단지 샘플의 특정 단백질 글리코 실화의 다중 높은 처리량 프로파일을위한 화학을 차단 항체 Microarray
May 4th, 2012
본 연구에서 우리는 특정 단백질의 글리코 실화 프로 파일링에서 사용할 수있는 렉틴 검출 방법과 멀티 플렉스 높은 처리량 항체 microarray를위한 향상된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 새로운 신뢰할 수있는 시약을 갖추고 있으며 훨씬 이전 절차에 비해 시간, 비용, 연구 장비 요구 사항을 줄여줍니다.
이 비디오 기사는 화학적으로 차단된 항체 마이크로어레이를 사용하여 간세포 암종 환자 혈청 샘플에서 20개의 서로 다른 당단백질의 당단백질의 당화 프로파일을 얻는 절차를 설명합니다. 먼저 당단백질 특이적 항체를 마이크로어레이 슬라이드에 직접 인쇄하고 항체 글라이칸을 차단하여 렉틴 결합을 방지합니다. 환자 혈청 샘플이 적용되면 샘플의 당단백질이 항체에 의해 포착됩니다. 그런 다음 비오틴화된 글라이칸 결합 단백질을 첨가하여 글리칸을 검출하고 di conjugated neu travain을 첨가하여 비오틴화된 렉틴을 표지합니다.
그런 다음 마이크로어레이 슬라이드를 스캔하여 결과 데이터의 형광 분석을 감지하면 샘플 단백질의 당화(glycosylation) 프로필이 드러납니다. 이 기술은 HPLC와 같은 기존 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 이 방법을 사용하면 고유 상태의 개별 당단백질을 검출할 수 있습니다.
여러 단백질에 대한 당화(glycosylation) 변화를 동시에 스크리닝하는 것이 더 빠르고 쉽습니다. 자, 우리는 질병, 특히 암과 간암의 바이오마커가 우리가 가장 주의 깊게 살펴본 것처럼 종종 글리코실화된다는 것을 발견했습니다. 그리고 우리가 발견한 특정 글리코 형태를 검출하는 능력은 민감도와 특이성에서 바이오마커 성능을 크게 향상시킵니다.
따라서 이 측정은 HCC의 여러 혈청 단백질에 대한 당화(glycosylation) 변화에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 췌장암, 당뇨병, 알츠하이머병과 같은 다른 암 및 질병의 병리학 연구 및 바이오마커 발견에 적용할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 기술자인 Chen Lu가 맡을 것입니다.
먼저0.8 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에서 항체 마이크로 어레이를 준비하여 이 프로토콜을 시작하고, 마이크로 어레이 인쇄에 사용될 모든 항체를 얼음 위에 희석하고, 여기에서 PBS의 최소 40 밀리리터에서 밀리리터당 0.5 밀리그램의 농도로 26개의 서로 다른 항체를 양성 대조군으로 사용합니다. 또한 PBS에서 밀리리터당 0.5mg의 비오틴화 BSA를 동일한 양으로 준비합니다. 피펫터를 사용하여 각 항체 40ml를 얼음 위의 384웰 소스 플레이트로 분주합니다.
그런 다음 마이크로어레이 제어 소프트웨어에서 각 항체 위치를 지정합니다. 다음으로, 플레이트를 마이크로어레이에 소스로 로드합니다. 그런 다음 20개의 경로 마이크로어레이 슬라이드를 마이크로어레이에 타겟으로 로드합니다.
27개의 항체와 대조 단백질이 9 x 9 패턴으로 삼중으로 발견되는 48개의 동일한 subar 어레이를 인쇄하도록 마이크로어레이를 설정합니다. 마이크로어레이를 시작하여 항체 마이크로어레이 슬라이드를 인쇄합니다. 항체 마이크로어레이 슬라이드를 수집하여 건조제와 함께 슬라이드 카세트에 보관합니다.
카세트를 비닐 봉지에 밀봉하여 보관 중 슬라이드의 단백질 변성 및 습기를 방지하십시오. 밀봉된 마이크로어레이 슬라이드는 사용할 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오. 이 절차에서 가장 어렵고 중요한 측면은 화학적 차단 단계입니다.
성공을 보장하려면 마이크로 어레이 광에 충분한 양의 항체를 인쇄하는 것이 중요합니다. 실험 직전에 항상 신선한 나트륨 IDE와 농산 하이드로세포를 준비하십시오. 그리고 빛을 피하면서 4도에서 산화 절차를 수행하십시오.
냉장고에서 마이크로어레이 슬라이드를 꺼내 30분 동안 실온으로 평형을 이룹니다. 보관 상자에서 슬라이드를 제거합니다. 0.1%tween 20이 포함된 PBS가 들어 있는 세척 대야에 슬라이드를 잠시 담그십시오.
그런 다음 슬라이드를 15밀리몰의 아세트산 나트륨 버퍼에 0.1%트윈으로 10분 동안 담급니다. 다음으로, 15 밀리몰 아세테이트 나트륨 완충액에 요오드산 당 150 밀리몰의 신선한 나트륨을 준비하고 슬라이드 세척 대야에 옮겨 냉장고에 보관하고 사용할 때까지 빛을 피하십시오. 아세트산나트륨 완충액에서 슬라이드를 제거하고 항체 면이 위를 향하도록 하여 신선한 퓨리에이트나트륨이 들어 있는 대야에 넣습니다.
빛을 피하기 위해 대야를 알루미늄 호일로 덮으십시오. 그런 다음 슬라이드 대야를 섭씨 4도로 놓고 2시간 동안 부드럽게 흔듭니다. 대야에서 슬라이드를 제거하고 아세트산 나트륨 버퍼에 5분 동안 3회 짧게 헹굽니다.
갓 준비한 10밀리몰 하이드로 글루탐산 차단 용액 300ml에 슬라이드를 배양실에서 실온에서 2시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 챔버에서 슬라이드를 제거하고 3분 동안 0.1% 트윈으로 PBS로 세척합니다. 다음으로, 슬라이드 세척 대야에서 PBS의 1% BSA 300ml에 마이크로어레이 슬라이드를 0.5% 트윈과 함께 실온에서 부드러운 쉐이킹으로 1시간 동안 배양합니다.
PBS에서 0.1% 트윈으로 슬라이드를 3분 동안 세 번 헹굽니다. 슬라이드를 슬라이드 랙에 놓고 1, 200회 G로 2분 동안 회전시켜 마이크로어레이 슬라이드를 다음으로 건조시킵니다. 각 subar 어레이를 분리하기 위해 왁스 그리드가 슬라이드에 각인됩니다.
왁스 임프린터를 섭씨 70도에서 5분 동안 예열한 후 차단된 마이크로어레이 슬라이드를 항체 면이 왁스 쪽을 향하도록 하여 왁스 임프린터에 로드합니다. 핸들을 부드럽게 당겨 슬라이드에 왁스를 고르게 각인시킵니다. 이 방법은 단일 샘플에 대해 글리코 프로파일링 분석을 수행하거나 여러 샘플에서 단일 글리코 에피토프를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
여기에서는 글리코 프로파일링 어세이를 시연합니다. 먼저 마우스, 쥐, 토끼, 염소 및 당나귀 IgG의 0.1%트윈 0.1% 브리지 35 및 100마이크로그램을 포함하는 PBS 360마이크로리터에 40마이크로리터 혈청을 희석하는 것으로 시작합니다. 이 부피는 각 서브 어레이에 6마이크로리터의 희석된 혈청 용액을 적용하기에 충분합니다.
희석된 샘플 또는 대조군 6마이크로리터를 슬라이드의 각 서브 어레이에 조심스럽게 적용합니다. 젖은 종이 타월과 함께 가습 카세트에 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. PBS로 슬라이드를 0.1% 트윈으로 3분 동안 3회 헹굽니다.
그런 다음 1200회 G로 2분 동안 회전시켜 슬라이드를 건조시킵니다. 얼음 위의 0.8ml 마이크로 퍼지 튜브에서 PBS 트윈에서 밀리리터당 10mg으로 비오틴화된 글라이칸 결합 단백질 20마이크로리터를 준비합니다. 희석된 비오틴화 렉틴 6마이크로리터를 슬라이드의 각 서브 어레이에 바르고 가습된 슬라이드 박스에서 젖은 종이 타월로 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
PBS로 슬라이드를 0.1% 트윈으로 이전과 같이 3회 헹군 후 원심분리기에서 1200배 G로 2분간 회전시켜 슬라이드를 건조시킵니다. 얼음 위의 0.8 밀리리터 마이크로 퍼지 튜브에 PBS 0.1%트윈에 10밀리리터 DITE 5 49 표지된 중성자 트라베인 400 마이크로리터를 준비합니다. 반복 피펫을 사용하여 6마이크로리터의 DITE 5 49 표지 중성자 travain을 각 서브 어레이에 적용하고 배양 후 1시간 동안 실온에서 가습 슬라이드 카세트에 슬라이드를 배양합니다.
PBS 0.1%트윈으로 슬라이드를 3분 동안 세 번 헹굽니다. 원심 분리기에서 1200배 G로 2분 동안 회전시켜 슬라이드를 건조시킵니다. 10mm 해상도의 형광 마이크로어레이 스캐너를 사용하여 슬라이드를 스캔합니다.
레이저 및 PMT 설정은 채도가 관찰되지 않도록 하면서 가능한 한 강해야 합니다. 어레이 Pro 3.2에서 이미지를 엽니다. 항체 스폿 위치를 보여주는 어레이 맵에 따라 어레이 템플릿을 설정합니다.
각 템플릿 원을 이미지의 해당 지점에 조심스럽게 정렬하고 추가 분석을 위해 각 지점의 강도를 Excel 파일로 추출합니다. 20개의 혈청 당단백질 및 비오틴에 대한 26개의 항체가 있는 48개의 동일한 subar 어레이를 포함하는 항체 마이크로 어레이. BSA는 차단 절차의 중요성을 검토하기 위해 이 비디오에 설명된 대로 설계 및 제조되었습니다.
당단백질 프로파일링 분석에서 두 개의 동일한 마이크로어레이 슬라이드가 생성되었습니다. 하나는 화학적으로 차단되지 않았고 다른 하나는 대조군 샘플을 1열과 3열의 subar 어레이에 적용하고 풀링된 HCC 혈청 샘플을 subar 어레이에 적용했습니다. 2열과 4열에서 22.
그런 다음 서로 다른 글리칸에 특이적인 비오틴화된 렉틴을 subar array의 이러한 이미지에 표시된 것처럼 각 sub array에 적용했습니다. 대조군 컬럼에서 항체를 포획하기 위해 결합된 렉틴은 차단되지 않은 마이크로어레이에서 혈청이 로드된 컬럼과 구별할 수 없는 높은 배경을 제공합니다. 그러나, 화학적으로 차단된 항체 마이크로어레이 슬라이드에 대해 동일한 실험을 수행했을 때, 대조군 컬럼에서 항체를 포획하기 위한 결합이 없거나 매우 낮았고 혈청 로딩 컬럼에서 높은 항원 결합이 있었습니다.
이러한 결과는 화학적 차단 절차가 항체 포획 당단백질에 대한 글라이칸 측정을 위한 중요한 단계임을 입증합니다: 프로토콜에 따라 HCC 혈청에서 22개의 당단백질의 당화 프로파일을 얻을 수 있습니다. 이 기술은 제대로 수행되면 8시간 안에 완료할 수 있습니다. 항체는 변형될 때 항원 및 기타 특성에 대한 친화력을 잃을 수 있습니다.
따라서 이 점을 염두에 두고 다양한 항체 공급원에서 여러 다른 항체를 사용하는 것이 중요합니다. 동일한 마이크로레이 슬라이드를 사용하여 각 단백질 농도를 검출하는 것과 같은 다른 측정은 당화(glycosylation)의 변화가 단백질 발현 수준의 변화로 인한 것인지 아니면 전적으로 각 개별 단백질의 당화(glycosylation) 변화로 인한 것인지와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다. 혈청 샘플이 포함된 병원체로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 항상 보호 장갑과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
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개요
본 연구는 특정 단백질의 글리코실화 프로파일링을 위한 렉틴 검출을 포함한 다중 고처리량 항체 마이크로어레이의 향상된 프로토콜을 제시합니다. 새로운 방법은 신뢰할 수 있는 시약을 제공하며, 이전 기술에 비해 시간, 비용 및 장비 요구 사항을 크게 줄입니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 글리코실화 프로파일링
- 항체 마이크로어레이 기술
- 바이오마커 발견
배경
- 글리코실화는 단백질의 기능에 영향을 미치는 중요한 번역 후 변형입니다.
- 현재 글리코실화 프로파일링 방법은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들 수 있습니다.
- 효율적인 분석을 위한 개선된 방법론이 필요합니다.
- 본 연구는 새로운 접근 방식으로 이러한 도전 과제를 해결합니다.
연구 목적
- 글리코실화 프로파일링을 위한 보다 효율적인 프로토콜을 개발하는 것.
- 다중 고처리량 항체 마이크로어레이를 활용하는 것.
- 렉틴 결합을 이용한 검출 능력을 향상시키는 것.
사용된 방법
- 특정 항체를 마이크로어레이 슬라이드에 인쇄합니다.
- 렉틴 결합을 방지하기 위해 항체 글리칸을 차단합니다.
- 환자 혈청 샘플을 적용하여 글리코프로테인을 포획합니다.
- 검출을 위해 바이오틴화된 글리칸 결합 단백질을 사용합니다.
주요 결과
- 혈청 샘플로부터 글리코프로테인의 성공적인 포획.
- 형광 분석을 통한 글리코실화 프로파일의 검출.
- HPLC와 같은 기존 방법에 비해 장점을 입증했습니다.
- 네이티브 상태의 개별 글리코프로테인 분석을 가능하게 했습니다.
결론
- 새로운 프로토콜은 글리코실화 프로파일링 효율성을 크게 향상시킵니다.
- 기존 방법에 비해 신뢰할 수 있고 비용 효율적인 대안을 제공합니다.
- 이 기술은 글리코프로테인 분석 연구를 촉진할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This method enables multiplexed, high-throughput profiling of protein glycosylation in complex biological samples, addressing a critical bottleneck in biomarker discovery and target validation. By reducing time, cost, and equipment requirements, it supports scalable analysis of glycosylation alterations linked to disease progression, particularly in oncology and metabolic disorders. The approach enhances predictive confidence in early-stage R&D by providing quantitative, reproducible glycan profiles that inform mechanistic de-risking and portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking specific glycoprotein glycosylation patterns to disease states such as hepatocellular carcinoma.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking through multiplexed capture and detection of 20+ glycoproteins from serum samples using a single microarray platform.
- Predictive Value: Supports target confidence by distinguishing glycosylation-driven biomarker alterations from changes in protein expression levels.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by enabling standardized, quantitative glycan profiling across multiple protein targets.
- Operational Value: Enhances assay reproducibility and throughput through chemical blocking of antibody glycans, minimizing background noise in lectin-based detection.
- Scalability: Enables platform reuse across sample sets via wax-grid subarray separation, allowing parallel profiling of single glycoepitopes in multiple samples.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase glycan profiling to preclinical validation by detecting disease-associated glycosylation shifts in HCC serum samples.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in biomarker interpretation by isolating glycan-specific signals from total protein abundance.
- Disease-relevant Application: Extends beyond hepatocellular carcinoma to pancreatic cancer, diabetes, and Alzheimer’s disease, supporting broad therapeutic area relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling glycan profiling after target identification and before lead optimization, particularly when glycosylation is a known modulator of protein function or biomarker performance.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping glycosylation changes on specific proteins in complex mixtures.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized slide preparation, blocking, and detection steps that yield consistent fluorescence readouts.
- Analytics: Provides quantitative glycan measurements via biotinylated lectin binding and Dylight 549-Streptavidin detection, enabling inter-sample comparison.
- Translational Research: Links to preclinical continuity by profiling glycosylation alterations in serum samples reflective of disease state.
- Enterprise Reuse: Positions the microarray as a reusable platform for glycosylation screening across projects, reducing redundant assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in glycosylation-biomarker relationships.
- Operational Value: Improves standardization and reproducibility through simplified chemical blocking using glutamic acid hydrazide, enabling one-day workflow completion.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by lowering per-sample cost and accelerating go/no-go decisions in biomarker programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying glycosylation signatures with strong disease association early in discovery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody microarray handling, fluorescence detection, and glycan-binding protein reagents.
- Depends on access to a microarray printer, fluorescence scanner, and incubation chambers with temperature control.
- Necessitates cross-team standardization of antibody panels, lectin selection, and data analysis templates for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to non-serum sample types such as tissue lysates or cell culture supernatants.
- Includes practical limitations such as antibody stability post-modification and the need for multiple antibody sources to mitigate affinity loss.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:19
Printing the Antibody Microarray
3:58
Chemically Blocking the Antibody Microarray
6:06
Blocking Non-specific Binding with BSA
6:47
Wax Imprinting
7:11
Applying Serum Samples
8:19
Applying Biotinylated Glycan-binding Protein
9:00
Applying Dye-labeled NeutrAvidin and Fluorescence Detection
10:03
Data Extraction and Analysis
12:08
Conclusion
