Name: 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 크기 조절 종양 상체 많은 수의 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-18T20:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 배우세요 마이크로 웰 플레이트를 활용한 고효율 종양 스페로이드 대량 생산 방법을. 원심분리와 배양 기술로 균일한 크기와 구성의 3차원 세포 응집체를 동시에 수만 개 생성할 수 있습니다.

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이 작품은 박사 Ungrin에 대한 새로운 조사 시동 부여에서 캘거리 대학에 의해 투자되었다.

주 : 마이크로 웰 플레이트는 원하는 결과에 따라 다른 형식으로 사용할 수 있습니다. 사양뿐만 아니라 각 형식으로 표기 세포의 최소 및 최대 숫자에 대한 대략적인 지침을 표 1에 나타낸다. 작은 마이크로 웰은 날카로운 점에 테이퍼와 상체 사이의 변화는 작은 크기에 더 중요한되고 있지만, 따라서 더 낮은 크기 제한은 없다. 적은 20 세포 각각의 평균에서 상체의 일상적인 생산은 간단 8입니다. 큰 마이크로 웰의 크기가 가늘어되지 않으며, 따라서 각각의 마이크로 웰에있는 여러 개의 작은 상체가 발생할 수 있습니다 세포의 작은 숫자에서 상체를 형성하려고 시도합니다. AggreWell 400Ex 플레이트를 사용하는 경우로 인해 표면 특성에 약간의 차이, 계면 활성제 용액 (단계 1.2)와 준비는 선택 사항이 아닙니다. 이 프로토콜은 AggreWell 400 판의 사용을 기반으로합니다 - 다른 형식의 죄수ULT 표 1. 각 웰에로드 할 셀의 수는 각 회전 타원체 클러스터 화하는 세포의 숫자로 포함 마이크로 웰의 수를 곱함으로써 결정된다. 예를 들어, 개당 1,000 세포에서 상체를 생성하기 위해, 각 웰은 (1,200 상체 1,000 배 세포 각 =) 1.2 × 10 6 세포로로드해야합니다. 세포 밀도가 세포 0.4 ㎖를로드 할 것을 관련 계산해야한다. 그래서 1000 셀 각각 형성 상체의 예를 들면, 0.4 ml의 1.2 X 10 6 세포 밀리리터 당 3 × 10 6 세포의 밀도로 변환합니다. 1. 세포를 수신 할 준비 마이크로 웰 <ol><li> 마이크로 웰 플레이트를 제공 한 멸균하고, 그러한 층류 흐름 생물 안전 캐비닛 등의 무균 환경에서 자신의 포장에서 제거해야합니다. 불임 프로토콜에 걸쳐 유지되어야한다. 불임은 우물 물을 사용하여 70 % 에탄올을 사용하여 resterilized하는, 타협해야한다옵션 단계를 수행. <ol><li> 사용되지 않는 각 웰에 70 % 에탄올 0.5 ㎖를 추가합니다. 일부 마이크로 웰 것이다 트랩 기포, 이것은 일측에 액체를 첨가하고, 오히려 표면 상에 수직으로 떨어지는 것보다 표면에 걸쳐 확산하도록함으로써 감소 될 수 있지만. 뚜껑을 교체합니다. </li><li> 에탄올 증기는 신속하게 거품을 투과해야하는 동안 다수가 있으면이를 제거하는 것이 바람직 할 수있다. 2,000 X g에서 2 분간 원심 분리기. 는 로터가 제대로이 속도로 균형을 보장하는 것이 중요합니다. </li><li> 낮은 배율 거꾸로 현미경을 사용하여 확인 기포가 마이크로 웰에서 제거되었습니다. </li><li> 실온에서 뚜껑으로 5 분 동안 배양한다. </li><li> 기음 에탄올. 플레이트는 지금 즉시 사용할 수 있도록 멸균 또는 PBS로 세척, 또는 저장을 위해 공기 건조 할 수있다. </li></ol></li><li> 세포를 마이크로 웰의 표면과 상호 작용하지 않도록하기 위해서는, 계면 활성제를 사용하여 제조 될 수있다. 일반적으로 그것은이다이후에 처음이 단계를 수행하는 것이 바람직하고, 함께 계면 활성제 코팅 된 마이크로 웰없이 생성 상체를 비교합니다. <ol><li> 각 웰에 세정 용액 0.5 ㎖를 추가합니다. 일부 마이크로 웰 것이다 트랩 기포, 이것은 일측에 액체를 첨가하고, 오히려 표면 상에 수직으로 떨어지는 것보다 표면에 걸쳐 확산하도록함으로써 감소 될 수 있지만. 뚜껑을 교체합니다. </li><li> 거품을 제거하기 위해 2,000 XG에서 2 분 동안 원심 분리기. 는 로터가 제대로이 속도로 균형을 보장하는 것이 중요합니다. </li><li> 낮은 배율 거꾸로 현미경을 사용하여 확인 기포가 마이크로 웰에서 제거되었습니다. </li><li> 실온에서 뚜껑에 적어도 삼십분 동안 품어, 또는 4 박 ° C에서 제대로 건조 방지하기 위해 밀봉하면 필요할 때까지 플레이트는 우물에서 계면 활성제 용액에 네 개의도에 저장 될 수있다. </li><li> 멸균 또는 사용하는 PBS 직전에 접시를 씻으십시오. 판에게 허용하지 않습니다코팅 후 건조합니다. </li></ol></li></ol> 2. 셀 준비 참고 : 셀 준비의 세부 사항은 특정 세포 유형이 연구되고와 다소 다를 수 있습니다. 그러나 우리는 여기서 설명 줄뿐만 아니라 인간 및 뮤린 배아 줄기 세포 (ESC), 사람의 유도 된 다 능성 줄기 세포 (IPSC), 섬유 아세포, 추정 원시 내배엽 포함한 세포의 광범위한 범위를 갖는 효과가 이러한 조건을 관찰 와 기질 세포. 다른 그룹은 중간 엽 줄기 세포 9 연골을 포함한 광범위한 애플리케이션에 성공적으로 시스템을 채용 한, 다 능성 줄기 세포 (10)로부터 신경 전구체의 표준화 된 세대는 독성이 간세포 (11)와 도롱뇽 12 척수 재생의 평가에서 분석한다. HT29 세포를 사용하기위한 특정 프로토콜은 다음과 같습니다. <ol><li> DMEM에서 배양 HT29 세포를 T75 플라스크로 시작+ 10 % FBS </li><li> 대기음 성장 플라스크 매체와 트립신 3 ㎖를 추가합니다. </li><li> 37 ℃에서 5 분 동안 세포를 품어 </li><li> 성장 배지 3 ㎖를 추가하여 트립신 소화를 중지합니다. 셀 카운팅 나누어지는을하고 15 ML의 원심 분리기 튜브에 나머지를 전송합니다. </li><li> 200 X g에서 5 분 원심 분리기. </li><li> 원심 분리가 진행되는 동안, 세포를 센다. </li><li> 대기음 트립신 / 중간 혼합물 위의 계산으로 필요한 세포 밀도에 의해 결정 신선한 성장 매체, 볼륨 교체합니다. </li><li> (선택 사항) 어떤 덩어리를 제거하기 위해 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다. 참고 : 셀 수확 조건이 줄 사이에 다소 차이가 있습니다. 예는 또한 세포를 계대 대한 해리 프로토콜을 사용할 수있는 경우, 그 출발점으로 사용되어야한다. 트립신의 민감한 세포 라인의 사용으로 과도한 세포의 죽음의 원인이 될 수 있습니다. 이러한 경우에 우리는 대안 dissociati로 TrypLE을 사용하여 좋은 결과를 관찰시약 8. 세포를 분리하는 동안 응집되어 생존을 분실 한 경우, 효소 용액에 DNA 분해 효소를 첨가하면이 문제를 해결할 수 있습니다. 해리 시간을 줄이고 세포 덩어리를 분쇄하는 분쇄 단계를 사용하면 생존 가능성을 높일 수 있습니다. </li></ol> 3. 회전 타원체의 형성 NOTE : 상체 그러나 초기 실험은 세포 배지 조성을 변화의 결과로부터 3 차원 배양 시스템으로 전환의 결과를 구별하기 위해, 배양 된 배지를 이용하여 수행되어야 매체 제형 다양한 생성 될 수있다. <ol><li> 각 웰 성장 매체의 0.4 ML을 추가합니다. </li><li> 거품을 제거하기 위해 2,000 XG에서 2 분 동안 원심 분리기. 는 회 전자 사전에 원심이 속도로 균형을 보장하는 것이 중요합니다. </li><li> 낮은 배율 거꾸로 현미경을 사용하여 확인 기포가 마이크로 웰에서 제거되었습니다. </li><li> 0.4 ML을 추가합니다(위의 계산)에 필요한 밀도로 세포 현탁액. 조심스럽게 마이크로 웰에 공기 방울을 도입하지 않고, 아래로 피펫 팅에 의해 혼합. 이것은 세포가 균일 일관된 상체를 얻기 위해, 우물에 걸쳐 분산되는 것을 보장하기 위해 중요하다. </li><li> 200 X g에서 5 분 원심 분리기. 판을 원심 분리하는 동안 자기 수준을하지 않는 경우, 대류 전류는 마이크로 웰을 통해 세포의 편재에 그 결과를 발생할 수 있습니다. 가중치 플레이트 캐리어의 양면에 균일하게 분포되도록 따라서 판은 다른 플레이트에 대하여뿐만 아니라 내부적으로 균형을 이루어야한다. </li></ol> 참고 : 고르지 세포 분포의 기록을 볼 수있는 경우,이 플레이트 캐리어의 피벗 포인트에 윤활의 작은 금액을 적용 할 필요가있다 - 지침은 원심 분리기 제조 업체에 문의하십시오. 참고 : 세포가 마이크로 웰에 원심 분리되고 나면, 그들은 합리적으로 RESIS 있습니다판의 작은 움직임에서 세척하기에 TANT. 매체의 슬로 싱 결과 급격한 운동은 피해야하지만, 현미경 원심 분리기 판 또는 보육의 전송이 중요한 세포의 변위가 발생하지 않아야합니다. <ol start="6"><li> 거꾸로 현미경을 사용하여, 세포가 마이크로 웰 내에 클러스터, 그들이 균일하게 잘 분산되어 있다는 것을 확인합니다. </li><li> 37 ℃에서 하룻밤 배양한다 </li><li> 도립 현미경을 사용하여, 회전 타원체의 형성 과정을 관찰. 일부 세포 라인은 다른 사람들이 더 오래 걸릴 수 있습니다, 24 시간 내 소형 상체를 형성 할 것이다. HT29 세포 집계 클러스터에서의 진행은도 2에 도시된다. </li><li> 마이크로 웰에서 상체를 복구하고 부드럽게 피펫을 분출에 의해 현탁 배양에 전송할 수 있습니다. 대안 적으로, 중간 여분 8 시튜 상체를 유지 - 기간은 초기 크기와 성장 속도에 의존하는 DEF그들은이 형성되는 마이크로 웰을 빨리 성장할 때까지의 시간을 이네. <ol><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여 우물의 가장자리에 상체, 대기음 매체를 잃지 않고 매체를 교체하십시오. 천천히가 메 니스 커스 (meniscus)에서 액체를 그리기 시작 때까지 끝을 가지고, 그리고 인하로 메 니스 커스 (meniscus)을 따릅니다. 그 후 같은 장소에서 잘 벽에 신선한 매체를 추가 할 수 있습니다. 몇 상체는 매체가 항상 흡입과 같은 위치에 치환​​ 된 경우에는,이 숫자가 잘 다수에 비해 작은 남아 손실 될 수있다. </li></ol></li></ol>

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<li>Baraniak, P. R., Cooke, M. T., Saeed, R., Kinney, M. A., Fridley, K. M., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffening+of+human+mesenchymal+stem+cell+spheroid+microenvironments+induced+by+incorporation+of+gelatin+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Stiffening of human mesenchymal stem cell spheroid microenvironments induced by incorporation of gelatin microparticles.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 11, 63-71 (2012).</li>
<li>Purpura, K. A., Bratt-Leal, A. M., Hammersmith, K. A., McDevitt, T. C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+engineering+of+3D+pluripotent+stem+cell+niches+to+guide+blood+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches to guide blood development.</a> Biomaterials. , (2012).</li>
</ol>

박사 Ungrin 발명가로 AggreWell 기술 금융 관심을 가지고 있습니다.

우리는 균일 한 회전 타원체 많은 수의 서로 다른 소스에서 여러 개의 세포주에서 생성되도록하는 시스템을 구축했다. 우리는이 상태에서 상체를 형성하지 않는 부착 세포주가 발생할 못하고있다. 우리는 이전하지만 현재까지이 문제가 종양 라인을 제기하지 않은, anoikis 5,8하는 경향이 인구의 세포 손실을 관찰했다. 이 시스템은 24 웰과 6 자 형식뿐만 아니라 현재 개발중인 50,000 마이크로 웰을 각각 포함 된 프로토 타입의 생물 반응기에서 마이크로 웰 일관된 행동, 표면적 임의로 확장 성이다. 비대칭 우려 타원체 있으면, 단계 4.8에서 배양 시간은 2-3 일까지 증가 될 수있다. 구 상체는 또한 그러나이 경우 치료가 서로 WI 접촉 상체로서, 충분히 낮은 배양 밀도를 유지하기 위해 취해야, 대칭성을 증가시키는 마이크로 웰로부터 추출 후 기간 동안 배양 될 수있다LL 종종 더 큰 구조로 융합. 이러한 이유로, 우리는 이전에 골재가 일차 제한 타원체의 크기되는, 형성되는 마이크로 웰 내에 배양을 유지하고있다. 이것은 차례로 성장 속도 및 초기 크기 (8)의 함수이며, 마이크로 웰 플레이트 내에서 연장 배양 계획되는 경우, 이것은 사전에 고려되어야한다. 증식을 방지하는 옵션이 발생한다은 작은 상체로 시작하는, 또는 AggreWell 800 판의 큰 마이크로 웰을 사용 하나 있습니다. 상체가 시간이 지남에 일관성이 증가하지 않을 경우, 하나의 잠재적 원인은 세포의 죽음이 될 수있다. 특히 고도의 대사 활성 세포의 큰 집계에 산소와 필수 영양소의 전달에 대량 전송 제한이 괴사 코어 2 발생할 수 있습니다 - 따라서 비 응집 ​​된 구형은 단순히 과도한 세포 죽음의 결과 일 수있다. 대안으로, 기계적 COHE 잼상체의 시온은 주어진 셀 라인 (13)의 전이 가능성의 관계에서, 세포 간 결합력을 평가하는 데 사용되었습니다. 이는 아마도 이러한 면적비 진원도 및 경계로 형태 학적 파라미터를 사용하여, 회전 타원체 형상 및 전이성 전위 사이의 관계를 조사하기 위해 흥미로울 것이다. 상체의 기계적 및 형태 학적 특성을 조사하는 것 외에도, 마이크로 웰 시스템 어셈블리는 여러 세포 유형 및 / 또는 6,7 생체 재료의 조합으로 이루어지는 혼합 조성물 상체의 대규모 생산을 허용한다. 다른 세포 유형의 종양 세포의 상호 작용에 따라서는 예를 들어, 섬유 아세포 및 내피 세포와 함께 종양 세포에서 상체를 생성하는 데 관심이있을 수 있으며, 더 자세히 생체 (14)에서 종양의 동작을 모델링하는 것이 중요하다. 각종 생체 물질의 미립자도 혼입 될 수 있고, SPH 영향을 미칠 수있다직접 세포 7,15, 또한 회전 타원체 (16)의 내부로 성장 인자 및 사이토 카인의 방출 제어를위한 저수지로와의 상호 작용을 통해 모두 eroid 속성. 불임에 대한 우려가있는 경우 이전 실험의 일환으로 인큐베이터에 약간의 시간을 보냈습니다 수있는 몇 가지 우물이 이전에 사용되어있는 마이크로 웰 플레이트, 작업을 할 때, 예를 들어, 우물 70 % 에탄올로 resterilized 할 수있다 물. 상체가 형성되고 나면, 이들은 또한 셀 스트레이너 위에 현탁액을 통과시켜 잔류 비법 세포로부터 분리 될 수있다. 상체가 유지됩니다 동안 개별 세포를 통해 전달합니다. 구형이 배양 과정 동안 잠재적 전이성 세포를 흘리는 것으로 의심되는 경우,이 절차를 여러 번 수행하는 것이 바람직 할 수있다 - 처음 비법 세포를 제거하고,이어서 purifie을 격리세포의 D 인구는 상체으로 해제가 없습니다.

종양 세포가 더 생리 학적으로 관련 시스템 1로 전환하면 기존의 조직 문화 플랫폼에서 확인 된 치료제가 효능을 잃을 수 있다는 것을 그들이 때 플라스틱 배양보다 입체 문화에서 다르게 행동하고, 증거의 증가 몸이있다. 그것은 모두 그들의 내부 생물학에 대한 통찰력을 얻기 위해, 이러한 조건 하에서 암 세포의 거동을 연구하기 위해, 또한 병원에 검사 시설에서 새로운 치료제를 전환의 성공률을 증가시키는 것이 바람직하다. 긴 역사를 가진 하나의 유용한 모델 시스템은 종양 상체 1,2로 알려진 암 세포의 3 차원 클러스터를 사용합니다. 이상적으로, 구형 형성 기술은 크기와 구성 실험자에 의해 제어되는 균일 한 상체의 큰 숫자의 생산을 허용하는 것입니다. 매달려 드롭 잘 플레이트에 접근하는 동안 3,4이 다시 중 일부를 수행 할 수 있습니다요건, 처리는 일반적으로 제한되며, 상체 많은 수의 생성은 노동 집약적 인 작업이됩니다. 우리는 최근에 재생 의학 분야 5 유사한 문제를 해결할 수있는 시스템을 개발했습니다. (도 1 참조) 밀집 마이크론 스케일 웰 시리즈 내의 강제 응집을 이용하는이 방법은 여러 종류의 세포 (6)의 혼합물뿐만 아니라 다양한 생체 물질 (7)의 혼입을 포함한 세포의 임의의 번호로부터 상체의 생성을 허용한다. 수천 이상 수백 수천 - - 상체가 다수 형성되어 즉시 추출하거나 두 (미발표 관찰) 주 적어도 하나 08 배지 교환에 형성되는 마이크로 웰에서 유지 될 수있다. 이 시스템은 따라서 잘 EFFE의 평가를 위해 균일 한 많은 수의 재생 가능한 종양 상체의 생성에 적합새로운 항 종양 제 또는 기본적인 생물학적 조사 ctiveness.

<table><tbody><tr><td>AggreWell 400 플레이트</td><td>StemCell Technologies Inc.</td><td>27845/27945</td><td></td></tr><tr><td>헹굼 솔루션</td><td>StemCell Technologies Inc.</td><td>07010</td><td></td></tr><tr><td>셀 스트레이너 (37 &마이크로; m)</td><td>StemCell Technologies Inc.</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>PBS VWR</td><td>/ LONZA</td><td>CA12001-676</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Versene (EDTA)</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA12001-660</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA12002-212</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>VWR / LONZA</td><td>CA-95042-112</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen / Life Technologies</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>VWR / Motic</td><td>CA19000-610</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X15R 원심분리기, 표준 웰 플레이트용 캐리어 포함</td><td>VWR / Beckman</td><td>CABKA99465, CABK369704, CABK392806</td><td></td></tr><tr><td>층류 생물 안전 캐비닛</td><td>ESBE / Baker</td><td>BKR-SG603AHEUVSP</td><td></td></tr></tbody></table>

마이크로 웰 플레이트를 사용하여 크기 조절 종양 상체 많은 수의 생산

Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

종양 상체 점점 입체적으로 종양 세포의 거동에 대한 중요한 시험 관내 모델로서 인식된다. 더 생리학 관련 기존 접착 시트의 문화에 비해, 그들은 더 정확하게 복잡성과 실제 종양에 존재하는 상호 작용을 요점을 되풀이하다. 나은 종양 생물학, 또는 신규 치료제의 효능을 평가하기 위하여,이 모델을 활용하기 위해서는, 제어 된 방식과 상당수에서 재현성 상체를 생성 할 수있을 것이 필요하다. AggreWell 시스템은 단일 세포 현탁액을 원심으로하는 피라미드 형 마이크​​로 웰의 고밀도 배열로 구성된다. 세포의 숫자는 각 마이크로 웰의 바닥에 클러스터링 및 관련된 뚜렷한 세포 유형의 수와의 비율은 실험에 의해 도입 현탁액의 속성에만 의존한다. 따라서, 우리는 함께 임의의 크기와 구성의 종양 상체를 생성 할 수 있습니다기본 플랫폼 기술을 수정할 필요가 부족합니다. 차례 문화 면적의 제곱 센티미터 당 마이크로 웰의 수백 매우 높은 생산 수준이 간단, nonlabor 많이 사용하는 프로세스를 통해 달성 될 수 있다는 것을 확인합니다. 따라서 우리는이 프로토콜은 종양 구형 분야의 연구자에 크게 도움이 될 것으로 기대합니다.

: 서로 다른 해부학 적 기원의 여러 종양 라인에서 상체를 쉽게 생성 및 현탁 배양으로 추출 할 수있다. 3 각 조건에서 매우 균일 한 구형의 인구가이 방법을 통해 얻을 수있는 일관성있는 크기의 컨트롤을 보여줍니다 그림. 된 LNCaP 전립선 암 세포는 불규칙한 경계를 덜 일관된 상체에 상승했다 동안 행동의 명확한 라인 사이의 차이 (가능한 이유에 대한 설명을 참조, 선명하게 정의 경계 밀집 상체를 형성 HT29 대장 암 세포와 TE6 식도암 세포로도 볼 수 있습니다 ). 더 일관된 집계에 강한 내부의 힘은 동안에도 여전히이 형성되는 마이크로 웰의 더 대칭 형태로, 특히 큰 사이즈로 된 LNCaP 집계, 눈에 띄게의 사각 피라미드 형상을 유지하는 반면에 붕괴의 결과 마이크로 웰. 입력 셀 번호와 매가 간의 관계<html> 그 결과 회전 타원체의 iCal의 크기는 변수의 수에 따라 달라집니다. 셀당 부피와 사용하는 셀의 수의 곱에 기초하여 이론적 볼륨 차례로 인해 단일 ​​세포 현탁액 단계에서 세포의 손실뿐만 아니라, 지나치게 작은 골재 손실을 포함 할 수있다 세포 손실에 의해 감소​​ 될 수있다 부족한 이웃의 숫자 및 핵심 기술의 제약으로 괴사 수송에 의한 과대 집계에서. 크기는 또한 응집 공정 중에 발생할 수있는 확산에 의해 영향을받을 것이다. 이러한 매개 변수는 세포주에서 세포 라인에 달라집니다대로, 특정한 물리적 차원의 상체가 필요한 경우는 소개하는 세포의 정확한 숫자는 실험적으로 결정해야합니다. 세포 수의 13 배 증가가 구형 직경의 두배 초래한다 예 - 제 근사치로서 구형 직경 혼입 세포 수의 세제곱근으로 증가 할 것으로 예상된다. <html> &quot;FO : 유지 - together.within 페이지 =&quot;_content 항상 &quot;&gt; <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1.jpg" /> 그림 1. 구형 제품의 개략도. 마이크로 웰 시스템은 세포를 원심 분리 될 수있는에 단단히 포장 사각 피라미드 마이크로 웰의 배열 (400 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa35-f9c7-69a1-8c5aa197db53" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">μ M 사이즈 cm 2 당 625)로 구성되어 있습니다. 세포는 경 사진 측벽들에 의해 소집하고, 얻어진 구형의 크기는 사용 된 세포 현탁액의 농도를 변화시킴으로써 제어된다. 50665fig2highres.jpg &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg &quot;/&gt; 그림 2. 상체에 클러스터 세포의 조립. 상체는 칠백 HT29 세포 각각에서 형성되었다. 즉시 원심 분리 한 후 (A), 세포를 느슨하게 각 마이크로 웰의 바닥에 클러스터됩니다. 클러스터가 균일이 경우 오른쪽으로 오프셋합니다. 이 클러스터 크기 배열에 걸쳐 일관성을 유지 제공 허용됩니다. 중요한 클러스터 크기의 차이가 다른 배열의 한 측면에서 본 경우, 단계 3.5의 참고를 참조하십시오. 24 시간 (B) 배양 한 후, 세포 간 접착 힘은 클러스터가 다음 추출 될 수있다 일관된 상체, (C)을 집계하고 형성하는 원인이있다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3.jpg" /><b<html> R /&gt; 그림 3. 마이크로 웰 플레이트에서 발생 상체는. 구 상체를 형성 하였다 칠백 (A, C, E) 또는 천오백 (B, D, F) HT29 결장 암 세포 (A, B), 된 LNCaP 전립선 암 세포 (C, D) 또는 TE6 식도암 세포 (E, F). 더 밀집 HT29 및 TE6 세포에 비해 특히 느슨한 된 LNCaP 응집체 - 제제 내의 구 상체의 일관성, 또한 세포주 간의 편차를 참고. 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> 마이크로 웰 형식 </td></tr><tr><td></td><td> AggreWell (400) </td><td> AggreWell 40EX </td><td> AggreWell 800 </td></tr><tr><td> 마이크로 웰 폭 (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;µm ) </td><td> (400) </td><td> (400) </td><td> 800 </td></tr><tr><td> cm 2 당 마이크로 웰 </td><td> (625) </td><td> (625) </td><td> 156.25 </td></tr><tr><td> 물론 당 마이크로 웰 </td><td> 1200 </td><td> 4,700 </td><td> (300) </td></tr><tr><td> 마이크로 웰 당 최소 세포 * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 2000 </td></tr><tr><td> 마이크로 웰 당 최대 셀 * </td><td> 2,000 </td><td> 2,000 </td><td> 10,000 </td></tr><tr><td> 물론 당 최소 세포 * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 6 × 10 5 </td></tr><tr><td> 물론 당 최대 셀 * </td><td> 2.4 × 10 6 </td><td> 9.4 × 10 6 </td><td> 3 × 10 6 </td></tr><tr><td> 1.1.1 - 70 % 에탄올의 양 (㎖) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 1.2.1 - 세척 용액의 양 (㎖) </td><td> 0.5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 3.2 - 예압 볼륨 (ML) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> 3.5 - 셀 로딩 볼륨 (ML) </td><td> 0.4 </td><td> 1.6 </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td colspan="4"> 이 값이 사용되는 특정 셀의 크기로 다양하며, 경험적으로 결정되어야한다 *로서 마이크로 웰 당 세포의 숫자는 단지 근사치 </td></tr></tbody></table> 표 1. AggreWell 옵션 및 프로토콜 수정.

우리는 상업적으로 이용 가능한 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 균일 한 크기 및 구성 제어 종양 상체의 (수천 수백 수천) 많은 수의 생성을위한 프로토콜을 소개합니다.

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

다음 실험의 전반적인 목표는 크기가 균일하게 제어된 다수의 종양 스페로이드를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 세포가 스페로이드로 형성되도록 응집시키는 마이크로웰 플레이트를 준비함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 원하는 세포 유형의 배양물을 회수하여 OID의 크기와 조성을 결정하는 세포 현탁액을 확보합니다.그 다음, 세포 현탁액을 마이크로웰로 원심 분리한 후 스테로이드가 형성되도록 배양합니다. 배양 후 생성된 스테로이드는 매우 균일하며, 형성된 마이크로웰 내에서 그대로 수집하거나 배양할 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 매우 많은 수의 균일한 응집체를 동시에 제작할 수 있다는 점입니다.이 방법에 익숙하지 않은 사용자의 경우 연료의 크기가 매우 일정하지 않을 수 있습니다. 세포 현탁액이 플레이트 전체에 고르게 분포되어 있는지, 그리고 중앙 원심분리기의 스윙 플레이트 캐리어가 자유롭게 움직여 힘이 표면에 수직으로 작용하는지 확인하는 것이 중요합니다. 먼저, 각 웰에 계면활성제가 포함된 세척액 0.5 milliliters를 첨가하여 멸균된 agro well 400 플레이트를 준비하십시오.계면활성제를 사용하면 세포가 마이크로웰 표면과 상호작용하지 않도록 할 수 있습니다. 마이크로웰에 기포가 갇히는 것을 방지하기 위해, 용액을 표면에 수직으로 떨어뜨리지 말고 한쪽 끝에 첨가하여 표면 전체로 퍼지게 하십시오. 웰에 용액을 첨가한 후 뚜껑을 닫습니다.플레이트를 2000 ×g에서 2분 동안 원심분리하기 전, 로터의 균형이 적절히 잡혔는지 확인하십시오. 저배율 도립현미경을 사용하여 기포를 제거하고, 마이크로웰에서 기포가 완전히 제거되었는지 확인하십시오. 덮개를 닫은 상태로 상온에서 최소 30분 동안 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 플레이트를 배양하십시오. 사용 직전에 웰에서 세척액을 흡입하여 제거하고 멸균수 또는 PBS로 플레이트를 세척하십시오.코딩 후 플레이트가 마르지 않도록 주의하십시오. 세포 준비의 세부 사항은 연구 대상이 되는 특정 세포 유형에 따라 달라질 수 있습니다. 그러나 우리는 여기서 논의한 세포주뿐만 아니라 인간 및 신경 embryonic stem cells, 인간 induced pluripotent stem cell, fibroblasts, putative, primitive endoderm 및 stromal cells를 포함한 광범위한 세포에 대해 이 조건이 효과적임을 확인했습니다. 세포를 준비하려면 HT 29 세포가 들어 있는 T 75 플라스크부터 시작하십시오.플라스크에서 성장 배지를 흡입하여 제거하고, 3 mL의 trypsin을 첨가합니다. 세포를 37 °C에서 5분 동안 배양합니다. 3 mL의 성장 배지를 첨가하여 trypsin 소화를 중단합니다.나머지를 15 milliliter 원심분리 튜브로 옮깁니다. 그다음 15 milliliter 튜브에서 세포 수 측정을 위한 분취액을 취합니다. 원심분리가 진행되는 동안 세포를 200 times G에서 5분 동안 원심분리합니다.세포 수를 측정합니다. 다음으로, 트립신 배지 혼합물을 흡인하여 제거하고, 텍스트 프로토콜의 선택적 단계에서 설명한 바와 같이 이전에 계산된 필요 세포 밀도에 따라 결정된 부피의 신선한 성장 배지로 교체합니다.세포 현탁액을 거름망(strainer)에 통과시켜 덩어리를 제거합니다. 스페로이드는 다양한 배지 조성에서 생성될 수 있으나, 초기 실험은 세포가 배양되었던 배지를 사용하여 수행해야 합니다. 3차원 배양 시스템으로의 전환에 따른 영향과 배지 조성 변경에 따른 영향을 구분하기 위해, 우선 각 웰에 0.4 mL의 성장 배지를 추가하고 2000 ×g에서 2분 동안 원심분리합니다. 저배율 도립 현미경을 사용하여 기포를 제거하고, 마이크로 웰에서 기포가 완전히 제거되었는지 확인합니다.다음으로, 필요한 밀도의 세포 현탁액 0.4 milliliters를 마이크로 웰에 첨가합니다. 그 후, 마이크로 웰에 기포가 유입되지 않도록 피펫으로 부드럽게 위아래로 섞어 세포가 웰 전체에 균일하게 분포되도록 합니다. 이는 일관된 스테로이드를 얻기 위함입니다.플레이트를 200 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 플레이트 캐리어의 양쪽에 무게가 균등하게 분산되도록 플레이트 내부의 균형뿐만 아니라 다른 플레이트와의 균형도 맞춰야 합니다. 이렇게 하면 원심분리 중에 플레이트의 수평이 자동으로 유지되어, 대류 현상으로 인해 마이크로웰 전반에 세포가 불균일하게 분포하는 것을 방지할 수 있습니다.도립 현미경을 사용하여 세포가 마이크로 웰 내에 응집되었는지, 그리고 37°C에서 세포를 하룻밤 동안 배양하기 전에 웰 전체에 고르게 분포되어 있는지 확인하십시오. 도립 현미경을 통해 스페로이드 형성 과정을 관찰하십시오. 일부 세포주는 24시간 이내에 조밀한 스페로이드를 형성합니다.다른 세포들의 경우 더 오래 걸릴 수 있습니다. 여기에서는 HT 29 세포가 클러스터에서 응집체로 진행되는 과정이 나타나 있습니다. 이 절차에서 가장 어려운 부분은 구조물을 손상시키지 않고 내부의 스페로이드를 꺼내는 것입니다. 마이크로 웰에서 스페로이드를 추출하려면, 피펫팅을 매우 부드럽게 반복하여 스페로이드가 마이크로 웰 밖으로 나오게 하십시오.그런 다음 플레이트를 기울여 배지-스테로이드 혼합물을 흡입합니다. 스테로이드의 크기가 큰 경우에는 스테로이드가 파손되는 것을 방지하기 위해 구경이 넓은 피펫 팁을 사용하십시오. 마이크로 웰에서 스테로이드를 회수한 후, 피펫으로 부드럽게 분사하여 현탁 배양액으로 옮깁니다.또는, 배지를 교체함으로써 심각한 장미(severe rose)를 발작 상태로 유지할 수 있습니다. 유지 기간은 초기 크기와 성장 속도에 따라 달라지며, 이는 마이크로 웰에서 완전히 성장할 때까지의 시간을 결정합니다. 스테로이드를 손실하지 않고 배지를 교체하기 위해 웰이 형성되었습니다.웰 가장자리에 있는 배지를 흡입합니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 팁을 천천히 내려 액체의 메니스커스가 빨려 들어오기 시작할 때까지 내린 후, 메니스커스가 내려감에 따라 함께 따라 내려갑니다. 그 다음, 동일한 위치의 웰 벽을 따라 신선한 배지를 첨가합니다.신선한 배지를 추가할 때, 마이크로웰 내의 PHE가 흐트러지는 것을 방지하기 위해 피펫터를 부드럽게 밀어 넣고 팁을 벽면에 밀착시켜야 함을 유념하십시오. 약간의 스테로이드 손실이 발생할 수 있습니다. 하지만 배지를 항상 동일한 위치에서 흡입하고 교체한다면, 손실량은 적게 유지될 것입니다.웰 내의 많은 세포 수와 비교하여, 서로 다른 해부학적 기원을 가진 여러 종양 라인으로부터 스테로이드를 현탁액으로 쉽게 추출할 수 있습니다. 이 방법을 통해 얻을 수 있는 일관된 크기 제어 성능이 매우 균일한 스테로이드 집단으로 여기서 입증되었습니다. 각 조건은 700개 또는 1,500개의 세포로 형성되었습니다.HT 29 결장암 세포와 TE 6 식도암 세포의 경우, 경계가 뚜렷하고 밀집된 구상체를 형성하여 세포주 간의 행동 차이가 명확하게 나타납니다. 반대로, Lin Cap 전립선암 세포는 경계가 불규칙하고 응집력이 낮은 구상체를 형성합니다. 응집력이 더 강한 집합체 내의 강력한 내부 힘으로 인해, 이들은 형성된 마이크로웰 내에 있는 동안에도 더 대칭적인 형태로 수축하는 결과를 보였습니다.하지만 린 캡(lin cap) 응집체, 특히 크기가 더 큰 응집체는 마이크로웰의 사각형 파라메탈 기하학적 구조를 시각적으로 유지합니다. 숙달되면, 이 과정은 세포가 부착되고 액체를 생성하는 데 필요한 배양 시간을 제외하고 약 1시간 내에 완료될 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 세포를 추가하기 전에 마이크로웰 내에 기포가 없는지 확인하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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