마이크로 웰 플레이트를 사용하여 크기 조절 종양 상체 많은 수의 생산

다음 실험의 전반적인 목표는 균일한 크기로 조절되는 종양 스페로이드를 대량으로 생성하는 것입니다. 이것은 스테로이드로 형성될 세포를 뭉치기 위하여 먼저 microwell 격판덮개를 준비해서 달성됩니다. 두 번째 단계로, 원하는 세포 유형의 배양물을 수확하여 OID의 크기와 구성을 결정하는 세포 현탁액을 제공합니다.

그런 다음 세포 현탁액을 마이크로 웰로 원심분리하고 배양 후 스테로이드가 형성될 수 있도록 배양합니다. 생성된 스테로이드는 매우 균일하며, 스테로이드가 형성된 마이크로 웰에서 수집되거나 배양될 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 매우 많은 수의 균일한 응집체를 동시에 만들 수 있다는 것입니다.

이 방법을 처음 사용하는 개인은 연료의 크기가 매우 크다는 것을 알 수 있습니다. 셀 서스펜션이 플레이트 전체에 고르게 분포되어 있고 중앙 Fuge의 스윙 플레이트 캐리어가 자유롭게 움직여 힘이 표면에 수직이 되도록 하는 것이 중요합니다. 시작하려면 각 웰에 헹굼 용액이 포함된 계면활성제 400ml를 추가하여 멸균 농업 웰 0.5 플레이트를 준비합니다.

계면활성제를 사용하면 세포가 마이크로 웰 표면과 상호 작용하지 않습니다. 마이크로 웰에 기포가 갇히지 않도록 한쪽에 액체를 추가하고 표면에 수직으로 떨어뜨리지 않고 표면 전체에 퍼지도록 합니다. 웰에 용액을 첨가 한 후 뚜껑을 교체하십시오.

저배율 도립 현미경을 사용하여 기포를 제거하기 G.To 2000회에서 2분 동안 플레이트를 원심분리하기 전에 로터의 균형이 제대로 잡혀 있는지 확인하고 마이크로 웰에서 기포가 제거되었는지 확인합니다. 뚜껑을 덮은 상태에서 실온에서 최소 30분 동안 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 플레이트를 배양합니다. 우물에서 헹굼 용액을 흡입하고 사용 직전에 멸균수 또는 PBS로 플레이트를 세척하십시오.

코딩 후 플레이트가 마르지 않도록 하십시오. 세포 준비에 대한 세부 사항은 연구 중인 특정 세포 유형에 따라 달라집니다. 그러나, 우리는 이 상태가 인간 및 뉴런 배아 줄기 세포, 인간 유도 만능 줄기 세포, 섬유아세포, 추정, 원시 엔돈 및 기질 세포뿐만 아니라 여기에서 논의한 계통을 포함한 광범위한 세포에 효과적인 것을 관찰했습니다. 세포를 준비하려면 HT 29 세포의 T 75 플라스크부터 시작합니다.

플라스크에서 성장 배지를 흡인하고 트립신 3ml를 첨가합니다. 세포를 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. 성장 배지 3ml를 첨가하여 트립신 소화를 중단합니다.

나머지를 15ml 원심분리기 튜브에 넣습니다. 그런 다음 15ml 튜브에서 세포 계수를 위한 부분 표본을 취합니다. 원심분리가 진행되는 동안 200배 G로 5분 동안 세포를 원심분리합니다.

세포를 세십시오. 다음으로, tryin 배지 혼합물을 흡인하고 새로운 성장으로 교체하십시오. 중간 크기: 텍스트 프로토콜에 선택적 단계로 설명된 대로 이전에 계산된 필수 셀 밀도에 의해 결정된 부피입니다.

덩어리를 제거하기 위해 세포 현탁액을 스트레이너에 통과시킵니다. 스페로이드는 다양한 배지 제형으로 생성될 수 있지만, 초기 시험은 세포가 배양된 배지를 사용하여 수행해야 합니다. 3차원 배양 시스템으로의 전환에 따른 결과와 배지 조성 변경의 결과를 구별하기 위해 먼저 각 웰 원심분리기에 0.4ml의 성장 배지를 2000회씩 2분 동안 첨가 G.To 저배율 도립 현미경을 사용하여 기포를 제거하고 마이크로 웰에서 기포가 제거되었는지 확인합니다.

다음으로, 필요한 밀도로 0.4ml의 세포 현탁액을 마이크로 웰에 추가합니다. 그런 다음 마이크로 웰에 기포를 유입하지 않고 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합하고 세포가 웰 전체에 고르게 분포되어 있는지 확인합니다. 일관된 스테로이드를 얻기 위해.

플레이트를 200회씩 5분 동안 원심분리합니다. G, 플레이트는 무게가 플레이트 캐리어의 양쪽에 고르게 분산되도록 다른 플레이트와 마찬가지로 내부적으로도 균형을 이루어야 합니다. 이렇게 하면 원심분리 중에 플레이트가 자체 수평을 유지하여 대류 전류가 발생하지 않고 마이크로 웰 전체에 세포가 고르지 않게 분포

도립 현미경을 사용하여 세포가 마이크로 웰 내에 모여 있고 세포가 웰 전체에 고르게 분포되어 있는지 확인한 후 섭씨 37도에서 밤새 세포를 배양합니다. 도립 현미경을 사용하여 s 스페로이드 형성 과정을 관찰합니다. 일부 세포주는 24시간 이내에 소형 스테로이드를 형성합니다.

다른 것들은 더 오래 걸릴 수 있습니다. HT 29 셀에서 클러스터에서 응집체까지의 진행 상황이 여기에 나와 있습니다. 이 절차의 가장 어려운 부분은 구조를 방해하지 않고 intex 스테로이드를 꺼내는 것입니다 마이크로 웰에서 스테로이드를 추출하기 위해 매우 부드럽게 위아래로 피펫을 사용하여 스페로이드가 마이크로 웰에서 나오도

그런 다음 플레이트를 기울여 중간 스테로이드 혼합물을 흡인합니다. 스테로이드가 분해되지 않도록 더 큰 크기의 스테로이드에는 넓은 오리피스 피펫 팁을 사용하십시오. 마이크로 웰에서 스테로이드를 회수한 후 피펫으로 부드럽게 분사하여 현탁액 배양으로 옮깁니다.

대안적으로, 심한 장미는 중간 교체로 발작을 유지할 수 있습니다. 지속 시간은 초기 크기와 성장 속도에 따라 달라지며, 이는 마이크로 우물보다 커질 때까지의 시간을 정의합니다. 글쎄, 그들은 스테로이드를 잃지 않고 매체를 대체하기 위해 형성되었습니다.

우물 가장자리에서 매체를 흡입합니다. 목초지 피펫을 사용하여 반월판에서 액체를 빨아들이기 시작할 때까지 팁을 천천히 아래로 내리고 반월판이 떨어질 때 따라 아래로 내립니다. 그런 다음 같은 장소의 우물 벽에 새로운 매체를 추가합니다.

새 배지를 추가할 때 파이펫터를 부드럽게 밀고 팁을 벽에 대고 마이크로웰에서 PHE가 방해받지 않도록 하는 것을 잊지 마십시오. 몇 가지 스테로이드가 손실될 수 있습니다. 그러나 매체가 항상 동일한 위치에서 흡입되고 교체되면 이 숫자는 작게 유지됩니다.

웰에 있는 많은 수와 비교하여, 해부학적 기원이 다른 여러 종양 라인의 스테로이드는 현탁액으로 쉽게 추출될 수 있습니다. 이 방법을 통해 얻을 수 있는 일관된 크기 제어는 여기에서 매우 균일한 스테로이드 인구와 함께 설명됩니다. 각 조건에서 700 또는 1, 500 개의 세포로 형성됩니다.

HT 29 대장암 세포와 TE 6 식도암 세포에서 행동의 명확한 interline 차이도 볼 수 있으며, 경계가 뚜렷하게 정의된 조밀하게 채워진 스테로이드를 형성합니다. 반대로, 린캡 전립선암 세포는 경계가 불규칙하고 일관성이 떨어지는 스테로이드를 생성합니다. 더 일관된 응집체에서 더 강한 내부 힘은 또한 그것들이 형성된 마이크로 웰에 있는 동안에도 더 대칭적인 형태로 붕괴되는 결과를 낳았습니다.

그러나, lin cap 응집체, 특히 더 큰 크기에서 마이크로 웰의 정사각형 파라메탈 형상을 눈에 띄게 유지합니다.일단 마스터되면, 이 과정은 약 1시간 내에 수행될 수 있으며, 세포가 부착되어 유체를 만드는 데 필요한 잠복기를 더한 기간 내에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 세포를 추가하기 전에 마이크로 웰을 이동하면서 다른 거품이 발생하는지 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.