Name: 양 졸 - 겔 파생 된 단백질 마이크로 어레이 개발을위한 안내 자료 심사 방식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 학습하세요 양 졸-겔 기반 재료 선별을 통한 단백질 마이크로어레이 제작 방법을. 핀 프린팅 기술로 아세틸콜린에스터레이스 및 멀티키나아제 마이크로어레이를 개발하여 소분자 선별 효율성을 높입니다.

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저자는 단백질 마이크로 어레이의 개발에 도움 마리아 몬턴, 줄리 LEBERT, Jessamyn 작은, 신화 창 로라 Lautens 감사합니다. 저자는 또한이 작품 자금에 대한 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회 (NSERC)을드립니다. 저자는 또한이 작품의 지원을위한 혁신과 온타리오 혁신 트러스트 캐나다 재단 감사합니다. JDB는 생 분석 화학 Biointerfaces에있는 캐나다 연구 의자를 보유하고 있습니다.

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</ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

여기에 설명 된 방법론은 빠른 속도로 재료의 큰 숫자를 선별 할 필요없이 최적의 재료를 식별하기위한 시간과 비용 효과적인 절차를 제작, 연락처 프린터와 인쇄 졸 - 겔 파생 물질을 식별하기위한 가장 적합한 것으로 선정되었다. ~ 20,000 잠재 물질의 총, 그것은 혼자 겔화 시간을 기준으로 인쇄에 적합한 있었다 ~ 200 자료를 확인 할 수있었습니다. 이 크게 이후의 인쇄 시험을 위해 준비 될 필요가 물질의 수를 감소. 이러한 인쇄 자료는 다음 768 물자 슬라이드 조합의 총 4 슬라이드 표면에 인쇄되었다. 평균 한 자료 50 점 / 복제는 샘플 로딩, 현장 증착 및 핀 청소 등 2 ~ 3 분에 인쇄 할 수 있습니다. 그 중, 155 물질 또는 약 20 %가 솔루션의 이해 당 반점의 최대 개수를 인쇄 허용 재현 스폿 크기를 생산. 그것은 주목해야한다 4 SL의IDE의 표면이 테스트 자료는 순서대로 더 나은 인쇄 : 아민&gt; 에폭시&gt; 알데히드&gt; PMMA, PMMA 슬라이드가 어떤 재료에 대한 유용한 배열을 생성하지 않았다. 이 가능성이 표면 코팅의 극성에 기인했다. 앞서 언급 한 슬라이드 표면의 비교, 더 극성 아민과 에폭시는 더 PMMA 슬라이드에 비해 수성 졸에 적합 하였다. 또한, 테스트 표면의, 아민 코팅 된 슬라이드 본드 음이온 졸을 입금에 대한 잠재적 인 양전하를 띤 표면을 제공합니다. 우리는 의심 실리카 슬라이드 졸이 표면을 따라 상호 작용 사이의 인터페이스에서 나노 입자. 에폭시 알데히드 슬라이드 표면은 모두 동일한 초기 충전 기반의 상호 작용이 부족하다. 최적의 자리 증착을 위해 그것은 매우 같은 Arrayit 같은 업체로부터 미리 코팅 된 슬라이드를 사용하는 것이 좋습니다. 사내 코팅이 좋지 현장 재현성 13으로 이어질 일치하지 않는 표면을 만들어, 어떤 경우에, 정량화 PROB로 이어질 수 있습니다LEMS. 동등한 중요성의 18 온도와 습도 자료의 &quot;인쇄 적성&quot;에 영향을줍니다. 온도 관련 효과에 더 자세한 연구가 수행되지 동안, 인쇄는 항상 실온에서 실시 (23 ± 3 ° C)이었다. 습도 (80 % 이상)도 작은 증착 볼륨 (0.7-2.3 NL)와 증발에 의한 불규칙한 형태의 증착을 방지하기 위해 인쇄 챔버 내에서 제어되었다. 자료 화면이 아프고 키니 아제, 단백질의 두 가지 유형의 근무 재료의 작은 집합 확인 된의 인쇄를 위해 특별히 최적의 졸 - 겔 파생 물질을 식별하는 방향으로 안내하는 동안. 사실, 키나제 마이크로 어레이 제작을 위해 식별 된 물질의 양이 SS + PVA + 글리세롤 기반으로했다, 두 물질은 아세틸 콜린 마이크로 어레이에 대해 선택한 26 물질에서 발견되었다. 이러한 &quot;최적의&quot;재료는 더 prote 개발을위한 일반적인 출발점을 제공 할 수이러한 조성물 중심에서 도핑 졸 - 겔 기반의 마이크로 어레이, 그리고 작은 화면은 마이크로 어레이 제작을위한 더 나은 재료를 식별 할 수 있습니다. 참고로 두 번째 점은 사용 된 효소의 중요성이다. 아세틸 콜린 (오히려 강력한 효소)의 경우, 분석 호환으로 식별 원래 66 자료 26 (또는 약 40 %)이 갇힌 아세틸 콜린의 활성을 유지했다. 하지만 더 민감한 키니 아제를 들어, 69 분석 호환 조성물 또는 물질의 약 3 %, 만 2 모든 키나아제의 활성을 유지 할 수 있었다. 다른 효소의 충분한 숫자가 결정적인 진술을 만들기 위해 연구되지 ​​않은 있지만, 그것은 상대적으로 불안정한 효소가 최적화 어레이 제작은 mutliplexed 마이크로 어레이 제작을 허용하는 단백질의 넓은 범위를 모함 수있는 물질의 식별로 이어질 수 있습니다 나타납니다. 선택된 단백질의 독립, 인쇄 자료를 식별하기위한 주요 컷 - 오프 계수는 오랫동안 필요로했다자료 겔화 시간 (&gt; 2.5 시간). SS 기반의 졸 - 겔 재료를 개발하면, 이온 교환 여과 후, 졸은 pH가 약 4이다, 있는지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 낮은 초기 산도와 졸은 효소 활성에 영향을 줄 수 있습니다. 19 조정은 SS에 DOWEX (이온 교환 수지)의 양 졸의 최종 pH를 변경할 수보다 낮은 중성 pH와 자료에 발생할 수 있습니다. 수지의 새로운 배치가 준비 될 때 SS에 수지의 비율은 프로토콜의 제 2의 절차에 따라 약 pH를 4로 졸을 생산하는만큼 조정해야합니다. 마찬가지로, 결정 DGS의 준비는 종종 생리 활성 물질의 포집을위한 DGS 기반 졸을 사용하는 경우 재료의 실패와 관련된 오류의 소스입니다. 자세히 여기에보고되지는 않았지만, 큰 관심은 polyglycerated 실리카를 생성 할 수 있습니다 특히 결정 DGS의 합성, 합성 과정에서 물의 존재를 피하기 위해 필요하는 동안주의 할 필요오히려 단량체 DGS보다 TES. 또한, DGS의 흡습 특성으로 인해, 결정 샘플은 건조 된 및 합성 후 한 6 개월 이내에 사용 저장합니다. 6개월 세 이상 결정 DGS도 산성 환경에서 초음파와 (때문에 부분적으로 응축 포리 규산염 물질)로 완전히 용해되지 않을 수 있습니다. 불완전 DGS 용해는 알려지지 통제 할 수없는 실리카 내용과, 따라서 덜 강력한 물질과 졸을 생산하고 있습니다. 연락처 인쇄 주목해야 할 중요한 점은 핀의 품질입니다. 손상되거나 잘못 취급 핀 (그림 9)는 인쇄되는 재료의 독립 재현 배열을 생성하지 않습니다. 이 부서 지거나 막혀 핀이 사용되지 않도록하기 위해 해부 현미경을 사용하여 핀의 품질을 확인하는 것이 좋습니다. 주의 처리는 핀이 긴 수명을 보장합니다. 핀의 자유로운 이동도 중요하다. 습기가 머리와 핀 사이의 프린트 헤드, 핀에 갇혀 경우올바르게 좌석 따라서 재료의 증착의 부족의 결과로, 표면에 적절한 접촉하지 않습니다하지 않습니다. 결론적으로, 우리는 고밀도 단백질을 첨가 핀 인쇄 된 마이크로 어레이 개발을위한 세부, 다단계 심사 방식을 제공하고 있습니다. 검사 더 집중 검사 한 다음 재료의 인쇄, 주어진 분석과 호환 효소 활성을 유지 할 수있는 물질을 식별 할 수 있도록 재료 특성의 최적화 (겔화 시간 및 인쇄) 포함됩니다. 이 안내 자료 심사 방식은 시간과 효율적인 고밀도 마이크로 어레이를 생산과 관련된 비용을 절감하기 위해 추가 마이크로 어레이 형식으로 적용 할 수 있습니다.

마이크로 어레이는 분석 처리량을 증가시키기위한 방법으로 과학 공동체 내에서 인기를 얻고있다. 마이크로 어레이 기술의 개발은 1990 년대 중반 유전자 발현 1을 평가하기 때문에, 마이크로 어레이, 단백질 - 단백질, 단백질 - 작은 분자 상호 작용을 식별하는 고유 한 특성을 가진 새로운 물질을 찾기 위해 높은 처리량 분석의 개발에 사용을 발견했습니다. 2-5 더 최근에, 마이크로 어레이는 적절한 형광을 사용하여 마이크로 어레이 자체에 효소 활성과 억제의 손쉬운 측정을 허용하는 특정 물질이 단백질이 속은되는 내 3 차원 마이크로 어레이 요소를 생성, 기능 단백질을 고정화하는 데 사용되는 것을 특징으로 개발 된 기판 매출에 결합 분석. 5-10 중요한 것은, 이러한 마이크로 어레이는 높은 병렬 방식으로 함께 필요한 모든 화면 샘플에 대한 구성 요소 및 컨트롤을 포함하도록 설계 할 수 있습니다. 5,8 &lt;/ P&gt; 단백질 마이크로 어레이의 초기 예는 일반적으로 공유 결합 첨부 고체 지원,에 단백질 고정화에 대한 표준 방법을 사용하여 제조 하였다, 11 궁합이 3 캡처 및 물리적 흡착. 12 바이오 고정화 이러한 방법에 필요한 증가 된 시료 농도와 가속 반응 속도론을 허용하지만 분석 소형화, 그들은 각각의 단점을 겪고 있습니다. 일반적으로, 모든 표면의 화학적 변형으로 인하여 고유의 생체 분자 기능의 감소, 활성 사이트에 대한 액세스를 방해, 또는 비 특정 고정으로 인해 잘못된 방향을 발생할 수 있습니다. 따라서, 생리 활성 물질의 증착의 증가 가능성이 인위적으로 표면에 생체 분자를 바인딩 할 필요로 인해 발생하는 반응에도 불구하고 모든 메소드 낮은 분석 감도 결과. 기능성 생리 활성 물질의 마이크로 어레이의 생산을위한 새로운 접근 방식은 단백질 도핑의 핀 출력을 통해서이다일반적으로 하나 기능화 유리 슬라이드 또는 마이크로 웰 플레이트의 각 우물이다 단단한 지지대 위에 실리카 졸. 졸 - 겔 과정 자체는 상온에서 수성 환경에서 일어나는, 그리고 내 13로드뿐만 아니라 여러 구성 요소의 함정 수사 높은 단백질을 허용, 인쇄 한 다음 3D 매트릭스 내에서 모함 생체 분자에 젤되어 액체 전구체 같은 마이크로 어레이 요소입니다. 졸 - 겔 파생 물질의 13,14 재봉은뿐만 아니라 다른 버퍼를 사용하는 (산도, 이온 강도)를 통해 수용성 요소를 변경하여 다른 실리카 전구체의주의 깊은 선택을 통해 수행하고 포용 할 수 있습니다 최적의 재료를 달성하기 위해 다양한 첨가제 (고분자, 작은 분자)의 특정 자연 갇힌되는 생리 활성 물질에 따라 달라집니다. 10 핀 출력을 통해 졸 - 겔 파생 된 단백질 마이크로 어레이의 개발과 관련된 잠재적 인 제한은핀 겔화하지 않고 인쇄 또는 한 번 표면에 인쇄 바람직하지 않은 속성 (재현이 자리 크기, 균열, 접착 불량, 분석 구성 요소와 호환되지 않는 가난한 단백질의 활동을)를 표시 할 수있는 졸 - 겔 기반 복합 재료를 식별해야합니다. 5 동시 이 매개 변수의 모든 최적화 접근 상기 자료는 새로이 설계 할 수 있습니다 배제 또는 직렬 방식으로 천천히 살펴 보았다. 반면에, 많은 천 또는 자료의 수만 무작위로 선별도 시간도 비용 효과적입니다. 이 문서에서는, 우리는 무작위 재료의 큰 숫자를 화면에 필요없는 단백질 마이크로 어레이의 제작에 적합한 재료를 신속하게 식별 할 수있는 감독 검사 방법을 설명합니다. 유도 방식을 사용하여, 마이크로 어레이 인쇄에 적합한 재료를 먼저 확인하는 작은 규모의 일련의 화면 뒤에 식별 졸 - 겔 materi에 파생 최적알 조합이이 균열없이 재현성 인쇄 주어진 분석과 호환 될 수 있습니다. 마지막으로, 최적의 재료는 최종적인 작은 분자 스크리닝 검사에서 효소 활성 및 성능의 유지에 따라 식별됩니다. 이 방법으로 최적의 재료는 몇백 분석 단계를 사용하여 여러 천 후보를 식별 할 수 있습니다. 우리는 고밀도 아세틸 콜린과 multikinase 마이크로 어레이 및 작은 분자 검사에 대한 이러한 마이크로 어레이의 사용을 모두 제작이 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td><강>시약/재료</강></td></tr><tr><td>폴리(비닐 알코올) (PVA)</td><td>시그마-알데리360627</td><td></td><td>80% 하이드로자이드, Mw 600</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 600 (PEG)</td><td>시그마-알데리크</td><td>87333</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>폴리에틸레니민 (PEI)</td><td>시그마-알데리482595</td><td></td><td>50 wt% 용액</td></tr><tr><td>카르복시에틸실란트리올 (Si-COOH)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIC2263.0</td><td>물</td></tr><tr><td>N- (3- 트리에 톡시 실릴 프로필) 글루코나미드 (GLS)</td> <td>Gelest, Inc.</td><td>SIT8189.0</td><td>에탄올 비스</td></tr><tr><td>[(3- 메틸 디메 톡시 실릴) 프로필] 폴리 프로필렌 산화물 (MDSPPO)</td> 중 50 % <td>Gelest, Inc.</td><td>SIB1660.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>메틸 트리 메 톡시 실란 (MTMS)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIM6560.1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>비스(트리에톡시실리)에탄(비스-테오스)</td><td>겔레스트, Inc.</td><td>SIB1817.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)</td><td>Gelest, Inc.</td><td>SIA0610.0</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알데리치</td><td>49767</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-소르비톨</td><td>시그마-알데리히</td><td>240850</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>D-(+)-트레할로스 이수화물</td><td>시그마-알데리히</td><td>T9531</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마-알데리치</td><td>X-100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>N&엡실론; </스팬>-아세틸-L-라이신</td><td>시그마-알데리히</td><td>A4021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>트리스 (하이드 록시 메틸) 아미노 메탄</td><td>시그마 - 알데리</td><td>154563</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마-알데리히</td><td>H3375</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>수산화나트륨, 1.0 N</td><td>LabChem Inc.</td><td>LC24350-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>염산, 1.0 N/0.1 N</td><td>LabChem Inc.</td><td>LC15300-2/LC152220-2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Sigma-Alderich</td><td>M8266</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>실험실에서 준비</td>된 <td>디글리세롤실란(DGS)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>실리케이트 나트륨 용액</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS338-1</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dowex 50WX8-100 이온 엑스찬스 수지</td><td>Sigma-Alderich</td><td>217492</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>아세틸티오콜린 요오드화물</td><td>시그마-알데리히</td><td>1480</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>아세틸콜린에스테라제 from Electrophorus electricus (electric eel)</td><td>Sigma-Alderich</td><td>C2888</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BODIPY FL L-Cystine</td><td>Invitrogen</td><td>B-20340</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Pro-Q Diamond 인산단백질/인산펩타이드 마이크로어레이 스테인 키트</td><td>Invitrogen</td><td>P33706</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>아데노신 5'트리포스페이트 디소듐 염 (ATP) 용액</td><td>시그마-알데리치</td><td>A6559</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MAP 키나아제 2 (MAPK2)</td><td>EMD 밀리포어</td><td>454850</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>p38&alpha;/SAPK2a (T106M), 활성</td><td>EMD Millipore</td><td>14-687M</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>표피 성장 인자 (EGFR)</td><td>EMD Millipore Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycogen synthase kinase 3&beta에 의해 기증됨; (GSK-3&베타;)</td><td>EMD 밀리포어</td><td>14-306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MAPK2 및 p38&alpha;에 대한</td> <td>Myelin 염기성 단백질(MBP)</td><td>EMD Millipore</td><td></td> 기질,</tr><tr><td>GSK-3&beta에 대한</td> Millipore<td>GSM</td><td>EMD Millipore</td><td>12-533</td> 기질에</tr> 의해 기증됨;<tr><td>Poly-glu-tyr 폴리펩티드 p(E4Y)</td><td>EMD Millipore</td><td>12-440</td><td>기판 EGFR</td></tr><tr><td>스텔스 핀</td><td>ArrayIt</td><td>SMP3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>스텔스 핀</td><td>ArrayIt</td><td>SMP7</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>아민 코팅 슬라이드</td><td>ArrayIt</td><td>SMM2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>알데히드 코팅 슬라이드</td><td>ArrayIt</td><td>SMA2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>노출 코팅 슬라이드</td><td>ArrayIt</td><td>SME2</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>폴리(메틸메타크릴레이트)(PMMA) 코팅 슬라이드</td><td>Exakt Technologies Inc.</td><td>41500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0.2-&뮤; m 주사기 필터</td><td>PALL Life Sciences</td><td>4612</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Virtek Contact Printer</td><td>BioRad</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Novaray 형광 슬라이드 이미저</td><td>Alpha Innotech Corporation</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>데스크탑 마이크로어레이 원심분리기</td><td>ArrayIt</td><td>MHC110V</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MilliQ Synthesis A10</td><td>Millipore</td><td></td><td>실험에 필요한 모든 물을 여과하는 데 사용됩니다.</td></tr></tbody></table>

양 졸 - 겔 파생 된 단백질 마이크로 어레이 개발을위한 안내 자료 심사 방식

A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays

마이크로 어레이는 새로운 재료와 작은 분자 약물 리드의 발견을위한 높은 처리량 분석의 개발에 사용을 발견했습니다. 여기에 우리는 3 차원 단백질 마이크로 어레이 생성을 % s 적당하다 졸 - 겔 기반의 물질을 식별하는 유도 물질 스크리닝 방법을 설명합니다. 방법은 먼저, 마이크로 어레이로 인쇄 할 수있는 물질을 식별하는 최대 효소 활성의 유지에 따라 특정 효소 분석과 호환되는 사람들, 그리고 최적의 재료에있는 숫돌을 식별하여 재료의 수를 좁혀. 이 방법은 암에 관련된 네 가지 핵심 키나아제의 세트를 사용하여 아세틸 콜린과 다른 사용하여 두 개의 서로 다른 효소 분석, 하나에 적합한 마이크로 어레이를 개발하기 위해 적용됩니다. 각각의 경우에, 그것은 양적 작은 분자 스크리닝 분석 및 용량 의존적으로 억제 반응 곡선의 생산에 사용할 수있는 마이크로 어레이를 생성 할 수있었습니다. 중요한 기능은 많은 친구를 선별하기리얼 베스트 효소 활성의 마이크로 어레이 제작 및 유지를 모두 적합한 재료의 유형에 대한 정보를 생산. 재료 데이터를 최적의 고밀도 졸 - 겔 파생 된 마이크로 어레이를 조정에 필요한 기초 자료 요구에 대한 통찰력을 제공합니다.

자료 화면에 대한 가이드 요인 분석을 수행함으로써, 우리는 ~ 20,000 인쇄에 적합한 겔화 시간을 가지고 몇 백 테스트를 재료의 수를 최소화 할 수 있었다. 의 엄격한 가이드 라인이 필요한 자료 겔화 시간을 적용하여 2.5 시간 이상이, 인쇄 핀을 방해하거나 재현 불가능 배열을 생성 할 가능성이 자료는 인쇄되지 않았다. 충분한 (&gt; 2.5 시간) 겔화 시간을 가지고 확인 인쇄 재료는 4 가지 기능화 된 유리 슬라이드 표면에 인쇄되었다. 순서 &quot;인쇄&quot;으로 간주 될 수있는, 핀의 섭취 볼륨 당 반점의 최대 수 (SMP3에게 = 200)를 인쇄 할 수 있었다. 반점은 어떤 균열 또는 바람직하지 않은 상 분리는 그림 2와 같이 간단한 브라이트 현미경을 사용하여 발생 없었다 보장하기 위해 현물 형태에 대한 평가 하였다. 확인 인쇄 재료의이 단계에서, 마이크로 어레이는 시린 생산 된키나아제는 버퍼 수성 구성 요소에 통합. 분석 절차 (잠재적 중복 인쇄 등과 같이 세척하거나 염색)와 호환이되었습니다 재료 (NC 부정적인 제어 마이크로 어레이 반점의 유지 (아무 균열, 반점이나 특이한 형광 패턴의 손실)과 양성 대조군 (PC)를 관찰하여 확인 하였다 ) 이미지를 통해 관찰로 1보다 비율이 더. 이 자료의 약 50 % 단백질 활동의 유지와 최적의 재료를 정의하는 데 사용했다 3의 큰 PC / NC 비율되면서. 이 방법을 통해,&gt; 3 PC / NC 기준을 만족 키니 아제를 포함하는 아세틸 콜린과 2 물질을 포함하는 26 졸 - 겔 파생 물질. 그림 3과 그림 4는 최적의 아프고 키나제의 식별을위한 5 유도 물질 스크린 단계의 그래픽 고장 표시 마이크로 어레이, 각각. 분석은 Z &#39;점수의 생성을 통해 확인 할 수있다. 17 </sup&gt; 이것은 높은 PC / NC 비율을 생산 재료를 사용하여 수행 하였다. 그림 5는 Z &#39;줄거리가 200 점, 100 PC 및 아세틸 콜린 배열에 지시 염료와 기판을 중복 인쇄 한 후 100 NC에서 생성 된 신호를 비교하여 얻은 보여줍니다. 아프고 키나제 어레이는 뛰어난 분석의 지표 0.60와 0.67의 각 Z &#39;점수 결과. 그러나, 분석 검증하기 전에에 배열 효소, 염료, 기판과 보조 인자 (cofactor) 농도가 다른 세부 사항에 설명 된대로 각 구성 요소의 농도 범위를 중복 인쇄 및 높은 신호를 생성 농도를 선택하여 최적화한다는 것을 주목해야한다 5. 분석의 유효성을 검사하려면, 양적 억제 데이터가 중복 수행하고 중복 플롯 (그림 6A)와 억제 곡선 (그림 6B 및 6C) 생산하는 데 사용 결과, 알려 지거나 알려지지 않은 아세틸 콜린 억제제를 사용 하였다. &lt;강해&gt; 명소는 먼저 염료와 기판과 다음 알려진 생리 활성 저분자 억제제의 혼합물로 겹쳐되었고, 알려진 억제제 또는 아니오 억제제 중 하나를 포함하는 제어 혼합물이 포함되었다. 중복 플롯은 효소 활성을 평가하기 위해 생성되고, 25 % 이하의 효소 활성의 결과 모든 혼합물 억제에 긍정적으로 간주 하였다. 이러한 혼합물에서 개별 화합물은 그 억제에 대한 책임을 특정 작은 분자 (들)을 식별하기 위해 중복으로 테스트되었습니다. 일단 확인이 작은 분자는 IC 50 값과 억제 상수를 결정하는 정량적 억제 곡선을 생성하는 데 사용되었다. 비슷한 성적 결과는 일반적인 키나제 억제제, staurosporine을 가진 multikinase 배열을 사용 하였다. 그림 7a 및도 7b는 마이크로 어레이 이미지를 표시하고 표시하는 중복 인쇄 및 multikinase 염색 한 후 신호 강도(- ATP), 양성 대조군 (+ ATP) 및 알려진 억제제 (+ ATP + INH) 배열과 같은 부정적인 제어 예상된다. 마이크로 어레이의 양적 억제 데이터를 얻을 수있는 능력을 입증하기 위해, 농도 의존적​​ 억제 분석은 하나의 키나제에 대해 수행되었다. 그림 8a 및도 8b에있는 바와 같이, 신호 강도 억제제의 농도가 증가함에 따라 감소하고, 응답 p38α/MBP 키나제 / 기판 시스템의 예상 농도 의존적 억제 곡선을 따른다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig1.jpg" /> 그림 1. 유도 물질 스크리닝 방법에 대한 일반적인 회로도. 각 블록은 순서대로 화면의 단계를 나타냅니다. 왼쪽에있는 숫자는 분석을 위해 준비 재료의 총 수를 나타냅니다. 보다 2.5 시간 (겔화 시간과 물질보다 2.5 시간 AR 겔화 시간을 사용E)를 삼진으로 표시, 각 단계를 통과하고 자료 화면 중에 이월 재료의 숫자가 오른쪽의 숫자로 표시됩니다. * 최적의 상 분리보다 적은 재료를 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig2.jpg" /> 그림 2. 화면의 인쇄 적성 단계에서 재료의 다양한 고장 모드를 보여주는 광학적 이미지는. &quot;좋은&quot;재료 (두 번째 행, 세 번째 열)의 이미지는 비교를 위해 표시됩니다. 참조 8, 저작권 2013 미국 화학 학회의 허가 재판. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig3.jpg" /> 그림 3. 졸 - 겔 파생 아세틸 콜린 마이크로 어레이의 제조 최적의 재료의 식별을위한 직접 재료 선별 방법은. 파마 재판참고 5 저작권 2013 미국 화학 학회에서 허 가를. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig4.jpg" /> 그림 4. 졸 - 겔 파생 키나제 마이크로 어레이의 제조 최적의 재료의 식별을위한 직접 재료 선별 방법은. 참조 8, 저작권 2013 미국 화학 학회의 허가 재판. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig5.jpg" /> 그림 5. (A) HC (밝은 녹색)와 LC (라이트 그린) 반점 (검은 색 - 녹색 팔레트가 표현의 명확성을 위해 사색으로 적용)를 표시하는 아세틸 콜린 마이크로 어레이의 부분, (B) 박스 영역의 확대보기가 자리를 강조 형태 및 정렬;. 및 (C) Z &#39;음모 실선의 평균을 나타냅니다<html> 파선은 3SD에 해당하는 반면, 복제합니다. 참고 5 저작권 2013 미국 화학 학회의 허가 재판. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig6.jpg" /> 그림 6. (A) 수선화과 알칼로이드의 합성 유사체에 배열 검사에 대한 플롯을 중복, (B) 식별 된 잠재적 억제제의 IC 50 플롯 화합물 1과 25에서 평균의 한 표준 편차를 나타내는 오차 막대와 (C) 화합물 2로 표시 복제합니다. 대표 반점 억제제의 농도에 비례하는 신호의 차이를 설명하기 위해 표시됩니다. 참조 5의 허가 재판, 저작권 2013 미국 화학 학회. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50689/50689fig6large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . NT &quot;FO : 유지 - together.within 페이지 =&quot;항상 &quot;&gt; <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig7.jpg" /> 그림 7. 에서 배열은 함정 수사를 위해 1.4SS/1.0PVA를 사용하여 네 개의 키나아제의 분석 및 아민 유도체 슬라이드에 인쇄했습니다. (A) 키나아제 각각의 기질과 협력 모함에 반점이 버퍼 오버 프린팅 된의 마이크로 어레이의 섹션의 이미지 (NC, 맨 윗줄) 또는 ATP (PC, 중간 행) 또는 ATP + staurosporine을 (아랫 줄)을 포함하는 솔루션을 제공합니다. (B) 사이의 신호 강도를 비교하는 막대 그래프는 억제하고 25 일부터 평균의 한 표준 편차를 나타내는 배경 신호와 오차 막대의 공제 후 노골적인 반응, 복제합니다. 참조 8, 저작권 2013 미국 화학 학회의 허가 재판. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig8.jpg" /> 그림 8. Inhibiti. p38a/MBP 마이크로 어레이에 대한 분석에서 (A) staurosporine을의 농도 변화와 overspotted 대표 명소를 보여주는 마이크로 어레이의 섹션은, 같은 (; 합성 이미지는 명확성을 위해 표시되는 이미지가 같은 슬라이드 단일 스캔으로 얻은) 표시. (B) IC 50 곡선은 분석 어레이 이미지에서 생성됩니다. 100 밀리미터에서 얻은 강도는 모든 이미지에서 제외 된 다른 모든 강도는 100 % 활동의 값을 10 nm에서 얻은 강도를 설정하여 표준화 하였다. 참조 8, 저작권 2013 미국 화학 학회의 허가 재판. <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/50689/50689fig9.jpg" /> 그림 9. 문의 각종 결함을 보여주는 핀 인쇄에 사용되는 미세한 스텔스 핀의 이미지 (A) 찬, (B) 굽은.

제작의 새로운 핀 인쇄 방법을 사용하여 졸 - 겔 파생 된 단백질을 첨가 마이크로 어레이를 개발하는 안내 자료를 심사 방식이 설명되어 있습니다. 이 방법은 비용 효율적인 작은 분자 검사에 사용되는 아세틸 콜린과 multikinase 마이크로 어레이의 개발을 통해 설명된다.

Microarrays have found use in the development of high-throughput assays for new materials and discovery of small-molecule drug leads. Herein we describe a ...

이 절차의 전반적인 목표는 마이크로어레이 제작을 위한 새로운 졸-겔(sol-gel) 기반 재료를 발굴하고, 이를 나노 부피 효소 분석에 활용하는 것입니다. 이는 우선 인쇄 과정 중 마이크로어레이 프린팅 핀 내부에서 겔화되는 것을 방지할 수 있을 만큼 충분히 긴 겔화 시간을 갖는 재료를 식별함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 겔화 시간이 긴 재료들을 대상으로 마이크로어레이로서의 재현 가능한 인쇄 능력, 균열에 대한 저항성, 접착 품질, 원치 않는 상분리 여부, 그리고 최종적으로 포집된 효소의 높은 활성도를 평가하는 것입니다.다음으로, 최적의 재료를 사용하여 관심 효소를 마이크로어레이로 프린팅하고, 어세이 용액을 오버스팟(over spot)하여 측정 가능한 효소 반응을 생성하는 능력을 테스트합니다. 마지막 단계는 관심 효소를 사용하여 높은 재현성의 어세이를 제공하고 정량적 데이터를 생성하는 재료의 능력을 평가하는 것입니다. 이후 어레이 제작을 위한 최종 재료를 선정합니다.궁극적으로, 솔 젤(sol gel) 유래 단백질 마이크로어레이는 효소 활성을 감소시키는 저분자 화합물을 식별하는 데 사용됩니다. 플레이트 기반 스크리닝과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 방법의 주요 장점은 적은 양의 시약을 사용하여 매우 빠르게 대량의 물질을 체계적인 방식으로 스크리닝할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 사용자는 프린팅 핀 내부에서 물질이 젤화될 수 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.만약 이를 제대로 세척하지 않으면, 인쇄 불가능한 물질로 해석될 수 있는 미세한 오염 부위가 남게 됩니다. 우선, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 여러 가지 첨가제 용액을 준비하십시오. 많은 용액은 미리 제조하여 적절한 조건에서 한 달 또는 그 이상 보관할 수 있으나, 일부 용액은 실험 당일에 제조해야 합니다.규산나트륨 기반의 톱을 사용 직전에 혼합하고, 반드시 얼음 위에 보관하십시오. 물을 첨가한 후 1시간 이내에 SOS를 사용해야 하며, 대기 시간이 길어지면 DATION 시간이 단축되고 불일치하는 결과가 나타납니다. 다음으로, 동봉된 텍스트 프로토콜의 지침에 따라 완충액, salans 폴리머 및 organs lanes의 다양한 조합을 준비하여, 2.5시간 이상의 팽창 시간을 가지며 프린팅 가능한 재료로 사용할 수 있는 조합을 식별하십시오.여러 조합이 확인되면 프린팅 챔버 내의 습도를 80~90%로 설정하십시오. 습도가 80% 미만일 경우, 프린터의 적은 증착 부피로 인해 시료 증발 및 프린팅 불일치가 발생할 수 있습니다. 준비가 완료되면 Chip Writer Pro 프로그램을 사용하여 프린팅할 어레이 패턴을 배치하십시오. XY 방향의 이동 속도는 10 millimeters per second로, Z 방향의 시료 접근 속도는 2 millimeters per second로 설정하고, 앞서 확인한 saw gel 조합을 사용하여 시료 로딩 시간을 2.5 second로 설정하십시오.사전 스크리닝 과정을 통해 확인된 해당 폴리머, 유기 란(organo lanes) 및 저분자 첨가제를 혼합하여 25 µL의 기초 재료를 준비합니다. pH 8.0의 50 mM HEPES 완충액을 384-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 분주합니다. 그런 다음 100 µm 직경의 슬롯형 시스 핀(slotted sheath pins)을 최대 4개까지 2회 증류수에서 초음파 처리합니다.15분 후, 질소 스트림을 이용해 건조시킵니다. 다음으로, 파이프 클리너를 사용하여 핀 홀더 내부의 잔류 수분을 제거하고 핀을 컨택 핀 프린팅 로봇의 프린트 헤드에 조심스럽게 장착합니다. 잔류 수분을 제거하지 않으면 핀이 홀더 내에서 자유롭게 이동하는 것이 방해되어 도포 누락 부위가 발생할 수 있습니다.그 다음, 프린팅 직전에 해당 SA 25 µL를 웰에 추가합니다. 피펫으로 혼합할 때는 피펫팅을 위아래로 50회 반복하여 용액을 섞어줍니다. 이때 용액에 공기가 혼입되는 양을 최소화하십시오.기포가 있으면 핀 내부에 샘플이 완전히 로딩되지 않습니다. 다음으로, 핀을 샘플에 담가 샘플을 로딩합니다. 핀 로딩이 완료되면 프린팅 프로세스를 시작하여 슬라이드 표면 한 곳에 샘플을 프린팅합니다.다음 소스 플레이트에 염을 추가하기 전에 프린팅 과정을 일시 정지하십시오. 과정이 정지된 상태에서 자석을 사용하여 프린팅 핀을 제거하고, 프린트 헤드 내에 습기가 쌓이는 것을 방지하기 위해 파이프 클리너를 프린트 헤드에 넣으십시오. 그런 다음 프린팅 핀을 2중 증류수로 헹구고 깨끗한 2중 증류수에서 30초 동안 초음파 처리하십시오.다음으로, 질소 기류 하에서 프린팅 핀을 건조시킨 후 핀을 프린트 헤드에 다시 장착합니다. 소스 플레이트에 남아 있는 모든 샘플에 대해 혼합, 프린팅 및 세척 과정을 반복합니다. 단일 슬라이드에 직경 100 microns의 스폿을 최대 12,000개까지 증착할 수 있습니다. 프린팅이 완료되면, 프린팅 챔버 내에서 80~90% 습도로 최소 30분에서 최대 24시간 동안 어레이를 에이징합니다.사용 직전에 1mM acetylcholine iodide 25 µL와 5 mM BODIPY FL cysteine 0.14 µL, 그리고 4% glycerol이 포함된 pH 7.0의 25 mM tris 25 µL를 384-well 마이크로타이터 플레이트의 웰에 혼합하여 양성 대조군 50 µL를 준비하십시오. 기포가 생기지 않도록 피펫으로 용액을 천천히 흡입하고 배출하여 혼합합니다. 다음으로, 사용 직전에 5 mM BODIPY FL cysteine 0.14 µL를 4% glycerol이 포함된 pH 7.0의 25 mM tris 49.86 µL에 혼합하여 384-well 마이크로타이터 플레이트의 다른 웰에 넣고 부드럽게 혼합하여 음성 대조군을 준비하십시오. 이전 섹션에서 설명한 것과 동일한 과정으로 대조군을 에이징된 마이크로어레이에 프린팅하십시오. 단, 직경 100 µm 핀 대신 직경 235 µm의 슬롯팅 칩 핀을 사용하십시오.이를 통해 용액이 이전에 점적된 스팟들을 완전히 덮도록 합니다. 아세틸콜린의 자동 가수분해로 인해 스팟들을 80에서 90% 습도의 상온에서 한 시간 동안 숙성시킵니다. 배양 시간이 길어지면 효소 활성 증가로 인해 위양성이 나타날 수 있습니다.Alpha Innotech Novo Array Imager의 전원이 켜져 있는지 확인하고, acetylcholine esterase 마이크로어레이 측정을 위해 478 ± 17 nm 여기 필터와 538 ± 21 nm 방출 필터가 장착되어 있는지 확인하십시오. 그런 다음 스폿이 위를 향하도록 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣으십시오. 자동 노출을 사용하여 현미경 슬라이드 양측에 최소 하나 이상의 프리뷰 섹션이 포함되도록 프리뷰 섹션 수를 설정하고, 최소 해상도는 4 µm로 설정하십시오.파라미터가 적절하다고 판단되면, 슬라이드 이미지를 획득하여 TIFF 파일로 저장하십시오. 다음으로, 획득한 슬라이드 이미지를 image J 64에서 엽니다. Oval Selection Tool을 클릭하고 각 스팟을 선택하십시오.관찰된 스팟보다 약간 더 큰 영역을 선택하고, Image J의 주관성을 줄이기 위해 스팟 간에 일관된 크기를 사용하십시오. 그런 다음 Analyze 탭의 Measure 옵션을 사용하여 각 스팟의 신호 강도를 측정합니다. 25개의 유사한 양성 대조군 스팟의 평균 강도를 25개의 유사한 음성 대조군 스팟의 평균 강도로 나누어 개별 재료 조성에 대한 양성 대조군 대비 음성 대조군 비율을 구합니다.여기에 제시된 것은 이 방법들을 사용하여 제작된 마이크로어레이의 다이내믹 레인지 예시입니다. 고농도 대조군은 밝은 녹색 영역으로 나타난 반면, 저농도 대조군은 훨씬 어두운 스폿으로 나타났습니다. Image J 64로 측정한 강도는 고농도 대조군의 평균이 약 22,000 relative fluorescent units였으며, 저농도 대조군의 평균은 8,000에 가까웠습니다.점선은 평균으로부터 3표준편차를 나타냅니다. 다음은 화합물 1 및 화합물 2로 확인된 ameral sier 알칼로이드의 합성 유사체에 대한 honor array 스크리닝의 예시 마이크로어레이입니다. 양쪽 축은 형광 신호로 결정된 효소의 백분율을 나타냅니다.중복 측정 시 점들이 대각선에 가깝게 위치할수록 분석 재현성이 높음을 나타냅니다. 여기서는 두 가지 서로 다른 잠재적 억제제의 IC 50 그래프가 제시되어 있습니다. 화합물 1은 16 micromolar의 IC 50 수준을 보인 반면, 화합물 2의 IC 50는 21 micromolar였습니다. 억제제 농도에 비례하는 신호의 차이를 보여주기 위해 대표적인 스팟들이 위에 표시되어 있습니다.여기에 표시된 어레이는 P 38 map kinase, EGFR, GSK의 네 가지 서로 다른 키나아제로 프린팅되었으며, 완충액 단독, ATP 함유 완충액, 그리고 효소 활성 억제제인 staurosporine이 포함된 ATP 함유 완충액을 덧씌워 프린팅하였습니다. 결과는 여기에 설명된 바와 같이, 생성된 형광 강도를 기반으로 키나아제 억제제인 staurosporine에 의한 유의미한 효과를 보여줍니다. 여기에 사용된 staurosporine 농도에서 관찰된 가장 큰 차이는 P 38 스팟에서 나타났습니다.여기 stor sporin의 다양한 농도로 오버스팟팅(over spotted)한 P 30 8:00 AM BP 마이크로어레이의 대표적인 스팟들을 보여줍니다. 표시된 바와 같이, 이 분자의 IC 50는 1 µM로 결정되었으며 오른쪽 그래프에 나타나 있습니다. 이 기술을 숙달하면, 본 절차에 따라 적절히 수행할 경우 몇 시간 내에 완료할 수 있습니다.진단 또는 저분자 화합물 발굴과 관련된 추가적인 질문에 답하기 위해 면역 분석법이나 단백질 상호작용 분석법과 같은 다른 방법들도 수행할 수 있습니다.

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