전립선 암의 바이오 마커 발견에 신청 : 개인 HERV 궤적 발현 마이크로 어레이 기반의 식별

인간 전립선암 조직에 대한 이 전사체 분석은 개별 인간 내인성 레트로바이러스 발현 위치를 식별하여 바이오마커 발견을 위한 스크리닝 도구로서 맞춤형 고밀도 마이크로어레이를 평가합니다. 외과의가 환자에게서 전립선 장기를 제거한 후, 병리학자는 실험실에서 종양 및 인접 정상 조직을 별도로 추출, 정제 및 MR을 검증합니다. 정상 및 종양 조직의 NA는 whole transcriptome ovation kit를 사용하여 mRNA를 증폭한 다음 생성된 증폭 산물을 절단하고 라벨링합니다. 다음 연속적으로 H-E-R-V-V 2 microarray를 교잡하고, 세척하고 검사해서 충전하십시오.

궁극적으로 바이오컴퓨팅 방법을 사용하여 중요한 신호 및 차등 발현을 나타내는 프로브 세트를 추적하여 전사 활성 개별 유전자좌를 식별할 수 있습니다. 수년 전에 우리는 다발성 경화증 샘플을 포함하여 다양한 맥락에서 IRV W 패밀리의 행동을 탐구했습니다. 태반 고환.

저는 패밀리 내에서 IRV 요소의 겹치거나 겹치지 않는 하위 그룹이 표현된다는 것을 이해하기 시작했을 때 처음으로 그 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 상황에 따라 다릅니다. 선박 기술을 사용하면 여러 가족을 조율하여 탐사하고 각 유전자 자리에 대한 다른 지역을 동시에 분석할 수 있습니다.

예를 들어, LTR에 대한 US three 및 UF 도메인은 병리학에서 직접적인 역할을 지원할 수 있습니다. 이 방법은 PSA와 같은 기존 단백질 바이오마커가 특이성과 민감도가 부족한 전립선암 진단과 같은 암 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 한편, PCA 3과 같은 비암호화 RNA가 더 유망한 것으로 보이며, 전립선 처리 절차를 입증하는 것은 병리학과의 기술자인 michel을 판매할 것입니다.

Philippe per는 RNA 추출 표적 준비 및 분석을 시연하고 John Unit 실험실의 기술자인 al은 선박 절차를 시연합니다. 저온 유지 장치에서 OCT의 작은 마운드에 동결 조직 과정을 수직으로 장착합니다. 단일 5 미크론 절편을 가져 와서 Blu udine으로 염색 한 다음 빠른 조직 학적 검사를 수행하여 종양 조직에 대한 조직의 특성을 검사합니다.

tural cell의 수량을 추정하고 tumoral cell이 80% 이상인 코어만 선택합니다. 또 다른 5 미크론 단면을 자르고 헤마틴, 어인 및 사프란으로 염색하십시오. 이제 30미크론 두께의 절편 15개를 잘라 RNA가 없는 고아 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 종양 세포의 양을 조절하기 위해 헤마틴(hematin), 어인(eoin) 및 사프란(saffron)으로 염색하기 위해 마지막 5미크론 절편을 취합니다. 절차가 끝나면 드라이 아이스에 담긴 샘플을 분자 생물학 실험실로 트랜스 옮깁니다. 조직이 완전히 용해될 때까지 휴대용 그라인더를 사용하여 얼음 위의 Triol 용액에 있는 조직을 균질화합니다.

샘플을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 300마이크로리터의 클로로포름을 넣고 15초 동안 와류를 넣습니다. 실온에서 2분 후 12, 000G에서 섭씨 2도에서 8도까지 15분 동안 원심

RNA의 경우 상단 수성상을 새 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 750마이크로리터의 이소프로판올을 첨가하고 반전으로 혼합한 다음 실온에서 10분 동안 배양합니다. 침전된 RNA를 펠릿화하기 위해 샘플을 원심분리하고 RNA 펠릿을 80% 에탄올 1밀리리터로 세척합니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 10분 동안 7, 500G에서 샘플을 원심분리합니다. P 1000 및 P 10 팁을 사용하여 상층액을 제거합니다. 남은 에탄올을 자연 건조시킵니다.

다음으로, 100마이크로리터의 RNA 자유수를 추가합니다. 샘플을 섭씨 70도의 열 블록으로 옮깁니다. 펠릿을 용해하려면 제조업체의 지침에 따라 바이오분석기와 NanoDrop을 사용하여 RNA의 품질과 RNA 무결성을 확인하십시오.

이상적인 RNA 추출에서 RNA 무결성 수는 일반적으로 7 이상입니다. 공급자의 지침에 따라 전체 전사체 대환영, RNA 증폭 키트를 계속 진행합니다. 그런 다음 생성된 단일 가닥 CD NA 생성물을 정제합니다.

제조업체의 지침에 따라 바이오분석기와 NanoDrop을 사용하여 단일 가닥 CDNA의 수율과 크기 분포를 확인합니다. 증폭된 CD NA의 크기 분포는 일반적으로 길이가 101, 500개 사이여야 하며 피크는 약 600개 염기여야 하며 전체 종 모양 분포를 가져야 합니다. CDNA를 단편화하기 위해 30마이크로리터 스핀에 2마이크로그램의 CD NA에 6.6마이크로리터의 단편화 혼합물을 추가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다.

그런 다음 섭씨 95도에서 10분 동안 DNA를 비활성화하고 얼음 위에 보관합니다. 애질런트 기반 크기 분포 검증을 위해 1마이크로리터의 단편화된 CDNA를 분취합니다. DNA의 한 가지 처리는 혼성화 전에 CD NA 크기 분포를 약 100개의 뉴클레오티드로 균질화합니다.

사전 습식 바이오분석기 Pfizer를 사용하여 단일 가닥 CD NA 크기 분포를 확인합니다. 200마이크로리터의 사전 혼성화를 가진 HERV 유전자 칩. 섞어서 섭씨 50도, 60RPM에서 10분 동안 배양합니다.

131 마이크로 리터의 혼성화 믹스를 69 마이크로 리터의 단편화되고 표지 된 CD NA에 실온 혼합물 및 자연에서 섭씨 95 도에서 2 분 동안 첨가합니다. 그런 다음 섭씨 50도에서 5분 동안 배양하고 5분 동안 최대 속도로 원심분리합니다. 이제 사전 습윤된 HERV 유전자 칩을 비우고 200마이크로리터 표적 제제를 로드합니다.

두 개의 SEPTA hybridize에 어려운 부분을 적용하고 섭씨 50도, 60RPM에서 18시간 동안 하이브리드화합니다. HERV 유전자 칩을 비우고 프로브를 채웁니다. 250마이크로리터의 세척 버퍼가 있는 어레이, 600마이크로리터의 SAPE 용액 혼합물 및 600마이크로리터의 항체 용액 혼합물을 1번과 2번 위치에 배치하고 800마이크로리터의 어레이 유지 버퍼를 위치에 배치합니다.

셋째, 바늘을 아래로 누르십시오. 각 모듈에 올바른 칩을 할당합니다. FS 4 5 0 0 0 4 프로토콜을 선택하고 소프트웨어의 지시에 따라 각 모듈을 실행합니다.

누출을 방지하기 위해 SEPTA에 거친 부분을 적용하십시오. 그런 다음 칩을 자동 로더에 로드하거나 스캐너에 직접 로드합니다. 스캔을 시작합니다.

생성된 칩 도트 CEL 파일을 스캔한 후 이미지를 확인하고 그리드를 스폿에 정렬하여 프로브 셀을 식별합니다. 또한 칩에 여러 가지 품질 관리 측정을 실시합니다. 이제 칩을 정규화하고 계층적 클러스터링 접근 방식을 적용하여 데이터 세트를 탐색한 후 정규화 후 마이크로어레이 절차에서 차등적으로 발현된 유전자를 검색하기 위해 상당한 분석을 수행한 후 5개의 매치 페어 종양 및 정상 전립선 RNA 샘플에 대한 잘못된 발견 비율 보정을 수행했습니다.

이를 통해 차등 발현 값을 가진 207개의 HERV 프로브 세트를 식별할 수 있었습니다. 다른 암 조직에서 채취한 35개의 추가 매치 페어 샘플에 대한 추가 분석을 통해 44개의 전립선 특이적 HERV 프로브 세트가 확인되었습니다. 다음은 가장 관련성이 높은 10가지 HERV 구조입니다.

마지막으로, 기능 분석은 H-E-R-V-V 2 어레이에 존재하는 전용 특정 프로브와 함께 상단에 라벨링되고 기능적 레트로바이러스 영역인 LTR gag POLE N으로 라벨링된 상위 10개의 식별된 proviral 구조에서 선택된 하나의 H-E-R-V-W 요소로 설명된 주석이 달린 관심 시퀀스로 구성된 전용 인터페이스에서 수행할 수 있으며, 5개의 프라임 LTRU 3개 및 U 5개의 하위 도메인에 초점을 맞춥니다. RT PCR 검증을 위한 PCR 프라이머의 후속 설계. 이 동영상을 시청한 후에는 기존의 바이오 마커 발견뿐만 아니라 지구용 마이크로레이 사용에 성공하기 위한 품질 전제 조건인 샘플 및 표적 준비와 관련된 중요한 단계를 마스터하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 우리는 아메트리 형식의 고밀도 마이크로어레이를 설계했으며, 건조한 non-con area NA 전사 또는 조절 코딩 유전자 발현이 활성화될 수 있는지 여부를 더 잘 이해하기 위해 유전자좌 발현의 개인을 최적으로 특성화하는 것을 목표로 합니다.

이 기술은 활성 발성의 체계적인 식별이 다양한 병리학의 유발 요인으로 유전적, 바이러스 및 환경적 가설을 통합할 수 있기 때문에 만성 및 전염병 분야의 연구자들에게 길을 열어줍니다. 기술 개념 증명 실험에서 제한된 수의 샘플로 작업하는 것은 바이오마커를 성공적으로 발견하고, 분석법의 견고성을 포함하여 통계적으로 검증된 워크플로우를 존중하고, 대상 환자 모집단의 대표 표본추출을 존중하는 등의 예방 조치를 취하는 것이 까다로울 수 있습니다.