의 검출을위한 더 민감하고 특정 원체 한천 배지의 개발

이 절차의 전반적인 목표는 기존 배지와 비교하여 Vibrio parahaemolyticus를 검출하고 분리하는 새로운 발색 배지의 민감도와 특이도를 평가하는 것입니다. 이 방법은 식품 및 환경 내 Vibrio 종의 유병률은 어느 정도인가와 같이 식품 및 채취 환경 미생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 본 절차의 주요 장점은 식품 매질이 존재하는 상황을 포함하여 많은 세균 분리균을 사용할 수 있다는 점입니다.

박테리아를 배양하기 전, 모든 한천 배지를 오토클레이브로 멸균하십시오. 그 다음 항온수조에서 한천을 45-50 °C로 냉각하십시오. 한천이 준비되면 빈 페트리 접시를 5~6개씩 쌓아 정렬하십시오.

그런 다음, 쌓아둔 플레이트의 맨 아래쪽부터 시작하여 각 플레이트의 약 절반이 찰 때까지 용융된 한천을 붓고, 부은 후에는 뚜껑을 다시 닫습니다. 한천이 실온에서 최소 12시간 동안 굳도록 둡니다. 미생물 균주 배양을 준비하기 위해, 한천이 준비되면 멸균된 백금이를 사용하여 배양물을 적절한 비선택 한천 플레이트로 옮기고, 단일 콜로니를 관찰할 수 있는 패턴으로 박테리아를 스트리킹합니다.

모든 콜로니의 도말이 완료되면, Campylobacter 종을 제외한 배양물을 35~37°C에서 최대 48시간 동안 뒤집힌 상태로 배양합니다. Campylobacter 종의 경우, 미호기성 환경을 조성하기 위해 가스 팩이 들어 있는 밀폐 용기 안에서 배양해야 합니다. 배양이 끝난 후 콜로니 형태를 관찰합니다. 순수 배양물은 모두 유사한 콜로니 형태를 나타내야 합니다.

선택 및 감별 배지에서 관심 콜로니를 배양하려면, 몇 개의 독립된 콜로니를 5 mL의 적절한 액체 배지로 옮기고 35~37 °C에서 16~24시간 동안 다시 배양합니다. 다음 날, 하룻밤 배양한 배양액을 루프 한 번 분량만큼 Thiosulfate-Citrate-Bile-Salts-Sucrose(TCBS) 한천 배지와 발색 한천 배지에 각각 최소 한 개씩 도말하고, 35~37 °C에서 최대 96시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 배지의 배양 밀도와 독립된 콜로니의 크기를 조사하여 균주의 전반적인 성장 정도를 결정하고, 상황에 따라 가시광선 또는 UV 광원 아래에서 콜로니의 색상을 기록하며 콜로니의 다른 중요한 특성들을 함께 기록합니다.

회복 분석(recovery assay)을 수행하려면, 2% 염화나트륨이 첨가된 tryptic soy broth(TSBS) 5mL에 Vibrio parahaemolyticus의 젊은 배양액을 접종하고, 시험관을 35~37°C에서 16~24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 하룻밤 배양한 배양액을 볼텍싱한 후, PBS 내에서 박테리아의 희석 배수를 1×10⁻¹에서 1×10⁻⁷까지 설정합니다. 1×10⁻⁴에서 1×10⁻⁷ 희석액을 사용하여, 각 희석액 100µL를 개별 발색 배지, TCBS 배지 및 2% 염화나트륨이 첨가된 tryptic soy agar(TSAS) 배지에 고르게 도말합니다.

모든 플레이트를 35~37°C에서 최대 96시간 동안 배양합니다. 그 후 콜로니 수를 측정하되, 콜로니 수가 너무 많아 셀 수 없는 플레이트나 25개 미만의 콜로니가 포함된 플레이트는 제외합니다. 경쟁 분석을 수행하려면, TCBS에서 예상되는 터쿼이즈색 콜로니를 형성하고 발색 배지(chromogenic agar)에서 시안색 콜로니를 형성하는 V.parahaemolyticus 균주와 비-V.

배지에서 성장하지 않거나 다른 군락 색상을 나타내는 Parahaemolytius 종. 분리된 V.Parahaemolyticus 및 V.Metschnikovii 군락 몇 개를 TSAS 배지에서 5 mL의 TSBS로 옮겨 35~37°C에서 16~24시간 동안 배양합니다. 분리된 Shigella sonnei 군락 몇 개를 Brain Heart Infusion(BHI) 배지에서 5 mL의 BHI broth로 옮겨 35~37°C에서 16~24시간 동안 배양합니다.

다음 날, 각 균주에 대해 계열 희석을 수행하고, 희석액을 비선택 배지 플레이트에 도말하여 하룻밤 동안 배양한 배양액의 밀리리터당 콜로니 형성 단위(CFU)를 결정합니다. 그다음, 하룻밤 배양한 배양액과 희석 튜브를 사용하여 V.Parahaemolyticus 균주와 비-V. Parahaemolyticus 종의 서로 다른 부피를 혼합하고, 이 박테리아 혼합액 100 µL를 각각의 발색 배지, TCBS 및 TSAS agar 플레이트에 도말합니다.

35~37°C에서 최대 96시간 동안 배양한 후, 발색 배지와 TCBS 배지에서의 성장 및 형태적 차이를 바탕으로 콜로니 수를 측정합니다. 선택 및 분별 배지에서 굴 균질물이 박테리아 성장에 미치는 영향을 평가하려면, 먼저 육수와 살을 포함하여 최소 12마리의 연체동물 패류로부터 굴 살 50g 이상을 측정하여 무게를 잽니다. 그런 다음 굴 조직에 동일한 질량의 PBS를 첨가하고 혼합물을 고속으로 90초 동안 블렌딩합니다.

다음으로, 희석된 굴 균질액 100g을 400g의 PBS에 넣고 1분 동안 고속으로 혼합합니다. 그런 다음 균질액을 오토클레이브로 멸균합니다. 냉각 후, 하룻밤 동안 배양한 V.Parahaemolyticus와 비-V.Parahaemolyticus 각각 100µL를 첨가합니다.

Parahaemolyticus 배양액을 굴 슬러리에 첨가하고, 균질기(homogenizer)를 사용하여 세균 세포를 굴 균질액과 혼합합니다. 시연된 바와 같이, PBS를 사용하여 첨가된 굴 균질액을 1 × 10⁻¹에서 1 × 10⁻³까지 희석합니다. 각 희석액 100 µL를 각각의 발색 배지, TCBS 및 TSAS 플레이트에 도말합니다. 35~37 °C에서 96시간 배양 후, 발색 배지와 TCBS 배지에서 나타난 실제 콜로니 수를 하룻밤 동안 배양한 배양액의 표준 평판 계수법으로 도출한 예상 콜로니 수와 비교합니다.

본 연구에 사용된 균주의 성장 및 콜로니 형태를 결정하기 위해, 박테리아를 선택 및 감별 배지에서 배양하였습니다. TCBS는 청록색의 V.Parahaemolyticus와 노란색의 V.Cholerae를 포함하여 일부 Vibrio 종을 분리하는 데 사용되는 전통적인 배지입니다. 식품 및 환경 시료에서 임상적으로 유의미한 Vibrio 종을 선택하기 위해 발색 배지를 사용하면 시안색의 V.Parahaemolyticus와 마젠타색의 V.Cholerae가 생성됩니다.

굴 균질액이 포함된 발색 한천 배지 플레이트에서 성장한 V.Parahaemolyticus의 콜로니 수는 비선택 배지에서 관찰되는 수와 유사하게 나타났으며, 이는 식품 매트릭스가 존재하는 환경에서도 발색 배지의 검출 한계가 비선택 배지와 유사함을 시사합니다. 또한, V.Parahaemolyticus의 성장과 회수는 비-V. Parahaemolyticus 종의 존재에 의해 영향을 받지 않았는데, 이는 특히 농축 과정 이후 환경 시료에 다양한 Vibrio 종이 다량으로 포함되어 있다는 점을 고려할 때 분별 및 선택 배지가 갖추어야 할 필수적인 특성입니다.

또한, 열불안정성 용혈소 PCR을 통해 TCBS 및 발색 배지를 비교한 결과, 발색 배지에서 더 높은 민감도와 특이도가 나타났으며, 이는 V.Parahaemolyticus의 검출 및 동정을 위한 이 선택 및 감별 배지의 전반적인 성능이 더 우수함을 시사합니다. 숙달된 후에는 약 50개 균주의 테스트 및 배양 시간을 포함한 전체 과정을 적절히 수행할 경우 30일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안 모든 배양물에 꼼꼼하게 라벨을 부착하고 항상 무균 조작법을 사용하는 것이 중요합니다.

이 절차 이후에는, 이 특정 분리주가 독성 유전자를 보유하고 있는가와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 colony PCR과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 식품 안전 및 공중 보건 분야의 연구자들은 패류 및 하구 환경에서 Vibrio 종 검출을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 시청한 후에는, 표준 평판 계수법을 수행하는 방법과 배지의 민감도, 특이도 및 검출 한계를 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

병원체 및 고온의 배지를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안 보호복 착용, 개방된 상처 부위 보호, 생물학적 위험 폐기물 분리 배출과 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.