의 DNA Microarrays : 샘플 품질 제어, 배열 하이브 리다이 제이션 및 스캔

이 절차의 전반적인 목표는 자동화된 믹서 장치를 사용하여 마이크로어레이 실험을 수행하는 것입니다. 이는 RNA 증폭 및 라벨링 후 바이오분석기로 RNA 샘플의 품질을 먼저 분석하여 수행됩니다. RNA 샘플은 마이크로어레이에 혼성화됩니다.

마지막으로, 혼성화된 마이크로어레이를 세척하고 스캔합니다. 궁극적으로 이중 색상 형광 마이크로어레이 이미지의 분석을 통해 RNA 전사체의 차등 발현을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 마이크로어레이 혼성화 단계가 특수 장비로 인해 배우기 어렵기 때문에 중요합니다.

품질 관리 분석은 서면 절차의 지시에 따라 2, 100 bioanalyzer 기기 및 chip priming station을 준비하는 것으로 시작됩니다. 그런 다음 겔 매트릭스를 RNA 6, 000 나노 키트 원심분리기와 함께 제공된 스핀 필터에 550마이크로리터를 피펫팅하여 여과합니다. 실온에서 10분 동안 1, 500 RCF의 필터.

그런 다음 여과된 겔을 65마이크로리터 분취액으로 분취하여 섭씨 4도에서 최대 한 달 동안 보관할 수 있습니다. 염료 농축액을 10초 동안 와류로 가열하고 65마이크로리터 부분 표본에 1마이크로리터를 추가합니다. 13, 표본을 달리기 위하여 실내 온도에 10 분 동안 000 RCF에 혼합물 분리기를 와동 후에 걸러진 젤.

먼저 프라이밍 스테이션에 칩을 배치합니다. 이 시연에서는, RNA 6, 000의 nano chipps는 이용된다. 검은색 배경에 흰색 G로 표시된 웰에 9마이크로리터의 젤 염료 혼합물을 로드합니다.

피펫 끝이 우물의 맨 아래에 위치합니다. 주사기 플런저를 1밀리리터에 놓고 프라이밍 스테이션을 닫습니다. 클립이 잡힐 때까지 플런저를 천천히 그러나 꾸준히 누릅니다.

30초 후 클립을 놓고 플런저가 몇 초 동안 올라갈 때까지 기다립니다. 플런저가 멈춘 후 플런저를 1mm 위치로 다시 당기고 프라이밍 스테이션을 엽니다. 9마이크로리터의 겔 다이를 로드합니다.

두 개의 웰 각각을 섞습니다. Mark G.그런 다음 마커 5마이크로리터를 사다리 우물과 12개의 샘플 우물 각각에 넣습니다. 다음으로, 사다리 웰에 있는 변성 사다리 1마이크로리터와 각 변성된 샘플 1마이크로리터를 샘플 웰에 로드합니다.

마지막으로, 사용하지 않은 각 샘플에 1마이크로리터의 마커를 추가합니다. 일단 로드되면 2, 400RPM에서 1분 동안 칩을 소용돌이칩니다. 2, 100 전문가 소프트웨어를 시작한 후 칩을 배치하고 덮개를 닫습니다.

올바른 포트가 선택되었는지 확인하고 증발을 방지하기 위해 샘플을 로드한 후 5분 이내에 분석을 실행하십시오. RNA 증폭 및 라벨링을 수행하는 방법은 서면 프로토콜에서 찾을 수 있습니다. 라벨링이 완료되면 CRNA를 정제하여 통합되지 않은 뉴클레오티드를 제거합니다.간편한 미니 컬럼인 코겐을 사용하여 라벨링된 CRNA를 NanoDrop 2000 스펙트럼 광도계로 정량화할 수 있습니다.

마이크로어레이 측정 모드에서는 시료 농도, 수율 및 특정 활성을 기록합니다. 마이크로어레이 혼성화의 경우, 마이크로어레이 혼성화 최소 2시간 전에 최소 825나노그램의 수율과 마이크로그램당 최소 8피코몰의 특정 활성을 달성해야 합니다. 혼성화 스테이션을 켜고 섭씨 65도로 설정합니다.

이 프로토콜은 Roche nimble gen hybridization 시스템 및 서면 프로토콜에 설명된 대로 수행된 CRNA 단편화 후 4개의 믹서 챔버와 함께 Agilent 4 x 40 4K 어레이를 사용하여 혼성화 챔버를 준비하는 방법을 설명합니다. 마이크로어레이 슬라이드를 어셈블리 분해 도구 바코드 쪽에 놓습니다. 먼저 A 4 믹서를 열고 어레이와 어셈블리 분해 도구를 고정하는 접착제를 노출시켜 움직임을 방지합니다.

맨 끝에서 시작하는 슬라이드에 A 4 믹서를 놓습니다. 도구에 올바르게 정렬되었는지 확인하고 어레이를 따라 믹서를 부착합니다. 믹서 끝에서 당겨 슬라이드 믹서 어셈블리를 제거합니다.

브레이잉 도구를 사용하여 접착 개스킷을 따라 전체를 눌러 슬라이드에 단단히 접착되었는지 확인합니다. 접착제와 슬라이드 사이에 갇힌 작은 기포가 어두운 배경에서 볼 수 있습니다. 브레이잉 도구로 이러한 거품을 제거하는 데 추가 시간을 할애하십시오.

이제 배열을 로드할 준비가 되었습니다. 용적식 퍼펫을 사용하여 100마이크로리터의 혼성화 샘플을 로드합니다. 팁을 현창 안쪽으로 단단히 밀어 넣고 공기가 어레이 영역에 갇히지 않도록 천천히 부드럽게 분배합니다.

샘플이 전체 어레이를 덮고 액체가 나오기 시작하면 벤트 포트가 재빨리 피펫을 제거하고 플런저만 해제합니다. 팁이 슬라이드에서 멀어지면 양쪽 포트에서 여분의 액체를 부드럽게 두드리면서 챔버 자체에서 샘플을 꺼내지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 핀셋을 사용하여 현창을 스티커로 덮습니다.

슬라이드를 하이브리드화 스테이션에 놓고 블래더 구멍이 O 링 위에 올바르게 위치했는지 확인하십시오. 이렇게 하면 혼성화 중에 적절한 혼합이 보장됩니다. 슬라이드 커버와 스테이션 덮개를 닫습니다.

스테이션을 혼합 모드 B로 설정하고 섭씨 65도에서 17시간 동안 어레이를 하이브리드화합니다. 세척 버퍼 1이 있는 A로 표시된 필러 유리 접시가 완성되면 접시는 조립 분해 도구를 잡고 약간의 기동도 할 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다. 플라스틱은 화합물을 침출하는 경향이 있어 어레이의 배경이 높기 때문에 모든 세척은 유리 제품에서 수행해야 합니다.

슬라이드 랙과 교반 막대를 염색 접시에 넣습니다. B라고 표시된 접시에 랙을 덮고 있는 세척 버퍼를 접시에 채우고 접시를 실온의 교반 접시에 놓습니다. 또한 C라고 표시된 빈 염색 접시에 교반 막대를 넣고 교반 플레이트에 놓습니다.

하이브리드화 스테이션에서 어레이를 제거하고 어셈블리 분해 도구에 놓습니다. 한 손으로 어셈블리 분해 도구와 반대쪽에서 슬라이드를 잡고 전체 어셈블리를 접시에 담그십시오. 어레이 영역이 긁히지 않도록 주의하면서 A four 믹서를 조심스럽게 떼어냅니다.

슬라이드를 랙과 염색 접시에 빠르게 놓고 SCI 5 염료는 오존에 민감하기 때문에 B. 공기 노출을 최소화해야합니다. 중간 속도로 저어주면서 1분 동안 지우기를 씻습니다. 염색 접시 C를 예열 세척 완충액 2로 채웁니다.

슬라이드를 옮기고 1분 동안 세탁합니다. 아주 천천히 세탁한 후 슬라이드에 남아 있는 물방울을 최소화하기 위해 염색 접시 C에서 슬라이드 랙을 제거합니다. 2분 동안 회전하여 슬라이드를 건조시킵니다.

그런 다음 슬라이드를 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 넣고 유전자 선택 4, 000 B 스캐너를 사용하여 아르곤 가스 스캔을 즉시 채워 분자 장치에서 표시된 신호 손실을 방지합니다. 다음은 인간의 뇌에서 분리한 4개의 RNA 샘플의 예입니다. 종양 조직 샘플 품질은 RNA 6, 000 칩에서 2, 100 바이오 분석기를 사용하여 평가되었습니다.

실선 및 열린 화살표는 각각 18 s 및 28 S-R-R-N-A 종의 위치를 나타냅니다. RNA 무결성 수(RNA integrity number, RIN은 RNA 품질, 양호한 품질, 총계(Total)의 정량적 측정입니다. RNA 샘플은 두 가지 주요 리보솜 RNA 종에 해당하는 품질 관리를 위해 바이오분석기에서 실행할 때 두 개의 주요 피크만 생성해야 합니다.

일부 RNA 분해는 첫 번째 리보솜 RNA 피크 전에 도말로 나타나고 28 S-R-R-N-A가 심하게 분해된 경우 상당히 낮은 피크로 나타납니다. 낮은 품질의 RNA는 낮은 머무름 시간에서 넓은 피크 또는 일련의 피크를 보여줍니다. 두 개의 리보솜 RNA 피크는 강도가 매우 낮거나 전혀 식별할 수 없습니다.

좋은 품질의 배열은 상대적으로 낮은 PMT 값에서 높은 신호를 생성해야 합니다. 대부분의 전사체는 실험 및 참조 샘플에서 유사한 수준으로 존재할 것으로 예상됩니다. 유전자 발현의 대대적이고 광범위한 변화는 아마도 생물학적으로 어떤 의미도 갖지 못할 것이다.

따라서 대부분의 어레이는 녹색이나 빨간색이 아닌 노란색으로 보여야 합니다. 또한 좋은 품질의 신호는 신호 히스토그램이 배열 이미지의 산점도에서 볼 수 있듯이 완전히 겹치는 동적 범위에 있어야 합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 자동화된 혼성화 장치를 사용하여 마이크로어레이 실험을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.