양 졸 - 겔 파생 된 단백질 마이크로 어레이 개발을위한 안내 자료 심사 방식

이 절차의 전반적인 목표는 마이크로어레이 제작을 위한 새로운 졸-겔(sol-gel) 기반 재료를 발굴하고, 이를 나노 부피 효소 분석에 활용하는 것입니다. 이는 우선 인쇄 과정 중 마이크로어레이 프린팅 핀 내부에서 겔화되는 것을 방지할 수 있을 만큼 충분히 긴 겔화 시간을 갖는 재료를 식별함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 겔화 시간이 긴 재료들을 대상으로 마이크로어레이로서의 재현 가능한 인쇄 능력, 균열에 대한 저항성, 접착 품질, 원치 않는 상분리 여부, 그리고 최종적으로 포집된 효소의 높은 활성도를 평가하는 것입니다.

다음으로, 최적의 재료를 사용하여 관심 효소를 마이크로어레이로 프린팅하고, 어세이 용액을 오버스팟(over spot)하여 측정 가능한 효소 반응을 생성하는 능력을 테스트합니다. 마지막 단계는 관심 효소를 사용하여 높은 재현성의 어세이를 제공하고 정량적 데이터를 생성하는 재료의 능력을 평가하는 것입니다. 이후 어레이 제작을 위한 최종 재료를 선정합니다.

궁극적으로, 솔 젤(sol gel) 유래 단백질 마이크로어레이는 효소 활성을 감소시키는 저분자 화합물을 식별하는 데 사용됩니다. 플레이트 기반 스크리닝과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 방법의 주요 장점은 적은 양의 시약을 사용하여 매우 빠르게 대량의 물질을 체계적인 방식으로 스크리닝할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 사용자는 프린팅 핀 내부에서 물질이 젤화될 수 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

만약 이를 제대로 세척하지 않으면, 인쇄 불가능한 물질로 해석될 수 있는 미세한 오염 부위가 남게 됩니다. 우선, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 여러 가지 첨가제 용액을 준비하십시오. 많은 용액은 미리 제조하여 적절한 조건에서 한 달 또는 그 이상 보관할 수 있으나, 일부 용액은 실험 당일에 제조해야 합니다.

규산나트륨 기반의 톱을 사용 직전에 혼합하고, 반드시 얼음 위에 보관하십시오. 물을 첨가한 후 1시간 이내에 SOS를 사용해야 하며, 대기 시간이 길어지면 DATION 시간이 단축되고 불일치하는 결과가 나타납니다. 다음으로, 동봉된 텍스트 프로토콜의 지침에 따라 완충액, salans 폴리머 및 organs lanes의 다양한 조합을 준비하여, 2.5시간 이상의 팽창 시간을 가지며 프린팅 가능한 재료로 사용할 수 있는 조합을 식별하십시오.

여러 조합이 확인되면 프린팅 챔버 내의 습도를 80~90%로 설정하십시오. 습도가 80% 미만일 경우, 프린터의 적은 증착 부피로 인해 시료 증발 및 프린팅 불일치가 발생할 수 있습니다. 준비가 완료되면 Chip Writer Pro 프로그램을 사용하여 프린팅할 어레이 패턴을 배치하십시오. XY 방향의 이동 속도는 10 millimeters per second로, Z 방향의 시료 접근 속도는 2 millimeters per second로 설정하고, 앞서 확인한 saw gel 조합을 사용하여 시료 로딩 시간을 2.5 second로 설정하십시오.

사전 스크리닝 과정을 통해 확인된 해당 폴리머, 유기 란(organo lanes) 및 저분자 첨가제를 혼합하여 25 µL의 기초 재료를 준비합니다. pH 8.0의 50 mM HEPES 완충액을 384-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 그런 다음 100 µm 직경의 슬롯형 시스 핀(slotted sheath pins)을 최대 4개까지 2회 증류수에서 초음파 처리합니다.

15분 후, 질소 스트림을 이용해 건조시킵니다. 다음으로, 파이프 클리너를 사용하여 핀 홀더 내부의 잔류 수분을 제거하고 핀을 컨택 핀 프린팅 로봇의 프린트 헤드에 조심스럽게 장착합니다. 잔류 수분을 제거하지 않으면 핀이 홀더 내에서 자유롭게 이동하는 것이 방해되어 도포 누락 부위가 발생할 수 있습니다.

그 다음, 프린팅 직전에 해당 SA 25 µL를 웰에 추가합니다. 피펫으로 혼합할 때는 피펫팅을 위아래로 50회 반복하여 용액을 섞어줍니다. 이때 용액에 공기가 혼입되는 양을 최소화하십시오.

기포가 있으면 핀 내부에 샘플이 완전히 로딩되지 않습니다. 다음으로, 핀을 샘플에 담가 샘플을 로딩합니다. 핀 로딩이 완료되면 프린팅 프로세스를 시작하여 슬라이드 표면 한 곳에 샘플을 프린팅합니다.

다음 소스 플레이트에 염을 추가하기 전에 프린팅 과정을 일시 정지하십시오. 과정이 정지된 상태에서 자석을 사용하여 프린팅 핀을 제거하고, 프린트 헤드 내에 습기가 쌓이는 것을 방지하기 위해 파이프 클리너를 프린트 헤드에 넣으십시오. 그런 다음 프린팅 핀을 2중 증류수로 헹구고 깨끗한 2중 증류수에서 30초 동안 초음파 처리하십시오.

다음으로, 질소 기류 하에서 프린팅 핀을 건조시킨 후 핀을 프린트 헤드에 다시 장착합니다. 소스 플레이트에 남아 있는 모든 샘플에 대해 혼합, 프린팅 및 세척 과정을 반복합니다. 단일 슬라이드에 직경 100 microns의 스폿을 최대 12,000개까지 증착할 수 있습니다. 프린팅이 완료되면, 프린팅 챔버 내에서 80~90% 습도로 최소 30분에서 최대 24시간 동안 어레이를 에이징합니다.

사용 직전에 1mM acetylcholine iodide 25 µL와 5 mM BODIPY FL cysteine 0.14 µL, 그리고 4% glycerol이 포함된 pH 7.0의 25 mM tris 25 µL를 384-well 마이크로타이터 플레이트의 웰에 혼합하여 양성 대조군 50 µL를 준비하십시오. 기포가 생기지 않도록 피펫으로 용액을 천천히 흡입하고 배출하여 혼합합니다. 다음으로, 사용 직전에 5 mM BODIPY FL cysteine 0.14 µL를 4% glycerol이 포함된 pH 7.0의 25 mM tris 49.86 µL에 혼합하여 384-well 마이크로타이터 플레이트의 다른 웰에 넣고 부드럽게 혼합하여 음성 대조군을 준비하십시오. 이전 섹션에서 설명한 것과 동일한 과정으로 대조군을 에이징된 마이크로어레이에 프린팅하십시오. 단, 직경 100 µm 핀 대신 직경 235 µm의 슬롯팅 칩 핀을 사용하십시오.

이를 통해 용액이 이전에 점적된 스팟들을 완전히 덮도록 합니다. 아세틸콜린의 자동 가수분해로 인해 스팟들을 80에서 90% 습도의 상온에서 한 시간 동안 숙성시킵니다. 배양 시간이 길어지면 효소 활성 증가로 인해 위양성이 나타날 수 있습니다.

Alpha Innotech Novo Array Imager의 전원이 켜져 있는지 확인하고, acetylcholine esterase 마이크로어레이 측정을 위해 478 ± 17 nm 여기 필터와 538 ± 21 nm 방출 필터가 장착되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 스폿이 위를 향하도록 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣으십시오. 자동 노출을 사용하여 현미경 슬라이드 양측에 최소 하나 이상의 프리뷰 섹션이 포함되도록 프리뷰 섹션 수를 설정하고, 최소 해상도는 4 µm로 설정하십시오.

파라미터가 적절하다고 판단되면, 슬라이드 이미지를 획득하여 TIFF 파일로 저장하십시오. 다음으로, 획득한 슬라이드 이미지를 image J 64에서 엽니다. Oval Selection Tool을 클릭하고 각 스팟을 선택하십시오.

관찰된 스팟보다 약간 더 큰 영역을 선택하고, Image J의 주관성을 줄이기 위해 스팟 간에 일관된 크기를 사용하십시오. 그런 다음 Analyze 탭의 Measure 옵션을 사용하여 각 스팟의 신호 강도를 측정합니다. 25개의 유사한 양성 대조군 스팟의 평균 강도를 25개의 유사한 음성 대조군 스팟의 평균 강도로 나누어 개별 재료 조성에 대한 양성 대조군 대비 음성 대조군 비율을 구합니다.

여기에 제시된 것은 이 방법들을 사용하여 제작된 마이크로어레이의 다이내믹 레인지 예시입니다. 고농도 대조군은 밝은 녹색 영역으로 나타난 반면, 저농도 대조군은 훨씬 어두운 스폿으로 나타났습니다. Image J 64로 측정한 강도는 고농도 대조군의 평균이 약 22,000 relative fluorescent units였으며, 저농도 대조군의 평균은 8,000에 가까웠습니다.

점선은 평균으로부터 3표준편차를 나타냅니다. 다음은 화합물 1 및 화합물 2로 확인된 ameral sier 알칼로이드의 합성 유사체에 대한 honor array 스크리닝의 예시 마이크로어레이입니다. 양쪽 축은 형광 신호로 결정된 효소의 백분율을 나타냅니다.

중복 측정 시 점들이 대각선에 가깝게 위치할수록 분석 재현성이 높음을 나타냅니다. 여기서는 두 가지 서로 다른 잠재적 억제제의 IC 50 그래프가 제시되어 있습니다. 화합물 1은 16 micromolar의 IC 50 수준을 보인 반면, 화합물 2의 IC 50는 21 micromolar였습니다. 억제제 농도에 비례하는 신호의 차이를 보여주기 위해 대표적인 스팟들이 위에 표시되어 있습니다.

여기에 표시된 어레이는 P 38 map kinase, EGFR, GSK의 네 가지 서로 다른 키나아제로 프린팅되었으며, 완충액 단독, ATP 함유 완충액, 그리고 효소 활성 억제제인 staurosporine이 포함된 ATP 함유 완충액을 덧씌워 프린팅하였습니다. 결과는 여기에 설명된 바와 같이, 생성된 형광 강도를 기반으로 키나아제 억제제인 staurosporine에 의한 유의미한 효과를 보여줍니다. 여기에 사용된 staurosporine 농도에서 관찰된 가장 큰 차이는 P 38 스팟에서 나타났습니다.

여기 stor sporin의 다양한 농도로 오버스팟팅(over spotted)한 P 30 8:00 AM BP 마이크로어레이의 대표적인 스팟들을 보여줍니다. 표시된 바와 같이, 이 분자의 IC 50는 1 µM로 결정되었으며 오른쪽 그래프에 나타나 있습니다. 이 기술을 숙달하면, 본 절차에 따라 적절히 수행할 경우 몇 시간 내에 완료할 수 있습니다.

진단 또는 저분자 화합물 발굴과 관련된 추가적인 질문에 답하기 위해 면역 분석법이나 단백질 상호작용 분석법과 같은 다른 방법들도 수행할 수 있습니다.