양 졸 - 겔 파생 된 단백질 마이크로 어레이 개발을위한 안내 자료 심사 방식

이 절차의 전반적인 목표는 마이크로어레이 제조를 위한 새로운 소울 겔 기반 재료를 식별하고 나노 부피 효소 분석에 사용하는 것입니다. 이는 인쇄 공정 중에 마이크로어레이 인쇄 핀에서 겔화되는 것을 방지할 수 있을 만큼 충분히 긴 ation 시간을 가진 재료를 먼저 식별함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 마이크로어레이로 인쇄할 수 있는 능력, 재현성, 균열 접착 품질에 대한 내성, 바람직하지 않은 상 분리 및 궁극적으로 포획된 효소에 대한 높은 활성에 대해 긴 ation 시간을 가진 물질을 평가하는 것입니다.

다음으로, 관심 효소를 최적의 재료를 사용하여 마이크로어레이로 인쇄하고 분석 용액을 과도하게 스폿하고 측정 가능한 효소 반응을 생성하는 능력을 테스트합니다. 마지막 단계는 관심 효소를 사용하여 재현성이 높은 분석을 제공하고 정량적 데이터를 생성할 수 있는 물질의 능력을 평가하는 것입니다. 그런 다음 어레이 제작을 위한 최종 재료가 선택됩니다.

궁극적으로, 소울 겔 유래 단백질 마이크로어레이는 효소 활성을 감소시키는 작은 분자를 식별하는 데 사용됩니다. 플레이트 기반 스크리닝과 같은 기존 방법에 비해 이 방법의 주요 장점은 소량의 시약을 사용하여 체계적인 방식으로 많은 수의 물질을 매우 빠르게 스크리닝할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 인쇄 핀 내에서 재료 젤이 생길 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

그런 다음 제대로 청소하면 인쇄할 수 없는 재료로 해석될 수 있는 누락된 부분이 발생합니다. 시작하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 수많은 첨가제 용액을 준비합니다. 대부분의 용액은 올바른 조건에서 최대 한 달 이상 미리 만들어 보관할 수 있지만 일부는 실험 당일에 만들어야 합니다.

규산나트륨 기반 톱은 사용 직전에 혼합하고 얼음 위에 보관하십시오. SOS는 대기 시간이 길어지면 DATION 시간이 줄어들고 일관되지 않으므로 물을 추가한 후 1시간 이내에 사용해야 합니다. 다음으로, 2.5시간 이상의 팽창 시간으로 인쇄 가능한 재료로 사용할 수 있는 조합을 식별하기 위해 함께 제공되는 텍스트 프로토콜의 지시에 따라 완충액, salans 폴리머 및 장기 레인의 다양한 조합을 준비합니다.

여러 조합이 확인되면 인쇄실 내부의 습도를 80-90%로 설정하면 습도가 80% 미만이면 프린터와의 작은 증착량으로 인해 샘플이 증발하고 인쇄가 일치하지 않을 수 있습니다. 이제 Chip Writer Pro 프로그램을 사용하여 인쇄할 어레이 패턴을 정렬합니다. XY 방향으로의 이동을 초당 10mm로 설정하고 Z 방향의 샘플 접근 속도를 초당 2mm로 설정하고 앞에서 식별한 톱 젤 조합을 사용하여 2.5초의 샘플 로딩 시간을 설정합니다.

25마이크로리터의 기본 물질을 해당 폴리머, 유기 레인 및 사전 스크리닝 과정을 통해 확인된 저분자 첨가제를 결합하여 준비합니다. pH가 8.0인 50밀리몰 힙을 384웰 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰에 사용합니다. 그런 다음 이중 증류수에서 100 미크론 직경의 최대 4 개의 슬롯 형 피복 핀을 초음파 처리합니다.

15분 후 질소 흐름 아래에서 시도해 보십시오. 그런 다음 파이프 클리너를 사용하여 핀 홀더 내부의 잔여 수분을 제거하고 접촉 핀 인쇄 로봇의 프린트 헤드에 핀을 조심스럽게 놓습니다. 잔여 수분을 제거하지 않으면 핀이 홀더와 함께 자유롭게 움직이는 데 방해가 되어 스폿을 놓칠 수 있습니다.

그런 다음 인쇄 직전에 해당 SA의 25마이크로리터를 우물에 추가합니다. 위아래 피펫팅 동작을 사용하여 용액을 혼합합니다.피펫으로 혼합할 때 50회 반복합니다. 용액에 통합되는 공기의 양을 최소화하십시오.

기포는 핀 내에 샘플이 완전히 적재되는 것을 방지합니다. 다음으로, 핀을 샘플로 내려 로드합니다. 핀이 로드되면 인쇄 프로세스를 시작하고 샘플을 하나의 슬라이드 표면에 인쇄합니다.

후속 소스 플레이트에 소금을 추가하기 전에 인쇄 프로세스를 일시 중지하십시오. 글쎄, 프로세스가 일시 중지 된 상태에서 자석을 사용하여 인쇄 핀을 제거하고 프린트 헤드에 파이프 클리너를 놓아 프린트 헤드에 습기가 쌓이는 것을 방지합니다. 그런 다음 인쇄 핀을 이중 증류수로 헹구고 깨끗한 이중 증류수로 30초 동안 초음파 처리합니다.

그런 다음 질소 흐름 아래에서 인쇄 핀을 건조시킨 다음 핀을 프린트 헤드에 다시 넣습니다. 12까지 소스 판 안에 남아 있는 모든 표본을 위해 섞고, 인쇄하고 청소하는 계속해서, 000의 반점, 직경에 있는 100개 미크론은 단 하나 활주에 예금될 수 있다. 인쇄가 완료되면 80-90% 습도의 인쇄 챔버 내에서 최소 30분에서 최대 24시간 동안 어레이를 숙성합니다.

25 마이크로 리터의 1 밀리 몰, 아세틸 콜린 요오드화물, 0.14 마이크로 리터의 5 밀리 몰 바디 파이, FIL 시스테인 및 25 밀리 몰 트리스를 pH 7.0의 4 % 글리세롤과 결합하여 384 웰 마이크로 타이터 플레이트의 웰에서 용액을 기포를 생성하지 않고 천천히 혼합하여 사용 직전에 50 마이크로 리터의 양성 대조군을 준비합니다. 다음으로, 0.14 마이크로리터의 5 밀리몰 보아이 PI FIL 시스테인과 pH 7.0의 25 밀리몰 트리스 49.86 마이크로리터를 384 웰 마이크로 적정 플레이트의 다른 웰에 결합하고 이전 섹션에서 설명한 것과 동일한 프로세스를 사용하여 숙성된 마이크로어레이에 대조군을 부드럽게 인쇄하여 사용 직전에 negative control을 준비합니다. 그러나 직경이 100미크론인 핀 대신 직경이 235미크론인 치프 핀을 슬롯에 넣었습니다.

이렇게 하면 용액이 이전에 침전된 지점을 완전히 덮을 수 있습니다. 스팟은 아세틸콜린의 자동 가수분해로 인해 실온에서 1시간 동안 80-90%습도에서 어레이를 노화시킵니다. 배양 시간이 길어지면 효소 활성이 향상되어 위양성이 발생할 수 있습니다.

알파 이노테크 노보 어레이 이미저가 켜져 있고 아세틸콜린 에스테라제 마이크로어레이 측정을 위해 478 플러스 또는 마이너스 17 나노미터 여기와 538 플러스 또는 마이너스 21 나노미터 방출 필터가 장착되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 부분이 위를 향하도록 슬라이드를 슬라이드 홀더에 놓습니다. 미리보기 섹션의 수를 설정하여 현미경 슬라이드의 양쪽에 있는 하나 이상이 자동 노출을 사용하여 최소 4마이크로미터의 해상도로 미리보기되도록 합니다.

매개변수가 허용 가능한 것으로 확인되면 슬라이드 이미지를 가져와 TIFF 파일로 저장합니다. 다음으로, 이미지 J 64에서 획득한 슬라이드 이미지를 엽니다. 타원형 선택 도구를 클릭하고 각 지점을 선택합니다.

관찰된 스폿보다 약간 큰 영역을 선택하고 이미지 J.의 주관성을 줄이기 위해 스폿 사이에 일관된 크기를 사용해야 합니다. 그런 다음 측정 옵션을 사용하여 각 스폿의 신호 강도를 측정합니다. 분석 탭 아래에서. 25개의 유사한 양성 대조군 지점의 강도를 평균하고 25개의 유사한 음성 대조군 지점의 평균 강도로 나누어 개별 재료 조성에 대한 양의 대조군 대 음성 대조 비율을 얻습니다.

여기에 표시된 것은 이러한 방법을 사용하여 준비된 결과 마이크로어레이의 동적 범위의 예입니다. 높은 컨트롤은 밝은 녹색 영역을 초래한 반면, 낮은 컨트롤을 사용하면 훨씬 더 어두운 부분이 나타납니다. 이미지 J 64에 의해 측정된 강도는 높은 대조군이 평균 약 22,000개의 상대 형광 단위를 나타내고, 낮은 대조군은 평균 8,000에 가까운 것을 보여준다.

점선은 평균에서 3 표준 편차를 나타냅니다. 다음은 화합물 1 및 화합물 2로 확인된 ameral sier alkaloids의 합성 유사체의 명예 어레이 스크리닝을 위한 마이크로어레이의 예입니다. 두 축 모두 형광 신호에 의해 결정된 효소의 백분율을 나타냅니다.

중복에서 점들이 대각선에 가까우면 높은 분석 재현성을 나타냅니다. 두 가지 다른 잠재적 억제제의 IC 50 플롯이 여기에 나와 있습니다. 화합물 1은 IC 50 수준이 16 마이크로몰인 반면, 화합물 2의 IC 50은 21 마이크로몰 대표적인 반점을 보여주기 위해 억제제 농도에 비례하는 신호의 차이를 보여주기 위해 위에 표시되었습니다.

여기에 표시된 어레이는 4개의 상이한 키나아제, P 38 맵 키나아제, EGFR 및 GSK로 인쇄되었으며, A TP를 함유하는 완충액 단독 완충액 및 A TP 및 효소 활성 억제제인 starro 스포린을 함유하는 완충액으로 중복 인쇄되었습니다. 결과는 여기에 설명된 바와 같이 그에 따른 형광 강도를 기반으로 키나아제 억제제 starro sporin의 유의미한 효과를 보여줍니다. 여기에 사용된 stor sporin의 농도에서 볼 수 있는 가장 큰 차이는 P 38 지점과 비교한 것입니다.

여기서, P 30 8:00 AM BP 마이크로어레이의 대표적인 반점들이 나타나 있으며, 이는 다양한 농도의 스토 스포린으로 과다 점포되었다. 표시된 바와 같이, 이 분자의 IC50은 1마이크로몰로 결정되었으며 마스터되면 오른쪽 그래프에 표시됩니다. 이 절차는 적절하게 수행되면 몇 시간 안에 완료할 수 있습니다.

면역 분석 또는 단백질 상호 작용 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 진단 또는 소분자 발견과 관련된 추가 질문에 답할 수도 있습니다.