처리된 뇌 조직에서 미세아교세포 형태를 정량 분석하는 방법을. 골격화 및 프랙탈 분석 기법을 통해 신경염증 연구에서 세포 형태의 미세한 변화를 감지할 수 있습니다.

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이 연구는 NINR (F32NR013611)에서 재정 지원을 받았다. 우리는 더 인정 하 고 AnalyzeSkeleton(2D/3D) 및 FracLac의 개발자 감사 합니다 하 고 싶습니다 (알 간다 카레라스 외. , Karperien 그 외 여러분, 각각)는 여기에 설명 된 분석 되지 않을 것 이라고 수 없이.

<ol><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).</li>
<li>Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitating+the+subtleties+of+microglial+morphology+with+fractal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection(2013).</li>
<li>Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+microglia%3A+a+morphological+definition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rod microglia: a morphological definition.</a> PLoS One. 9 (5), e97096(2014).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Abiega, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Hyperactivity+Disturbs+ATP+Microgradients%2C+Impairs+Microglial+Motility%2C+and+Reduces+Phagocytic+Receptor+Expression+Triggering+Apoptosis%2FMicroglial+Phagocytosis+Uncoupling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling.</a> PLoS Biol. 14 (6), e1002466(2016).</li>
<li>Wyatt-Johnson, S. K., Herr, S. A., Brewster, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Status+Epilepticus+Triggers+Time-Dependent+Alterations+in+Microglia+Abundance+and+Morphological+Phenotypes+in+the+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Status Epilepticus Triggers Time-Dependent Alterations in Microglia Abundance and Morphological Phenotypes in the Hippocampus.</a> Front Neurol. 8 (700), eCollection(2017).</li>
<li>Morrison, H., Young, K., Qureshi, M., Rowe, R. K., Lifshitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+microglia+analyses+reveal+diverse+morphologic+responses+in+the+rat+cortex+after+diffuse+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative microglia analyses reveal diverse morphologic responses in the rat cortex after diffuse brain injury.</a> Sci Rep. 7 (1), 13211(2017).</li>
<li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+spatiotemporal+analysis+of+microglia+morphology+during+ischemic+stroke+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion.</a> J Neuroinflammation. 10 (4), (2013).</li>
<li>Gyoneva, S., Traynelis, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norepinephrine+modulates+the+motility+of+resting+and+activated+microglia+via+different+adrenergic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors.</a> J Biol Chem. 288 (21), 15291-15302 (2013).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+Enrichment+Potently+Prevents+Microglia-Mediated+Neuroinflammation+by+Human+Amyloid+beta-Protein+Oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Environmental Enrichment Potently Prevents Microglia-Mediated Neuroinflammation by Human Amyloid beta-Protein Oligomers.</a> J Neurosci. 36 (35), 9041-9056 (2016).</li>
<li>Rodriguez, J. J., Noristani, H. N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+response+to+Alzheimer%27s+disease+is+differentially+modulated+by+voluntary+wheel+running+and+enriched+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Microglial response to Alzheimer's disease is differentially modulated by voluntary wheel running and enriched environments.</a> Brain Struct Funct. 220 (2), 941-953 (2015).</li>
<li>Soltys, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+morphological+study+of+microglial+cells+in+the+ischemic+rat+brain+using+principal+component+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative morphological study of microglial cells in the ischemic rat brain using principal component analysis.</a> J Neurosci Methods. 146 (1), 50-60 (2005).</li>
<li>Orlowski, D., Soltys, Z., Janeczko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+development+of+microglia+in+the+postnatal+rat+brain.+A+quantitative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphological development of microglia in the postnatal rat brain. A quantitative study.</a> Int J Dev Neurosci. 21 (8), 445-450 (2003).</li>
<li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+astrocyte+and+microglia+responses+immediately+following+middle+cerebral+artery+occlusion+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sex differences in astrocyte and microglia responses immediately following middle cerebral artery occlusion in adult mice.</a> Neuroscience. 339, (2016).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+reconstruction+of+histological+sections%3A+Application+to+mammary+gland+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li>
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<li>Davis, B. M., Salinas-Navarro, M., Cordeiro, M. F., Moons, L., De Groef, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+microglia+activation%3A+a+spatial+statistics+approach+to+maximize+information+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Characterizing microglia activation: a spatial statistics approach to maximize information extraction.</a> Sci Rep. 7 (1), 1576(2017).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. , Available from:
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<li>Fernandez-Arjona, M. D. M., Grondona, J. M., Granados-Duran, P., Fernandez-Llebrez, P., Lopez-Avalos, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Morphological+Categorization+in+a+Rat+Model+of+Neuroinflammation+by+Hierarchical+Cluster+and+Principal+Components+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia Morphological Categorization in a Rat Model of Neuroinflammation by Hierarchical Cluster and Principal Components Analysis.</a> Front Cell Neurosci. 11 (235), eCollection(2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

Microglia 셀 가늘게 생리학과 병리학 그들의 마이크로-도메인 내에서 조정 하 고 미묘한7,14 에 심한 부상8형태학2 의 다양 한 범위를 표시 합니다. ImageJ 프로토콜의 사용 microglia 형태학 정량화 모든 실험실에 액세스할 수 있는 플랫폼으로 만들고 플러그인 오픈 소스 이미지 프로세싱 소프트웨어는. 설명된 프로토콜 이미지 처리 및이 소프트웨어를 사용 하 여 분석에 초점을 맞추고, 하는 동안 데이터 수집, 유효성 및 안정성의 일관성 우수한 IHC와 현미경 검사로 시작 합니다. 이 프로토콜 이진, 해골, 그리고 전체 photomicrographs 및 단일 셀의 개요 대표를 개선 하는 데 사용 하지만 가난한 IHC 염색의 자리를 차지할 수 없습니다 그리고 낮은 반면, 결과 현미경 흐리게, 또는 왜곡 이미지. 추가 고려로 해야 합니다 주의 microglia 형태를 번복할 수 변경 저장, 단면, 전에 동안 뇌 조직의 병합을 하지. 마지막으로, 각 실험에서 microglia 해야 될 몇 군데 같은 현미경으로 동일한 규모를 사용 하 여. 계측, 목표, 및 소프트웨어 현미경 비슷한 목표에도 불구 하 고 다른 크기의 photomicrographs 귀착되 고 세부 사항 뿐만 아니라 각 프레임 내에서 셀의 수 사이 다. 예를 들어 이미지 수집 Leica SPII에 40 X 목표를 사용 하 여 두 수 세포와 수집 Zeiss 880을 사용 하 여 보다 자세히 결과. 이것은 전체 프레임 보다는 단일 셀에서 수집 된 셀 분파 데이터에 대 한 특히 중요 한이 데이터 샘플링의 문제가 된다.
일반적으로, 해골 분석 전체 photomicrograph를 이용 하는 두 가지 이유로 단일 셀 프랙탈 분석을 선행 한다. photomicrograph에 있는 모든 셀의 결정 셀 분파는 급속 한 때 단일 셀 프랙탈 분석에 비해 시간이 요인 경우 심사 도구로 고려 될 수 있습니다. 또한, 골격 분석 하는 동안 파생 된 이진 이미지 프랙탈 분석을 위해 사용 됩니다. 일단 몇 군데, 사용자 영향을 소개 기초 분석 결과 영향을 미칠 수 있는 중요 한 단계 수가 있습니다. 사용자 간의 대부분 변수 프로토콜 단계 단계 4.2 (증가 이미지 밝기) 이며 (임계값 결정) 4.5 단계. 가능 하면, 밝기 (0-255 사이의 max 또는 min 슬라이더)를 증가 하는 최적의 수 결정 이며 모든 이미지와 사용자를 위해 일정 하 게 유지. 이미지 변화는 훌륭한, 사용자 대신 밝기는 이미지 사이 선택할 수 있습니다. 또는, 이미지는 밝고 콘트라스트가 높은 경우 생략 될 수 있습니다 다음 밝기를 증가 하 고 임계 처리 전문 임계값 필터를 사용 하 여 표준화 될 수 있다 (예., 황) 보다는 더 많은 변수 기본. 일단 최적화, 추가 사용자 영향을 최소화 하기 위해 매개 변수를 준수 해야 됩니다.
사용자 가변성의 예는 그림 5에 표시 됩니다. 따라서 다양성 증가 사용자 1과 사용자 2 모두 데이터 컬렉션에 기여 하는 경우와 데이터 값 사용자 1과 사용자 2 대 증가 했다. 사용자 1 및 사용자 2 바이너리 및 해당 이미지의 차이의 예를 들어 컬러 서클 (그림 5)에 의해 강조 표시 됩니다. 이 경우, 두 사용자가 microglia에 제한 된 전문성을 갖춘 짧게 훈련된 학부 학생 이었다. 정기적인 감독과 microglia 증가 프로토콜 교육2 함께 전문가 의해 멘토링 간 사용자 가변성을 줄일 수 있습니다. 비록 여기 평가 하지, 프랙탈 분석이 작습니다 간 사용자 변화에 따라 이진은 수동으로 하 고 개별적으로 고립 된 임계 처리 microglia 모양 결정에 전적으로 의존 하는 것 보다는 한 photomicrograph 이기 때문에. 그러나, 모든 방법을 사용자 간의 몇 가지 변화를 보유합니다. 따라서, 단일 사용자 (이상적으로, 일부 전문 microglia 셀에 의해 훈련)는 전체 데이터 집합에 대 한 데이터 수집을 완료 해야 합니다.
추가 수정이이 프로토콜을 쉽게 만들 수 있습니다 하 고 이미지 품질과 노이즈를 줄이고 과정 연결을 보장 하는 노력에 따라 달라 집니다. 예를 들어 대비 충분 한 경우에, 언샵 마스크 필요 하지 않습니다 그리고 생략 될 수 있습니다. 그것은 최적화 하 고 이미지, 실험 사례 및 전체 집합에서 데이터를 수집 하는 전에 컨트롤의 특정 집합에 대 한 프로토콜을 마무리 하. 마지막으로, 추가 플러그인 사용할 수 있습니다 다른 장소를 명확히 하거나 이전에이 프로토콜에서 설명 되지 않은 이미지를 선명 하 게와 같은 팽창 또는 선명 하 게.
이 프로토콜의 이점은 그것의 보편적인 가용성 및 적응성 이다. 또한, 신속 하 고 전체 photomicrograph에 적용은 AnalyzeSkeleton를 사용 하 여 셀 분파를 평가입니다. 다중 셀 분석 방법의 이점은 전체 지역 보다는 단일 셀에 초점 이다. 따라서, 신속 하 게 이미지 내의 모든 microglia의 조건 (끝점 및 프로세스 길이) 평균 분파를 평가 가능 하다. 여러 셀의 분석을 제공 하는 뼈대 분석: 프랙탈 분석 photomicrographs에서 단일 셀을 필요한 시간 투자 때문에 의해 일치할 수 없는 셀 숫자의 측면에서 데이터 샘플링. 이 보일 수 있는 가장 적합 한 인스턴스 microglia 형태학 근거리 초점 부상에서 상영 될 것입니다. 한 제한은 전체 필드 이미지 렌더링 IHC photomicrographs의 뼈대 모델을 만들 때 더 많은 시간이 소요 단일 셀 방식에 비해 완벽 하지 않습니다. 또한, 지역 분석 적합 하지 않다 상황에 크게 동일한 필드 내 다른 microglia 형태학이 있다. 마지막으로,이 분석 방법은 세포 수, 실험 조건 간에 다를 수 매개 변수에 따라 달라 집니다.
프랙탈 분석 단일 셀에 진행 되며 따라서 뼈대 분석에서 결과 평균 셀 분파 데이터 출력을 보완 한다. 하지만 훨씬 더 많은 시간을 소모 하 고,이 투자 형태학 데이터의 광범위 한 범위를 생성 합니다. 예를 들어 세포 밀도, 스팬 비율, 그리고 순환 데이터 크기, 연신 율, 및 셀 개요의 모양을 각각 설명. 프랙탈 차원 및 lacunarity 요약 셀 복잡성과 모양이, 각각. 각 매개 변수를 계산 하는 방법 및 데이터 해석 될 수 있습니다 방법의 자세한 요약 대화형 수동16 에서 제공 되 고 같은 세부 구체적인 연구 질문에 관하여 고려 되어야 한다. 척도 생리 및 pathologic 조건에서 발생할 수 있는 2D microglia 형태학에 작은 변화를 중요 한 도구에 설명 된 프로토콜 결과. 견고, 볼록함이, 폼 팩터16,20 등 추가 형태학 분석 가능한 3D 도형을 생성 하는 경우 있을 수 있습니다.
프로토콜 개발 및 적응은 지속적이 고 사용자 중심. 그것은 소량/밝은-필드 이미지7 하지만 아직 임베디드 조직 파라핀 형광8 에서 확장 되었습니다. 그것은 또한, 추가 분석에 대 한 Imaris 등 독점 소프트웨어와 함께에서 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 생리학의 다양 한에 적용 될 수 microglia에 국한 되지 않습니다 하지만 어떤 셀 또는 특정 패턴 또는 IHC 메서드를 사용 하 여 식별 될 수 있는 조직에 적용 될 수 있습니다. 마지막으로, 충분 한 샘플 크기, 복수 또는 클러스터 분석에 적용할 수 있는 형태12,21;에 따르면 microglia 충 이것은 의미 있는 정보 microglia 형태학은 microglia 기능 및 그들의 주위에 응답의 중요 한 지표 이다입니다. Microglial 형태 론 적 다양성에 대 한 감사는 확장 하 고 완전히 건강 및 질병 명과 혈관 신경 상호 작용을 이해 하는 것이 중요. 이 분야에 있는 성장 계량 microglia 형태학 여러 연속 변수를 사용 하 여 요약을 개발, 사용 하기 쉬운, 그리고 재현성 프로토콜에 의해 향상 됩니다.

Microglia 있는에 대 한 즉각적이 고 다양 한 형태 론 적 응답 변경 가능성의 연속체를 따라 뇌 생리학1 드 없는 및 amoeboid 형태학2에 하이퍼 분파와 매우 복잡 한 형태학에서 다양 . Microglia 또한 편광 및 막대 모양의3될 수 있습니다. Microglia 셀 분파 일반적으로 여러 프로세스 하는 데 복잡 한 모양으로 정의 된 고 셀 당 끝점의 수와 세포 프로세스의 길이 자주 보고 됩니다. Microglia 연속 셀 잡담 그리고 vivo에서 운동 성4,5신경 그리고 glial 기능을 정밀 하 게 조정 된다, 때문 microglia 형태학에 다양 한 세포 기능 및 장애의 지표로 사용할 수 있습니다. 두뇌. 양적 접근 필요 적절 하 게 이러한 morphologic 변화의 다양성을 설명 하 고 없는 셀 (예: 간 질5,6 미묘한 생리 물결에서 발생 하는 간의 차이 구별 하는 그리고 뇌 진 탕7) (스트로크8) 같은 심한 부상에 뿐만 아니라. 형태학 정량화7,8,9,10,11,12,,1314 의 사용 증가 건강 및 질병 동안 microglia 형태학의 전체 다양성을 발표할 예정 이다. 현재 연구 ImageJ 플러그인 microglia의 형광 또는 비 형광 photomicrographs에서 microglia 형태를 요약 하는 데 필요한의 단계적 사용 immunohistochemistry (IHC) 후 고정된 쥐 나 조직에 취득 세부 사항.
중앙 분석 기술을 설명 하는 ImageJ 플러그인 AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, 2010 년 큰 유 방 구조, 계량에 개발 및 FracLac16, ImageJ 및 프랙탈 분석을 통합 하는 2014 년 개발 계량 개별 microglia 모양. 이러한 플러그인 전체 photomicrographs 이내 microglia 분파의 신속한 분석 또는 photomicrograph에서 정의 된 투자 수익의 여러 microglia를 제공합니다. 이 분석은 혼자 또는 보완 프랙탈 분석에 사용할 수 있습니다. 단일 셀 프랙탈 분석 (FracLac) 시간의 투자가 필요 하지만 microglia 복잡성, 모양 및 크기에 관한 여러 형태로 출력을 제공 한다. 두 도구를 사용 하 여 중복, 셀으로 분파는 셀 복잡성, 상호 보완적 이며 여러 매개 변수 조합 데이터 집합12,17내 다양 한 microglia 형태학 사이 구별 하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1차 항체 항-IBA1</td><td>Wako&nbsp;</td><td>019-19741</td><td>토끼 숙주</td></tr><tr><td>Vectashield 소프트 마운트</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>2차 항체</td><td>Jackson ImmunorResearch</td><td>711-545-152</td><td>당나귀 숙주</td></tr><tr><td>4 mL 유리 바이알</td><td>Wheaton</td><td>UX-08923-11</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>아지드 나트륨 (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S-8032</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-544-지</td><td></td></tr></tbody></table>

microglia 형태학 immunohistochemistry 조직 imagej를 사용 하 여 준비의 photomicrographs에서 측정

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia 뇌 식 세포 두뇌 항상성에 참여 하 고 지속적으로 장애, 부상 및 질병에 대 한 그들의 환경 조사는. 첫 번째 응답자로 microglia 신경 및 명과 장애를 완화 하기 위해 중요 한 기능 그리고이 과정에서 그들은 다양 한 형태 론 적 변화를 받게. Microglia 형태학 기술적 분류 될 수 있다 또는, 또는, 셀 분파, 복잡성, 모양 등의 매개 변수에 대 한 지속적인 가변으로 측정할 수 있습니다. Microglia 측정 방법 단일 셀에 적용 하는 동안 몇 가지 기술을 여러 microglia 전체 photomicrograph에 적용 됩니다. 이 방법의 목적은 여러 계량 하 고 쉽게 사용할 수 ImageJ 프로토콜을 사용 하 여 단일 셀. 이 프로토콜은 단계 요약 ImageJ 플러그인 대표 이진 및 해당 이미지에 형광 고 밝은 필드 photomicrographs를 변환 하 고 그들을 분석 하는 것이 좋습니다 (2D/3D) AnalyzeSkeleton 및 FracLac 소프트웨어 플러그인을 사용 하 고 형태 데이터 컬렉션에 대 한입니다. 이러한 플러그인의 출력 프로세스 끝점, 교차점, 및 길이 뿐 아니라 복잡성, 셀 모양 및 크기 설명자 셀 형태를 요약합니다. 여기에 설명 된 뼈대 분석 프로토콜은 FracLac 무료 개별 셀 분석을 제공 하는 반면 전체 photomicrograph 또는 관심 (ROI)의 지역 내에서 여러 microglia 지역 분석에 대 한 적합 합니다. 결합, 프로토콜은 목표, 건강 하 고 손상 된 두뇌에 다양 한 microglia 형태학 사이 충에 사용 될 수 있는 민감한, 그리고 종합 평가 도구를 제공 합니다.

여기에 설명 된 microglia 형태 분석 프로토콜 요약 단계 형광 및 형태학 분석에 대 한 한 덩어리 photomicrographs를 처리 하는 데 도움이. 다음이 단계는 그림 2 에 요약 시각적으로 그리고 그림 3. 이 단계의 목표는 축적 된 데이터는 유효 적절 하 게 원래 photomicrograph 모델 대표 이진 하 고 해당 이미지를 만드는 것입니다. 응용 프로그램 프로토콜, 후 AnalyzeSkeleton 플러그인에서 태그 해골 이미지에서 결과 끝점 및 지점 수 (즉., 프로세스) lengthcan 결과 출력 파일에서 요약 될. 끝점 및 길이 데이터 처리 다음 microglia 분파 photomicrograph 또는 투자 수익의 정도 추정 하는 데 사용 됩니다. 그림 4 에 결과 데이터 (끝점/셀 및 프로세스 길이/셀)와 프로토콜 응용 프로그램 없이 수집 요약 되어 있습니다. 유사한 동향은 존재, 그림 4 층 에 요약 데이터 그림 4E에 비해 적은 변수 있습니다. 또한, 이러한 데이터 프로토콜을 적용 하는 경우 그룹 간의 차이 감지 하 감도 증가 설명. 마지막으로, 해야 합니다 주의 프로토콜의 응용 프로그램에서 간 사용자 변화에 관한 합니다. 이러한 차이 그림 5 는 같은 데이터 집합 두 개의 독립적인 사용자가 위에 요약 된 것 처럼 동일한 프로토콜을 적용 분석 했다 요약 된다.
추가 형태 데이터 프로토콜 응용 프로그램 중에 만들어진 바이너리 이미지에서 고립 된 단일 셀에서 수집 됩니다. 분석 하기 전에 microglia 형태학 및 FracLac 플러그인은 그림 6에 요약을 사용 하 여 프로토콜 단계. 우리 모두 손상 되지 않은 (그림 6A)에이 분석을 설명 하 고 부상 (그림 6B) 조직. 이진, 윤곽선, 볼록 선체/캡슐화 원과 상자 계산 예 각 셀으로 분석 하 고 프로토콜 없이 응용 프로그램은 그림 6 c-f. 에 표시 됩니다의 대표 이미지 이러한 이미지 그림 6G에 요약 되어 있는 형태 데이터에 있는 다름의 유래를 설명 하는 데 도움이.
<img alt="신경 추적 다이어그램; 원형 대 단일 기원 소마; 형광등 오버레이; 신경망 매핑." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1입니다. 단일 기원 소마 (최적의)와 해당된 셀과 원래 photomicrograph 사이 해당 오버레이 대 원형 소마 (차선)와 해당된 microglia의 일러스트. 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="이미지 처리 단계: 그레이스케일, 얼룩 제거, 이진수를 포함하여 태그가 지정된 골격에 원본을 현미경으로 검사합니다." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2입니다. 형광 photomicrographs 응용 프로그램 프로토콜. 단일 셀 형광 photomicrograph에 적용 하는 해골 분석 프로토콜의 삽화는 세부 정보 표시를 잘립니다. 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="신경 구조 분석을 위한 이미지 처리 시퀀스; FFT 필터; 그레이스케일; 골격 다이어그램." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3입니다. 밝은 분야 DAB 응용 프로그램 프로토콜 photomicrographs. 세부 정보 표시를 자른 단일 셀으로 밝은 분야 명인 photomicrograph에 적용 하는 해골 분석 프로토콜의 삽화. 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="신경 과정 분석; 현미경 이미지, 프로토콜 비교, 종점/세포를 보여주는 그래프." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 그림 4입니다. 데이터 분석 프로토콜 응용 프로그램 없이. (A) 형광 IHC와 노란색 상자 (B)에 해당 하는 자른된 세포의 예를 들어 photomicrograph. 예를 들어 이진 및 해당 이미지 (C) (D) 설명 된 대로 적용 하는 프로토콜 없이. Microglia 끝점/셀 및 프로세스 길이/셀의 요약 데이터 (흰색) 상승과 부상 (E) (회색) 대뇌 피 질의 조직 및 (F) 없이 프로토콜 적용. 스튜던트 t-검정 및 n을 사용 하 여 통계 분석 = 3, * * p &lt; 0.01을 나타냅니다. 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="뉴런 형태 분석; 이미지 처리 및 데이터 그래프; 이진수, 골격 다이어그램, 통계 결과." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 그림 5입니다. 응용 프로그램 프로토콜 사용자 차이. 사용자 1 및 사용자 2에 의해 이진과 해골 이미지는 원래 이미지와 프로토콜 변환의 예입니다. 두 이미지의 차이 색된 동그라미를 일치 하는 강조 표시 됩니다. 사용자 1 및 사용자 2에 의해 손상 되지 않은 및 손상 된 두뇌 지구에서 microglia 끝점/셀 및 프로세스 길이/셀 데이터의 요약 그래프. 통계 분석 ANOVA와 샘플 크기는 n = 3; p &lt; 0.05 * *p &lt; 0.01, * * *p &lt; 0.001. 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="형태학적 비교를 통한 신경 손상 분석; 미세아교세포에 대한 프로토콜 적용 효과." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 그림 6입니다. 프랙탈 분석 프로토콜 응용 프로그램 없이. 손상 되지 않은 (A)와 해당 이진 (C), 및 개요 (D) 이미지를 적용 하는 프로토콜 없이 결과 부상된 (B) 피 microglia의 자른된 photomicrographs의 예입니다. 관련된 볼록 선체 (파란색)와 해당 개요 도형 (E) (핑크) 원형 바깥쪽 모양 밀도 계산, 비율, 및 순환 (G)에 사용 됩니다. 계산 방법 상자 (F), 설명 및 프랙탈 차원 (DB) 및 lacunarity (λ) 계산 (G)에 대 한 사용. 눈금 막대 = 10 µ m. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Microglia 두뇌 면역 세포를 조사 하 고 양적 평가 될 수 있는 형태 론 적 변화를 통해 변경 된 두뇌 생리학에 반응 하는. 이 프로토콜 개요는 ImageJ 셀 분파, 복잡성, 모양 등 통계에 따라 연속 데이터 microglia 형태를 나타내는 분석 프로토콜을 기반으로 합니다.

Microglia 형태학 Immunohistochemistry 조직 ImageJ를 사용 하 여 준비의 Photomicrographs에서 측정

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

이러한 골격 및 프랙탈 분석 방법의 전반적인 목표는 본질적으로 처리량이 많고 세포 모양의 작은 차이를 감지하기 위해 민감한 정량적 방법을 사용하여 IHC 준비 조직에서 미세아교세포의 형태를 측정하는 것입니다. 이 방법은 건강과 질병 중 미세아교세포 형태와 기능의 뉘앙스를 정의함으로써 신경 염증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 범주형 변수가 아닌 연속형 변수를 사용하여 미세아교세포 형태를 정량화한다는 것입니다.여기에 설명된 방법은 독점 소프트웨어가 필요하지 않으며 뇌 영역 스크리닝 또는 세포별 분석에 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Kimberly Young입니다. 시작하기 전에 AnalayzeSkeleton 플러그인이 ImageJ 또는 Fiji에 다운로드되었는지 확인하십시오.그런 다음 Iba1 면역염색된 뇌를 보여주는 30미크론 Z 스택을 엽니다. 형광 현미경 사진을 사용하는 경우 이미지가 8비트인지 확인하고 그레이 스케일로 변환하여 모든 양성 염색을 가장 잘 시각화합니다. 도구 모음을 사용하여 이미지(Image), 룩업 테이블(Lookup Tables), 회색(Grays)을 클릭합니다.DAB 명시야 사진을 사용하는 경우 먼저 기본 설정으로 FFT 대역 통과 필터 플러그인을 사용하십시오. 프로세스, FFT, 대역통과 필터를 클릭한 다음 회색 음영으로 변환합니다. 이미지가 너무 어두워서 미세아교세포의 과정을 시각화할 수 없는 경우 도구 모음을 사용하여 이미지, 조정, 밝기/대비를 클릭합니다.필요에 따라 최소 또는 최대 슬라이더를 히스토그램의 가장자리까지 조정하되 그 이상은 조정하지 않습니다. 밝기 조정은 데이터 분석에서 가장 큰 변동성을 생성하므로 가장 중요한 단계입니다. 그런 다음 프로세스, 필터, 언샵 마스크를 클릭하여 Unsharp Mask 필터를 실행하여 대비를 더욱 높입니다.반점 제거 단계를 수행하여 언샵 마스크에서 발생하는 소금과 후추 노이즈를 제거합니다. 도구 모음을 사용하여 Process, Noise, Despeckle을 클릭합니다. Image, Adjust, Threshold를 선택하여 이미지를 바이너리로 변환합니다.그런 다음 이진 이미지에 Despeckle 함수를 적용하여 남아 있는 단일 픽셀 잡음을 제거합니다. 그런 다음 Process, Binary, Close를 클릭하여 Close 기능을 적용하여 최대 2픽셀로 분리된 어두운 픽셀을 연결합니다. 그런 다음 Process(프로세스), Noise(노이즈), Remove Outliers(이상값 제거)를 클릭하여 이상값을 제거합니다.나중에 사용할 수 있도록 이미지를 별도의 파일로 저장한 후 도구 모음을 사용하여 Process, Binary, Skeletonize를 클릭하여 이미지를 스켈레톤화합니다. 스켈레톤화된 이미지를 선택하고 Plugins, Skeleton, Analyze Skeleton을 클릭하고 브랜치 정보 상자를 선택하여 AnalyzeSkeleton 플러그인을 실행합니다. 결과 및 분기 정보 출력에서 데이터를 복사하여 Excel 스프레드시트에 붙여넣습니다.Excel에서 데이터를 잘라 IHC 및 이미지 획득으로 인한 스켈레톤 조각을 제거합니다. ImageJ에서 스켈레톤화된 이미지를 열고 선 도구를 선택하여 데이터 세트에서 트리밍할 조각의 길이를 결정합니다. 평균 길이를 기록하면서 여러 조각을 측정하고 데이터 세트 전체에서 일관되어야 하는 컷오프 값을 결정합니다.Excel 스프레드시트를 Sort and Filter(정렬 및 필터), Custom Sort(사용자 지정 정렬)를 클릭하여 사용자 지정 정렬합니다. 엔드포인트 복셀을 기준으로 가장 큰 복셀에서 가장 작은 복셀로, 새로운 레벨에서는 Mx 분기 PT를 기준으로 가장 큰 복셀에서 가장 작은 복셀로 정렬합니다. 최대 분기 길이가 차단 값보다 작은 두 개의 끝점을 포함하는 모든 행을 제거합니다.엔드포인트 열의 데이터를 합산하여 이미지에서 수집된 총 엔드포인트 수를 계산합니다. 분기 길이별로 정렬한 후 분기 정보 데이터에 대해 반복합니다. 모든 데이터를 트리밍하고 합산한 후 각 이미지의 데이터를 해당 이미지의 미세아교세포의 수로 나눕니다.최종 종점과 셀당 셀 및 분기 길이 데이터를 통계 소프트웨어에 입력합니다. FracLac 플러그인이 다운로드되었는지 확인합니다. 그런 다음 사각형 도구를 사용하여 ROI를 그립니다.상자가 전체 셀을 캡처할 수 있을 만큼 충분히 크고 데이터 세트 전체에서 일관성을 유지할 수 있는지 확인합니다. ROI Manager 창에서 Update를 선택하여 ROI를 현미경 사진에서 임의로 선택한 셀에 고정합니다. 선택한 셀이 포함된 이진 이미지를 엽니다.페인트 브러시 도구를 두 번 클릭하고 색상을 검은색으로 설정하고 필요에 따라 브러시 너비를 조정합니다. 일치하는 현미경 사진을 참조로 사용하여 Paintbrush를 사용하여 인접한 세포 프로세스를 제거하고, 단편화된 프로세스를 연결하고, 관심 세포를 분리합니다. 이진 셀이 분리되면 이진 파일을 저장합니다.도구 모음을 사용하여 Process, Binary, Outline을 통해 이진 셀을 개요로 변환합니다. 도구 모음에서 Plugins, Fractal Analysis, FracLac을 클릭하여 도구 모음을 사용하여 FracLac을 열고 상자 계산을 위해 BC를 선택합니다. 그리드 디자인에서 숫자 G를 4로 설정합니다.Graphics Options(그래픽 옵션)에서 메트릭 상자를 선택하여 셀의 볼록 껍질과 경계 원을 분석합니다. 완료되면 확인을 선택한 다음 스캔 버튼을 선택하여 선택한 이미지에 대해 상자 계산 스캔을 실행합니다. Hull and Circle Results 창에서 원하는 모든 데이터 결과를 복사합니다.그런 다음 Box Count Summary 창에서 동일한 작업을 수행합니다. 복사된 데이터를 Excel 파일 또는 통계 소프트웨어로 전송합니다. 이 그래프는 손상되지 않고 손상된 피질 조직에서 세포당 미세아교세포 종말점과 세포당 처리된 길이의 요약 데이터를 보여줍니다.이는 프로토콜이 적용된 분석의 결과입니다. 두 경우 모두 Students T Test를 사용하여 통계 분석을 수행했으며 3개의 이미지를 분석했습니다. 프로토콜 적용에서 사용자 간 가변성에 대해 주의를 기울여야 합니다.이러한 차이점은 여기에 요약되어 있으며, 동일한 프로토콜을 적용하는 두 명의 독립적인 사용자가 동일한 데이터 세트를 분석했습니다. 추세는 전체적으로 비슷하지만 사용자 간 변동성은 데이터의 중요성에 영향을 미칩니다. 이 절차를 시도하는 동안 목표는 원본 현미경 사진을 대표하는 골격 또는 개요 모델을 얻는 것임을 기억하는 것이 중요합니다.이는 단계가 연구자의 특정 요구에 맞게 수정될 수 있음을 의미합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 쉽게 구할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 면역조직화학 조직의 현미경 사진에서 미세아교세포의 형태를 빠르게 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

quantifying-microglia-morphology-from-photomicrographs

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Etienne, F. et al. 급성 뇌 절편에서 ATP 또는 세로토닌에 대한 미세아교세포 과정의 인력에 대한 이광자 이미징. J. Vis. Exp. (2019)이 비디오는 이광자 현미경을 사용하여 뇌 절편에 주입된 화합물에 대한 미세아교세포의 인력을 연구하는 방법을 보여줍니다. 쥐의 뇌 절편을 준비하고, 화학유인제 테스트 화합물을 주입하고, 형광 표지된 미세아교세포를 이미징하여 반응을 시각화하는 방법에 대한 개요를 제공합니다.

쥐 뇌 절편의 화합물에 대한 미세아교세포 돌기 인력을 연구하기 위한 이광자 현미경

뇌 염증 반응의 복잡성에 새로운 통찰력을 얻을 수있는 방법이 제공됩니다. 우리는 국소 허혈의 마우스 모델에서 미세 아교 세포 / 대식 세포 표현형 마커의 공동 발현 패턴을 조사하기 위해 삼차원 촛점 분석 하였다 면역 형광 기반 프로토콜을 설명한다.

실험 뇌 손상 양극화의 소교 / 대식 세포 마커의 3 차원 공 촛점 분석

미세 아교 세포는 세포 외 환경에서 소재를 탐식거나 삼키는 고용량으로 중추 신경계 (CNS)의 상주 면역 세포이다. 여기 시냅스 구성 요소의 미세 아교 세포 - 매개 말림을 시각화 및 측정 광범위하게 적용, 신뢰성, 높은 정량 분석​​은 설명한다.

말림 분석 : CNS 식세포와 신경 세포 사이의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜

미세 아교 세포의 활성화 및 microgliosis 만성 신경 퇴행의 핵심 반응이다. 여기, 우리는 생체 내, 공 초점 검안경으로 망막 CX3CR1-GFP + 미세 아교 세포의 장기 시각화를위한 방법을 제시하고, 임계 값 및 형태 계측 학적 대한 식별과 활성화를 정량화 분석한다. 우리는 연령과 관련된 녹내장의 초기 단계 소교 변경 사항을 모니터링 할 수 있습니다.

마우스 녹내장에 공 촛점 안저 이미징 및 세포 형태 계측 : 신경 퇴행 중 망막 미세 아교 활성화의 생체 역학

두 이미지 분석 알고리즘, "초파리 NMJ Morphometrics"및 "초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics"가 자동 초파리 신경근 접합부 (NMJ)의 구 개 형태 적 특징을 정량화하기 위해 만들어졌다.

높은 처리량 및 다중 파라 메트릭 정량화를위한 ​​두 알고리즘<em&gt; 초파리</em&gt; 신경 근육 접합 형태학

이 프로토콜은 chromogenic immunohistochemistry 및 ImageJ를 사용하여 glioblastoma 환자 절제술에서 종양 microenvironment 구성 요소를 정량적으로 식별하기 위해 개발되었습니다.

환자 Glioblastoma 절제술에서 세포 미세 환경의 정량적 면역 조직 화학

이 프로토콜은 마우스 뇌 조직에서 말초 골수성 세포 침투뿐만 아니라 미세 교졸 밀도, 분포 및 형태학의 분석 뿐만 아니라 IBA1 및 TMEM19의 면역 형광 유행성 화에 대한 단계별 워크플로우를 설명합니다.

마우스 뇌의 미세 교밀도, 형태학 및 말초 골수성 세포 침투 분석을 위해 IBA1 및 TMEM19를 사용한 면역형광 염색

우리는 세포 수를 식별하기 위해 일반화 가능한 영역 기반 이미지 분석 접근법을 활용하는 방법을 제시합니다. 상이한 세포 집단의 분석은 적응형 알고리즘 내에서 별개의 세포 유형 사이의 유의한 세포 높이 및 구조 차이를 이용하였다.

대식세포-섬유아세포 공동배양물의 정량화를 위한 영역 기반 이미지 분석 알고리즘

이 프로토콜은 시험관 내 실험을 위해 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)의 미세 아교 세포와 같은 세포로의 분화 과정을 설명합니다. 또한 라이브 셀 이미징 시스템을 사용하여 체외 식균 작용 분석의 기질로 사용할 수 있는 iPSC 유래 하부 운동 뉴런에서 인간 시냅토솜을 생성하는 자세한 절차도 포함되어 있습니다.

인간 미세아교세포 유사 세포: 유도만능줄기세포로부터의 분화 및 인간 시냅토좀을 이용한 체외 생세포 식균작용 분석

조산(37주 분만)은 최적이 아닌 예방 및 치료 옵션이 있는 긴급한 글로벌 건강 문제&lt; 있습니다. 우리는 상행 질 세균 감염으로 인한 조산의 마우스 모델을 제시하고 그 결과 신생아 이환율과 사망률을 분석하는 방법을 간략하게 설명합니다.

마우스의 상승하는 질 감염, 조산 및 신생아 이환율 모델링

미세아교세포 파라미터 매핑 소프트웨어(MMPS)는 코딩 전문 지식이 필요 없는 사용자 친화적인 분석 파이프라인으로, 면역형광 이미지로부터 단일 세포 미세아교 형태학 분석을 반자동으로 수행합니다. 설치류 지다당류 유도 신경염증 모델에서 검증된 MMPS는 활성화 관련 형태학적 변화를 재현 가능하게 감지하고 표준화되고 확장 가능한 미세아교세포 표현형을 가능하게 합니다.

미세아교세포 파라미터 매핑 소프트웨어(MMPS): 정량적 미세교교세포 형태학 분석을 위한 오픈 소스 사용자 친화적 도구입니다

배우세요 ImageJ를 사용하여 면역조직화학적으로 처리된 뇌 조직에서 미세아교세포 형태를 정량 분석하는 방법을. 골격화 및 프랙탈 분석 기법을 통해 신경염증 연구에서 세포 형태의 미세한 변화를 감지할 수 있습니다.

Microglia 형태학 Immunohistochemistry 조직 ImageJ를 사용 하 여 준비의 Photomicrographs에서 측정

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