의 검출을위한 더 민감하고 특정 원체 한천 배지의 개발 장염 비브리오 균 및 기타 비브리오 종

이 절차의 전반적인 목표는 기존 배지와 비교하여 Vibrio parahaemolyticus를 검출하고 분리하는 능력에 대한 새로운 발색 배지의 민감도와 특이성을 평가하는 것입니다. 이 방법은 식품 및 환경 미생물학 분야의 주요 질문, 예를 들어 식품 및 수확 환경에서 Vibrio 종의 유병률은 얼마입니까? 우리 절차의 주요 장점은 식품 매트릭스의 존재를 포함하여 많은 박테리아 분리물을 사용할 수 있다는 것입니다.

박테리아를 배양하기 전에 모든 한천 배지를 고압멸균하십시오. 그런 다음 수조에서 한천을 섭씨 45-50도로 식히십시오. 한천이 준비되면 빈 페트리 플레이트를 5-6개의 플레이트로 묶어 배열합니다.

그런 다음 스택의 바닥에서 시작하여 용융 된 한천을 약 절반이 찰 때까지 각 플레이트에 붓고 붓은 후 뚜껑을 교체하십시오. 한천이 실온에서 최소 12시간 동안 단단해지도록 합니다. 미생물 균주 배양을 설정하려면 한천이 준비되면 멸균 접종 루프를 사용하여 배양물을 적절한 비선택적 한천 플레이트로 옮기고 분리된 군집을 관찰할 수 있는 패턴으로 박테리아를 줄무늬 처리하십시오.

모든 콜로니가 플레이트링되면 섭씨 35-37도에서 최대 48시간 동안 배양물을 거꾸로 배양하지만, 캄필로박터 종은 미세호기성 환경을 만들기 위해 가스 파우치가 들어 있는 밀폐된 뚜껑 병에서 배양해야 합니다. 배양이 끝날 때 군체 형태를 관찰하십시오. 순수 배양은 유사한 군집 형태를 보이는 군체를 생성해야 합니다.

선택적 및 차등 배지에서 관심 콜로니를 성장시키려면 몇 개의 분리된 콜로니를 5ml의 적절한 육즙으로 옮기고 16-24시간 동안 섭씨 35-37도에서 배양합니다. 다음 날, 하룻밤 동안 배양물을 하나 이상의 Thiosulfate-Citrate-Bile-Salts-Sucrose 또는 TCBS, 한천 플레이트와 하나 이상의 발색 한천 플레이트에 반복하여 섭씨 35-37도에서 최대 96시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 플레이트의 배양 밀도와 분리된 콜로니의 크기를 모두 검사하여 균주의 전반적인 성장을 결정하고, 적절하게 주변 광 또는 자외선 아래에서 콜로니의 색상을 기록하고, 콜로니의 다른 중요한 특성을 기록합니다.

회수 분석을 수행하기 위해 2% 염화나트륨(TSBS)을 보충한 5ml의 트립틱 콩 육수에 Vibrio parahaemolyticus의 어린 배양액을 접종하고 튜브를 섭씨 35-37도에서 16-24시간 동안 놓습니다. 다음날, 와류 밤새 문화 및 체제 1 시간 10 부정적인 것에 10, PBS에 있는 박테리아의 부정적인 7 희석에 1 시간 10. 1 곱하기 10에서 음의 4 곱하기 10에서 음의 7 희석액을 사용하여 각 희석액 100 마이크로 리터를 2 % 염화나트륨 한천 또는 TSAS 플레이트가 보충 된 개별 발색, TCBS 및 트립 대두 한천에 균일하게 도금합니다.

모든 플레이트를 섭씨 35도에서 37도까지 최대 96시간 동안 배양합니다. 그런 다음 식민지가 너무 많아서 셀 수 없거나 25개 미만의 식민지를 포함하는 플레이트를 무시하고 식민지를 계산합니다. 경쟁 분석을 수행하려면 TCBS에서 예상되는 turqouise 집락과 발색 한천에서 cyan 집락을 생성하는 V.Parahaemolyticus 균주와 non-V를 선택합니다.

Parahaemolytius 종은 어느 매체에서도 자라지 않거나 다른 군체 색상을 나타냅니다. TSAS 농업에서 분리된 V.Parahaemolyticus 및 V.Metschnikovii 군집 몇 개를 섭씨 35도에서 37도에서 16-24시간 배양 동안 TSBS 5밀리리터로 옮깁니다. Brain Heart Infusion(BHI)에서 분리된 Shigella sonnei 콜로니 몇 개를 섭씨 35-37도에서 16-24시간 동안 5ml의 BHI 육수로 옮깁니다.

다음날, 각 균주에 대해 연속 희석을 수행하고 희석액을 비선택적 한천 플레이트에 도금하여 하룻밤 배양의 밀리리터당 집락 형성 단위를 결정합니다. 다음으로, 하룻밤 배양액과 희석 튜브를 사용하여 V.Parahaemolyticus 균주와 non-V를 서로 다른 부피로 혼합합니다. Parahaemolyticus 종을 생성하고 100 마이크로 리터의 박테리아 혼합물을 개별 발색성, TCBS 및 TSAS 한천 플레이트에 퍼뜨립니다.

섭씨 35도에서 37도까지 96시간 후, 발색 플레이트와 TCBS 플레이트의 성장과 형태 차이에 따라 콜로니를 세십시오. 선택적 및 차등 매체에서 박테리아 성장에 대한 굴 균질액의 효과를 평가하려면 먼저 고기와 주류를 포함하여 최소 12개의 연체동물 조개류에서 최소 50g의 굴 고기의 무게를 측정합니다. 그런 다음 굴 조직에 동일한 질량의 PBS를 추가하고 혼합물을 90초 동안 고속으로 혼합합니다.

다음으로, PBS 400g에 희석된 굴 균질산 100g을 넣고 혼합물을 1분 동안 고속으로 블렌딩합니다. 그런 다음 균질산염을 오토클레이브합니다. 냉각 후 하룻밤 V.Parahaemolyticus 및 non-V를 각각 100마이크로리터씩 추가합니다.

Parahaemolyticus 배양을 굴 슬러리에 주입하고, 균질기를 사용하여 박테리아 세포를 굴 균질액과 혼합합니다. 시연된 바와 같이 PBS에서 스파이크 굴 균질화의 음수 3 희석액에 10 곱하기 10을 10 곱하기 만들고 각 희석액 100 마이크로 리터를 개별 발색, TCBS 및 TSAS 플레이트에 펴 놓습니다. 섭씨 35도에서 37도에서 96시간 후, 발색 및 TCBS 한천의 실제 콜로니 수를 하룻밤 배양에서 수행된 표준 플레이트 수에서 추론한 예상 콜로니 수와 비교합니다.

이 연구에 사용된 균주의 성장 및 집락 형태를 결정하기 위해 박테리아를 선택적 및 차별적 배지에서 성장시켰습니다. TCBS는 청록색 V.Parahaemolyticus 및 노란색 V.Cholerae를 포함한 일부 Vibrio 종의 분리에 사용되는 기존 배지입니다. 식품 및 환경 샘플에서 임상적으로 관련된 Vibrio 종을 선택하기 위해 발색 배지를 사용하면 cyan V.Parahaemolyticus 및 magenta V.Cholerae가 생성됩니다.

굴 균질산염이 있는 상태에서 발색 한천 플레이트에서 자란 V.Parahaemolyticus의 군집은 비선택적 배지와 유사한 수로 관찰되며, 이는 발색 매체의 검출 한계가 식품 매트릭스가 있는 경우에도 비선택적 배지의 검출 한계와 유사함을 시사합니다. 또한 V.Parahaemolyticus의 성장과 회복은 non-V의 존재에 의해 영향을 받지 않습니다. Parahaemolyticus 종은 환경 샘플이 특히 농축 절차 후에 다양한 Vibrio 종을 많이 포함하기 때문에 차별 및 선택적 배지에 필수적인 속성입니다.

또한, 열불안정 용혈구 PCR에 의한 TCBS와 발색 한천의 비교는 발색 한천에 대한 더 높은 민감도와 특이성을 나타내며, 이는 V.Parahaemolyticus를 검출하고 식별하기 위한 이 차등 및 선택적 매체에 대해 전반적으로 더 나은 성능을 나타냅니다. 일단 마스터하면 약 50개 균주의 테스트 및 배양 시간을 포함한 전체 절차를 적절하게 수행할 경우 30일 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 배양에 부지런히 라벨을 붙이고 항상 무균 기술을 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 콜로니 PCR과 같은 다른 방법을 수행하여 이 특정 분리물이 독성 유전자를 가지고 있습니까? 개발 후 이 기술은 식품 안전 및 공중 보건 분야의 연구자들이 조개류와 강어귀 환경에서 비브리오 종 검출을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 표준 플레이트 계수를 수행하는 방법과 성장 배지의 민감도, 특이성 및 검출 한계를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

병원균 및 뜨거운 매체로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 보호복 착용, 열린 상처 덮기, 생물학적 유해 폐기물 분리와 같은 예방 조치를 항상 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.