Name: 전립선 암의 바이오 마커 발견에 신청 : 개인 HERV 궤적 발현 마이크로 어레이 기반의 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-02T17:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: 배우세요 전립선암 조직에서 HERV 발현 좌위를 식별하는 맞춤형 마이크로어레이 기법을 활용한 바이오마커 발굴 방법을. 이 기술은 암 진단을 위한 새로운 바이오마커 개발에 기여합니다.

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우리는 HERV-V2 프로토콜의 초기 개발 및 최적화에 기여를 위해 세실 Montgiraud, 줄리엣 Gimenez, 갈리 Jaillard와 버트 랜드 본느 와드 감사합니다. 우리는 또한 윤리적 고려 사항에 대한 자신의 지침을위한 hader Haidous을 감사드립니다.

1. 외과 병리학 담당하고 촬영까지 한 번 외과 의사에 의해 제거, 얼음에 전립선을 유지합니다. 2. 전립선 조직의 취급 <ol><li> 수술 국소 빈혈의 지연을 존중하기 위해, 수술 절제 후 30 분 이내에 헌신적 인 직원에 의해 실험실에 얼음에 과격한 전립선 절제 표본을 전송할 수 있습니다. 동결의 지연 미만 20 ~ 30 분 (그림 3A)해야한다. </li><li> 무게와 일반적인 프로토콜 (왼쪽 블랙 오른쪽에 예를 들어, 녹색,도 3B 및 3C 참조)에 따라 전립선 얼룩. </li><li> 후방 측 (그림 3D)에 선 (腺)의 큰 가로 섹션을 수행합니다. 전립선의 방향과 전방 측에 넣어. 멸균 된 수술 용 칼과 후방 측에 동맥의 큰 횡단면을 수행한다. </li><li> 전환 영역에서 조직의 조각을 해부,(그림 3E) 그대로 여백을두고 왼쪽과 오른쪽 주변 지역에. </li><li> 에펜 도르프 튜브에 조직의 코어를 넣어 액체 질소 (그림 3 층)에서 동결 및 저장 스냅. 당신이 결정하지 않는 경우 바이오 뱅크 단계 2.7로 직접 진행합니다. </li><li> 조직 검사에서 암의 전체 길이 10 mm의 우수한 경우에만 전립선 은행 업무를 수행합니다. 전립선을 닫고 선 왜곡과 수술 이익률 (그림 3G)의 최소한의 중단을 방지하기 위해 봉합 실을 사용합니다. 그런 다음 조직 학적 분석을위한 일반적인 절차에 따라 파라핀에 포르말린 및 embed와 과격한 전립선 절제 표본을 고정합니다. </li><li> 수직의 OCT 작은 마운드에 냉동 조직 코어를 탑재하고 저온 ​​유지 장치의 섹션을 확인합니다. 첫 싱글 5 μm의 동결 절편을 가지고 블루 톨루이딘으로 얼룩. </li><li> 조직의 특성을 분석하는 퀵 조직 학적 검사를 수행 (즉. 양성 또는 악성). 종양의에 대한조직, 종양의 세포의 양을 추정하고 종양의 세포의 80 % 이상 만 코어를 선택합니다. </li><li> 이 후, 새로운 단일 5 μm의 동결 절편을 수행하고 헤 마톡 실린, 에오신과 사프란으로 얼룩. 그런 다음, X 30 μm의 15 부분을 잘라의 RNase 무료 에펜 도르프 튜브에 넣습니다. </li><li> 헤 마톡 실린, 에오신과 사프란을 위해 지난 5 μm의 동결 절편을 가지고 프로 시저의 끝에서 종양의 세포의 양을 제어 할 얼룩. </li><li> 드라이 아이스의 에펜 도르프 튜브를 넣고 분자 생물학 실험실에 샘플을 보내드립니다. </li></ol> 3. RNA 추출, 정제 및 품질 관리 <ol><li> 균질화. 조직이 완전히 용액에 용해 될 때까지 Trizol/100 MG 티슈 1 ㎖의 존재하에 균질화를 수행한다. 점차적으로 트리 졸 솔루션을 추가하고 소형 분쇄기를 사용하여 얼음에 치료를 진행합니다. 일단 균질화, 에펜 도르프 튜브에 대한 해결책을 나누어지는 및 동안 실내 온도에서 트리 졸에 남겨오분. </li><li> 상 분리. 300 ㎕의 클로로포름 (150 μL의 BCP/1.5 ML 트리 졸)를 추가합니다. 소용돌이 15 초 후 2 ~ 3 분 동안 실온에 둡니다. 2-8 ℃에서 15 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기 </li><li> RNA 침전. 새로운 튜브에 조심스럽게 상단 수성 단계를 전송합니다. 750 ㎕의 이소프로판올을 추가합니다. 10 분 (반전에 의해 선동)을 실온에서 품어. C. ° C/-31 ° -19에서 2 시간을 품어 2-8 ℃에서 30 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기 샘플 </li><li> RNA 세척 및 서스펜션. 원심 분리 후, 상층 액을 제거합니다. 세척 RNA는 1 ㎖의 80 % EtOH로 (부드럽게 튜브 역)와 펠렛. 2-8 ℃에서 10 분 동안 7,500 XG에 원심 분리기 샘플 P1000 및 P10을 사용하여 상층 액을 제거합니다. 2 ~ 3 분 동안 건조한 공기에 EtOH로 남아 있습니다. 70 ° C 열 블록에 100 ㎕의 RNase가없는 물, 전송 관을 추가하고 펠렛을 용해 2 ~ 3 분 동안 앉아 보자. 그런 다음 얼음에 넣어. 에서 -19 ° C/-31 ° C에 대한 단기간의 저장 및 -장기 저장을 위해 80 ° C에서. </li><li> RNA 정화. RNeasy 미니 키트 (Qiagen 사)를 사용하여 RNA를 정화. 간단히, 100 μL의 RNA 시료 350 μL 버퍼 RLT를 추가하여 시작하고 잘 혼합 한 후 키아의 절차를 따르십시오. 마지막으로, 품질 관리 (단계 3.6)에 대한 (50 μL)의 개 정제 된 제품의 나누어지는 3 μl를 가지고. 에 보관 RNA -19 ° C/-31 ° C 짧은 기간 동안 또는 장기 저장을 위해 -80 ° C에서. </li><li> RNA QC (그림 4A). 제조업체의 지침에 따라, RNA의 품질과 Bioanalyzer (애질런트)와 Nanodrop (열)를 사용하여 RNA의 무결성을 확인합니다. RNA 무결성 번호 (RIN)은 RNA의 품질을 평가하는 데 사용된다. 특히, 18S와 28S 피크의 검출에 성공 강하게 추가 단계에서 샘플을 사용하는 것이 좋습니다. </li></ol> 4. WT-박수 RNA 증폭 WT-OV를 사용하여 증폭 단계를 수행하는 추천최적의 조건에서 ATION 증폭 키트 : <ul><li> 피펫 정밀도를 보장하기 위해 한 번에 더 적은 여덟 증폭 샘플을 실행합니다. 8 반응의 3 배치로 키트의 분할을 필요로 마스터 믹스를 준비 할 때 다음, 1 폐기물 부피를 차지한다. </li><li> 특별한 지시가없는 한 항상 얼음에 고정 해제 시약과 반응 튜브를 유지. </li><li> 정화 만 신선한 80 % 에탄올 용액을 사용합니다. </li><li> 프로토콜의 모든 단계에서 중지하지 마십시오. </li></ul><ol><li> 25 NG / μL의 농도를 얻기 위해 총 RNA를 희석. 희석 된 시료의 2 μl를 처리합니다. </li><li> 준비 폴리 1:25,000 희석을 달성하기 위해 폴리-A 제어 희석 버퍼 (어피 메트릭스)와 폴리 RNA 주식의 일련의 희석에 의해 RNA 제어 스파이크의 솔루션을 제공합니다.에게 1 단계 : 4.3 우선 물가의 cDNA 합성 - 4.8. 다음과 같이 언급 된 시약 공급 업체라고합니다 : A1 (제 스트랜드 프라이머 믹스), A2 (인터넷첫 스트랜드 버퍼 믹스), A3 (우선 물가 효소 믹스). </li><li> 실온에서 A1 및 A2를 해동. 2 초 동안 2 초 스핀의 소용돌이 믹서를 사용하여 혼합. 그런 다음, 신속하게 얼음에 배치합니다. 얼음에 A3를 놓습니다. </li><li> 0.2 ML PCR 튜브에 총 RNA (50 NG)의 2 μl를 넣고 A1의 2 μL (최종 부피 : 4 μL)를 추가합니다. 모자 2 초 동안 튜브를 스핀. </li><li> 5 분 동안 65 ° C에서 부화 한 후 얼음에 튜브를 배치합니다. </li><li> (하나의 반응에 주어진) 다음과 같이 첫 번째 가닥의 cDNA 마스터 믹스를 준비합니다. 피펫으로 믹스와 마스터 믹스 간단히 스핀 다운. 즉시 얼음에 배치합니다. <table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> 음량 </th></tr><tr><td> 먼저 스트랜드 버퍼 믹스 (A2) </td><td> 5 μL </td></tr><tr><td> 폴리 RNA 제어 (1:25,000) </td><td> 0.5 ㎕의 </td></tr><tr><td> 우선 물가 효소 믹스 (A3) </td><td> 0.5 ㎕의 </td></tr></tbody></table></li><li> 추가 6 &amp; #181, RNA / 프라이머 함유 튜브 마스터 믹스 L. 2 초 동안 튜브, 스핀을 쓸어 넘겨 혼합 빠르게 얼음 (최종 부피 10 μL)에 배치합니다. </li><li> 15 분 후 1 다음 10 분 후 분, 25 ° C, 10 분 동안 42 ° C와 70 ° C에 11 ° C에서 알을 품다. 4 ℃에서 멋진 유지 열 자전거 타는 사람에서 반응 관을 제거 간단히 회전과 얼음 계속. 두 번째 가닥의 cDNA 합성 단계로 바로 진행합니다. 2 단계 : 4.8 초 물가의 cDNA 합성 - 4.12. B1 (둘째 스트랜드 버퍼 믹스)과 B2 (제 스트랜드 효소 믹스)를 다음과 같이 언급 된 시약 공급 업체라고합니다. </li><li> 2 초 B2 및 B3 스핀 다운 빠르게 얼음에 배치합니다. 실온에서 B1을 해동. 2 초 동안 소용돌이 믹서를 사용하여 혼합, 빠르게 2 초 동안 스핀과 얼음에 배치합니다. </li><li> (하나의 반응에 주어진)는 다음과 같이 두 번째 스트랜드 마스터 믹스를 준비합니다. 피펫으로 믹스와 마스터 믹스 브리 스핀 다운비행. 즉시 얼음에 배치합니다. <table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> 음량 </th></tr><tr><td> 둘째 스트랜드 버퍼 믹스 (B1) </td><td> 9.75 μL </td></tr><tr><td> 두 번째로 물가 효소 믹스 (B2) </td><td> 0.25 μL </td></tr></tbody></table></li><li> 각각의 첫 번째 스트랜드 반응 튜브에 마스터 믹스의 10 μl를 추가합니다. 배, 얼음 (: 20 μl의 최종 볼륨)에 2 초와 장소에 스핀을 피펫으로 섞는다. </li><li> 5 분 후, 1 ~ 30 분 후, 10 분 후 분, 25 ° C, 50 ° C, 70 ° C에 11 ° C에서 알을 품다. 4 ℃에서 멋진 유지 열 자전거 타는 사람에서 반응 관을 제거 간단히 회전과 얼음 계속. 후 두 번째로 물가 향상 단계로 바로 진행합니다. 3 단계 : 4.13에서 후 두 번째로 물가 향상 - 4.15. 다음과 같이 언급 된 시약은 공급 업체에 의해 참조됩니다 B1 (둘째 스트랜드 버퍼 믹스), B3 (반응 향상 효소 믹스). </p&gt; </li><li> (하나의 반응에 주어진) 다음과 같이 B1과 B3 믹스를 조합하여 마스터 믹스를 준비합니다. 피펫으로 믹스와 마스터 믹스 간단히 스핀 다운. 즉시 얼음에 배치합니다. <table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> 음량 </th></tr><tr><td> 둘째 스트랜드 버퍼 믹스 (B1) </td><td> 1.9 ㎕의 </td></tr><tr><td> 반응 향상 효소 믹스 (B3) </td><td> 0.1 ㎕의 </td></tr></tbody></table></li><li> 각 두 번째 스트랜드 반응 튜브에 마스터 믹스 2 μl를 추가합니다. 배, 얼음 (: 22 μl의 최종 볼륨)에 2 초와 장소에 스핀을 피펫으로 섞는다. </li><li> 20 분 후, 1 ~ 15 분 후 분, 37 ° C, 80 ° C에 11 ° C에서 알을 품다. 4 ℃에서 멋진 유지 간단히 회전 및 얼음에 배치, 열 자전거 타는 사람에서 반응 관을 제거합니다. SPIA 증폭 단계로 바로 진행합니다. 4 단계 : 4.16에서 SPIA 절차에 의해 단일 가닥의 cDNA (sscDNA)의 합성 -4.19. C1 (SPIA 프라이머 믹스), C2 (SPIA 버퍼 믹스), C3 (SPIA 효소 믹스)를 다음과 같이 언급 된 시약 공급 업체라고합니다. </li><li> 실온에서 C1 및 C2를 해동. 2 초 동안 소용돌이 믹서, 스핀을 사용하여 신속하게 얼음에 배치하여 혼합. 얼음에 C3를 해동. 부드럽게 배를 반전 내용을 섞는다. 공기 방울을 도입하지 않도록하십시오. 그런 다음, 얼음에 2 초와 장소를 회전. </li><li> 다음과 같이 0.5 폐기물의 부피를 차지 SPIA 마스터 믹스를 준비합니다. 피펫으로 믹스와 마스터 믹스 간단히 스핀 다운. 즉시 얼음에 배치합니다. <table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> 음량 </th></tr><tr><td> SPIA-버퍼 믹스 (C2) </td><td> 5 μL </td></tr><tr><td> SPIA 입문서 믹스 (C1) </td><td> 5 μL </td></tr><tr><td> SPIA 효소 믹스 (C3) </td><td> 10 μL </td></tr></tbody></table></li><li> 강화 된 두 번째 스트랜드 반응 t에 SPIA 마스터 믹스 20 μl를 추가합니다우베. 6 배속, 스핀을 피펫 팅 빠르게 얼음에 (: 42 μl의 최종 볼륨)을 배치하여 혼합. </li><li> 5 분 후, 1 분 후, 60 분 동안 47 ° C와 95 ° C에 11 ° C에서 알을 품다. 4 ℃에서 멋진 유지 열 자전거 타는 사람에서 튜브를 제거 짧게 스핀 얼음에 배치합니다. </li></ol> 5. sscDNA 정화 및 품질 관리 <ol><li> sscDNA 정화. QIAquik PCR 정제 키트 (Qiagen 사)를 사용 sscDNA 정화. 간단히, 증폭 된 cDNA 제품의 42 μL에 200 μL 버퍼 PB를 추가하여 시작 혼합 열의 부하. 그런 다음 키아의 절차를 따르십시오. 마지막으로, 품질 관리 (단계 5.2)에 대한 (30 μL)의 개 sscDNA 정제 제품의 나누어지는 3 μl를 가지고. </li><li> (도 4B)을 수득하고 크기 분포 검증 sscDNA. 제조업체의 지침에 따라, sscDNA 수율과 Bioanalyzer과 Nanodrop를 사용하여 크기 분포를 확인합니다. 증폭 된 cDNA의 분포의 크기는 ㄱ해야전자 일반적으로 600 기지 주변 피크 긴 100 1,500 기지 사이를 포함. </li></ol> 6. sscDNA 분열 <ol><li> 핵산 분해 효소가없는 물과 볼륨 조정, 30 μL의 cDNA를 2 μg을 준비합니다. </li><li> 10 배 OPA 버퍼 PLUS 솔루션에서 시작하여, 1X 한 포르 - 모든 버퍼 PLUS (OPA)를 준비합니다. </li><li> 0.2 U / ㎕의 DNA 분해 효소를 준비 I (1 U / μL DNA 분해 효소 I의 5 배 희석). </li><li> 다음과 같이 분열 마스터 믹스를 준비합니다 (하나의 반응에 주어진) <table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> 음량 </th></tr><tr><td> 10X 한 포르 - 모든 버퍼 PLUS </td><td> 3.6 ㎕의 </td></tr><tr><td> DNA 분해 효소 I (0.2 U / μL) </td><td> 3 μL </td></tr></tbody></table></li><li> sscDNA의 30 μL로 분할 믹스의 6.6 μl를 추가합니다. </li><li> 스핀 후 10 분 동안 95 ° C에서 DNA 분해 효소 I을 비활성화하고 얼음에 보관, 10 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 나누어지는 1 &amp;# 181; 애질런트 기반 크기 분포 검증을위한 조각의 cDNA L. </li><li> sscDNA 크기 분포 확인 (그림 4C). Bioanalyzer (애질런트)를 사용하여 sscDNA 크기 분포를 확인합니다. 단편화 된 cDNA의 크기 분포는 전형적으로 57과 200 사이의 염기로 구성되어야한다. </li></ol> 7. 파편이 sscDNA의 라벨링 <ol><li> DEPC 물에 5 mm로 DLR-1A 7.5 밀리미터를 희석. </li><li> 다음과 같이 레이블 마스터 믹스 (하나의 반응에 주어진)를 준비 : <table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> 음량 </th></tr><tr><td> 배 TDT 반응 버퍼 </td><td> 14 μL </td></tr><tr><td> 의 CoCl2 (25 ㎜) </td><td> 14 μL </td></tr><tr><td> DLR-1A (5 ㎜) </td><td> 1 μL </td></tr><tr><td> 터미널 트랜스퍼 (400 U / μL) </td><td> 4.4 ㎕의 </td></tr></tbody></table></li><li> 라벨 믹스의 33.4 μl를 추가각 조각의 cDNA 샘플. </li><li> 튜브를 가볍게 치면 혼합 짧게 회전, 60 분 동안 37 ° C에서 배양 한 후 얼음에 보관하십시오. </li></ol> 8. HERV 칩 마이크로 어레이에 하이브리드 <ol><li> 예비 혼성화 믹스 (어피 메트릭스) 200 μL와 HERV의 유전자 칩을 Prewet 10 분, 50 ° C, 60 rpm에서 배양한다. </li><li> (하나의 반응에 주어진) 다음과 같이 하이브리드 믹스를 준비합니다 <table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> 음량 </th></tr><tr><td> 제어 올리고 B2 (3 ㎚) </td><td> 3.3 ㎕의 </td></tr><tr><td> 20 배 진핵 하이브리드 제어 </td><td> 10 μL </td></tr><tr><td> 배 하이브리드 믹스 </td><td> 100 μL </td></tr><tr><td> 99.9 %의 DMSO </td><td> 17.7 μL </td></tr></tbody></table></li><li> 최종 할머니를 만들기 위해 실온에서 조각과 표지 된 cDNA의 69 μL에 하이브리드 믹스 131 μl를 추가합니다200 μL의 륨. </li><li> 혼합하고 95 ° C에서 2 분간 변성 후 5 분간 최대 속도에서 5 분 원심 분리기 50 ° C에서 알을 품다. </li><li> prewetted HERV의 유전자 칩을 비우고 200 ㎕의 목표 준비를로드합니다. 두 개의 격벽에 거친 반점을 적용합니다. </li><li> 18 시간 동안 50 ° C, 60 rpm에서 하이브리드. </li><li> 18 시간 후, HERV의 유전자 칩을 비우고 4 ℃에서 수집 된 하이브리드 솔루션을 저장 칩은 즉시 4 ° C.에 저장된 유체 상으로 실행되지 않는 경우 250 μL 세척 버퍼 A.와 프로브 배열 채우기 </li></ol> 9. 세탁과 염색 <ol><li> GCOS 메뉴 바에서 유체를 실행합니다. 유체 대화 상자에서 원하는 역 선택 - (1 - 4), 모든 모듈에 대한 Shutdown_450을 선택하고 실행합니다. 밀리 Q 물에 3 유체의 흡입 라인을 담근다. LCD 화면의 지시 사항을 따르십시오. </li><li> 모든 모듈에 Prime_450 프로그램을 적용합니다. 세척 버퍼에 대한 튜브를 배치200 ㎖의 세척 버퍼 B를 포함하는 병에 400 ㎖의 세척 버퍼를 포함하는 병, 워시 버퍼 B에 대한 하나의 다시, LCD 화면의 지시 사항을 따르십시오. </li><li> 바늘을 들어 올려 600 ㎕의 얼룩 칵테일 1 (SAPE 솔루션 믹스) 600 ㎕의 얼룩 칵테일을 배치 2 (항체 솔루션 믹스) 위치 # 1과 # 2의 마이크로 원심 튜브를 함유하고, 800 ㎕의 배열 위치 # 3에 완충 용액을 들고 . </li><li> 화면의 지시에 따라, FS450-004 프로토콜을 선택하고 각 모듈을 실행, 각 모듈에 대한 권리 칩을 할당합니다. </li></ol> 10. 스캐닝 <ol><li> GS3000 스캐너 워밍업. 그것은 빛이 켜졌을 때 스캔 할 준비가되어 있습니다. </li><li> 누출 방지하기 위해 격벽에 거친 반점을 적용 한 후 스캐너에 직접 선택적으로 자동 로더에 칩을 놓습니다. 스캔을 시작합니다. </li><li> 칩을 스캔 한 후. CEL 파일이 생성됩니다. &lt;이미지를 확인하고 프로브 세포를 (확인하는 자리에 그리드를 정렬강한&gt; 숫자 4D-F). </li></ol> 11. 데이터 분석 <ol><li> 품질 관리. 표준 Affymetrix의 참조는 HERV-V2 칩 QC 기준을 충족하는지 확인하기 위해 제어합니다. 이를 위해 다음과 같은 표현이 사용될 수있다 : 강도 중앙값 대 로그 강도 값 분포 (농도 플롯 및 박스 플롯), 중앙값 절대 편차 (MAD) (MAD-메드) 플롯, 배경 플롯 정규화 비 눈금 표준 오차 (n 스위치) 플롯과 상대 로그 식 (RLE) 플롯. </li><li> 정규화. 또한, 데이터 집합 예기치 않은 배치 효과를 강조하고 통계 분석을하기 전에를 해결하기 위해 탐구해야한다. 데이터 전처리 따라서 배경 보정 (예. 트립토판 프로브 기준 신호에 따라), RMA 정상화 및 요약 (15) 다음을 포함한다. </li><li> 데이터 마이닝 및 차등 발현 유전자에 대한 검색. 칩을 정상화하고 계층 clusteri을 적용데이터 집합 (그림 6A)을 탐구하는 NG 방법. 그런 다음, 마이크로 어레이의 고전적인 의미 분석 (SAM) 거짓 발견 속도 (FDR) 수정 (17)에 의해 다음 절차 (16)를 사용하여 차등 발현 유전자 (DEG)에 대한 검색을 수행합니다. 이 단계가 완전히 PARTEK GS와 같은 일부 소프트웨어 분석 제품군에 통합되어 있지만, 대안 Bioconductor 프로젝트 19 패키지와 R 통계 소프트웨어 (18)를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 통계 분석을 한 후, 표현의 값이 2 이하 6 않은, probesets을 제외 할 데이터 집합을 필터링 할 수 있습니다. </li><li> 시각화 및 해석. 주석 데이터베이스를 이용하여 전용 인터페이스 HERV-V2 마이크로 어레이의 결과를 해석한다. </li></ol>

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<li>Girometti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+predictive+value+for+cancer+in+patients+with+%22gray-zone%22+PSA+level+and+prior+negative+biopsy%3A+preliminary+results+with+multiparametric+3.0+Tesla+MR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Negative predictive value for cancer in patients with "gray-zone" PSA level and prior negative biopsy: preliminary results with multiparametric 3.0 Tesla MR.</a> J. Magn. Reson. Imaging. 36, 943-950 (2012).</li>
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이 작품은 BIOMERIEUX SA, 호스피스 Civils 드 리옹과 프랑스 공공 기관 OSEO (새로운 치료 접근 방법에 대한 고급 진단, 맞춤 의학에 전념 프랑스 정부 지원 프로그램)에 의해 지원되었다. PP, VC, GO, 뉴 멕시코, 그리고 FM은 BIOMERIEUX SA의 직원입니다. PP, 뉴 멕시코와 FM이 논문의 연구 결과를 포함하는 특허 신청을 제출했다.

지난 10 년 동안, HERV 발현 측정을위한 시도의 대부분은 RT-PCR 기법을 사용한 하나 HERV 장군 (25), (26) 내에서 일반적인 경향을 평가하는 폴 유전자의 상대 보전에 따라 특정 궤적 20-24 또는에 초점을 . 또한 HERV 패밀리 27,28의 발현을 검출하고 정량화하기위한 저밀도 마이크로 어레이와 결합 매우 퇴화 프라이머를 사용한 PCR의 증폭. 패밀리 내의 개별 궤적의 발현을 추적하기 위해, 클로닝 및 염기 서열과 결합 보존 영역의 PCR 증폭을 기반 접근법에 HML-2 29,30 또는 HERV E4.1-31 패밀리의 전사적으로 활성 고유 요소를 사용할 식별. 또한 복제 및 시퀀싱 단계로 끝나는, 활성 HML-2 특정 인간의 고독한 LTR에 의해 둘러싸 확인 반복 사이에 발기인을 파악하는 것을 목표로 게놈 반복 식 모니터링 기술 <sup&gt; (32, 33). 우리는 연속적 가족 34,35 paralogous 내의 요소들 간의 상호 반응을 최소화하기 위해 반복 요소 프로브 설계를위한 적당한 방법론을 도입 HERV의 전 사체의 분석에 전용 고밀도 마이크로 어레이의 두 세대를 개발했다. HERV-W, HERV-H, HERV-E 4.1, HERV-FRD, HERV-K HML-2와 HERV-K HML-5 가족의 2,690 별개의 proviruses 및 2,883 솔로 LTR에 의해 둘러싸 대상으로 HERV-V2 칩은 발표 추정 전립선 암 바이오 마커의 식별 정보를 이용하여 본 논문에서 설명 조직 (35)의 넓은 범위에서 1,718 HERV의 궤적 (도 7a 및 B)의 식입니다. 또, 관련 궤적상의 여러 probesets의 사용은 그것의 전사 조절에 대해 유익하다. 첫째, U5 긍정적와 함께 U3 부정적인 신호가 발기인으로 LTR을 분류하고, 반대로 U3 긍정적 U5 부정적인 신호는 폴리아 데 닐화 역할을 반영 할 수있다. 우리는 그래서 난배열에 의해 제공이 U3-U5 이분법 정보를 기반으로 조직 (35)의 넓은 범위에서 326 프로모터 LTR에 의해 둘러싸 dentified, 우리가 제안하고 실험적으로 이러한 자율적 인 전사가 메틸화 따라 후생 유전 학적 과정 34 (그림에 의해 제어 된 몇 가지 선택된 경우에 확인 8). 태반이나 종양의 고환 34 ERVWE1/Syncytin1 발현 프로파일에 의해 그림과 같이 두 번째로, 예를 들어, LTR에서 신호의 검출, 개그와 ENV 독립 probesets 또는 특정 스플 라이스 접합을 대상으로 프로브에서 발행는 프로 바이러스 접합 전략에 대한 정보를합니다. 이 HERV 특정 프로브 선택의 과정은 (그림 8)로 효율적으로 기존의 유전자를 36으로, 조직 관련 접합 전략의 식별을 지원하기에 충분한 강력한 있음을 나타냅니다. 이 방법은 개별적 HERV 궤적 표현식을 식별하는 첫번째 시도어피 메트릭스 기술을 기반으로 정의 고밀도 마이크로 어레이를 사용. 마이크로 어레이 형식의 명확하게 식별의 장점은 (I)로 구성된 HERV의 사체를 해독하는 여러 HERV 가족의 조정 탐사 및 각 현장에 대한 다른 지역의 (II)를 동시에 독립적 인 분석, 예. 솔로 프로 바이러스 LTR에 의해 둘러싸, 개그 또는 ENV 지역 및 사전 HERV 요소의 기능에없는 프로 바이러스 구조와 관련된 가능한 접합 접합에 대한 U3 및 U5 도메인. 전망은 마이크로 어레이 관련 biocomputing 도구에서 주석의 개선에 의존한다. 이것은 하나의 예 입증 활동에 HERVs이 lncRNA 전사를 운전하거나 더 많거나 적은 근위 코딩 유전자 발현을 조절 여부와 같은 생물 학적 가설에 칩의 신호를 변환 할 수 있도록해야합니다. 사실, 이러한 가정은 V의 구성 요소를 포함하는 전립선 암 관련 ncRNA 성적 증명서를 확인 최근의 연구에 의해 지원됩니다HERV-K 내인성 레트로 바이러스의 가족이나 일부 바이러스 LTR 프로모터 영역 (37)의뿐만 아니라, 두 개의 유전자가 융합 이벤트 즉 HERV-K22q11-ETV1과 HERV-K17-ETV (38, 39)에서 iral의 ORF. 이와 함께, LTR 기능과 접합 전략 식별과 결합이 전체의 사체 방식은 트리거 만성 40, 41에 HERV 식의 구성 요소 및 감염 질환 42, 43 대 마커를 해독하는 데 도움이 될 수 있습니다.

(도에 HERVs라고도 함) 인간의 내인성 레트로 바이러스는 우리의 게놈을 통해 확산됩니다. 그들은 복사 - 붙여 넣기 전파 프로세스에 의해 다음과 다수 체 가족에 이르는 세균 라인 내 조상의 독립 감염에서 유래. 오늘날, 그들은 더 이상 전염되지 않습니다하지만 그들은 인간 게놈의 8 %를 차지, 비교 지점으로, 엑손은 인간 게놈의 2 %에 걸쳐. 2012 년에 발표 된 ENCODE 프로젝트의 데이터는 다른 RNA의 종류가 intergenic 지역의 삼분 포함, 게놈의 약 62 %를 커버 것으로 나타났다. 또한, 전사 조절 모티프의 양이 단백질 - 코딩 엑손에 대응 한보다 적어도 4.5 배 더 높은 것으로 보인다. 그것은 전염성 레트로 바이러스에서의 일반적인 기능입니다로에 HERVs 긴 터미널 반복 (LTR)은 잠재적 인 전사 조절 인자의 넓은 범위를 나타냅니다. 역사적으로 떨어져 태반이나 고환으로 표현 몇 가지 유전자 좌에서, 그것은 일반적으로 HERV 인해 EP에 침묵 것으로 생각되었다igenetic 규제. 그러므로, 우리는 최적 나은 그들이 lncRNA 전사를 구동 또는 유전자 발현을 코딩 변조하는 경우가 활성화되어 있는지 여부를 이해하기 위해, 개별 HERV 궤적 식을 특성화 목표 Affymetrix의 형식으로, 고밀도 마이크로 어레이를 설계했다. HERV-V2 유전자 칩 불리는이 도구는 23,583 HERV의 probesets을 통합하고 5573 솔로 LTR에 의해 둘러싸 구성 별개의 HERV 요소뿐만 아니라 전체 및 부분 proviruses (그림 2)를 구별 할 수 있습니다. 진단, 평가 및 계획 : 전립선 암의 진단은 임상 실험에서 전립선 특이 항원 (PSA) 바이오 마커, 형태 전립선의 변경 및 병리학 자에 의해 관찰 마지막으로 전립선 생검을 평가하는 직장​​ 수지 검사의 용량을 기반으로합니다. 전립선 암에 대한 PSA와 같은 기존의 암 바이오 마커 사이에 충분한 민감도와 특이도의 부족은 널리 AF를 인정 받고 있습니다임상 적 의미의 터 수십 년 1. 처음에, PSA는 전립선의 11 선암의 진단과 치료를 위해 제안되었다. 그것은 암 검사를 위해 제안하고 질병 (12)의 발전을 모니터 후자이었다. 그러나, 정기적으로 요구되는 질문은 남아있다 :​​ &#39;PSA를 사용하는 방법&#39;. (II) 두 개의 큰 코호트 연구는 유럽에서 수십만 명의 사람들을 등록하고, (I) 2.5-10 NG의 혈청 농도에 해당하는 회색 영역 / ㎖는 분명 차이가 암과 noncancer 2 사이에하는 것을 허용하지 않습니다 , 이론 심플, 같은 PSA 통관, PSA 속도와 시간을 두 배로으로 수술 후 PSA 운동 매개 변수 (III) 분석, 미국 질병 별 사망률 (13, 14)의 측면에서 검사의 유용성에 대한 명확한 결론에 도달하는 데 실패 실용적인 응용 프로그램의 3,4에 상당한 도전을 제기 할 수 있습니다. 우리는 바이오 마커 응용 프로그램에게, 앞으로 것을 예상 할 수 있습니다lications은 감시 대기보다 또는 종양의 표현형에 따라 덜 공격적 치료 사이의 임상 적 선택을 지원합니다. 병리학 자에 의해 렌더링 진단에 관한 제 제한 요인은 (많은 암이 샘플링에 의해 놓친) 전립선 생검 내에서 20 %의 위음성 진단에서 비롯됩니다. 두 번째 문제는 악영향을 제시 할 수있다 음 하나, 다음과 같은 추가적인 조직 검사 절차의 필요성 다룬다. 과격한 전립선은 현재 전립선 암의 표준 치료의 하나입니다. 이는, (10 글리슨 7), 특히 적극적인 패턴의 경우, 45-65년 노화, 건강한 환자에서 종양 병소 또는 명백한 종양을 제안한다. 그것은 지금 로봇 보조 수술을 사용하여 우리 부서에서 수행됩니다. 때문에 분자 마커는 향후 몇 년 동안 가장 중요있을 것이라는 점을 성장의 증거, 우리는 우리의 모든 환자에게 전립선을위한 프로그램에 참여의 가능성을 제안하기로 결정조직 은행. 더 정확하게, 전립선 암의 확대 분자 연구 프로그램은 전립선 절제 표본에서 높은 품질의 신선한 종양 조직에 대한 액세스에 대한 요구 증가로 이어질. 이 연구는, 특히 게놈 접근 방식은 높은 DNA / RNA 품질의 큰 샘플을 요구했다. 종 양성과 같은 환자에서 인접 &#39;비 종양의&#39;조직이 필요합니다. 급진적 prostatectomies을 처리하고 처리하기위한 권장 사항은 무대와 마진 상태함으로써 잠재적 인 추가 치료 및 예후를 결정하는 병리학 적 기능을 유지하도록 설계되어 있습니다. 어떤 신선한 조직 표본 추출 방법은, 따라서 진단에 수용 할 수 있도록 후속 병리학 적 평가에 손상을주지해야한다. 전립선의 거시적 해부 어렵고 큰 관심 마진 조직과 캡슐의 침략에 지불해야합니다 : 전립선 은행에 대한 해부는 항상 동의에 따라 훈련 uropathologist에 의해 수행되어야한다D 프로토콜입니다. 의료 교수진과 국가 의료 보드의 윤리위원회는 이러한 조사에 동의하고 모든 환자가 전립선 조직 은행에 포함에 대한 동의를 얻었다 알렸다.

<table><tbody><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>RNA poly-A control stock</td><td>Affymetrix</td><td>900433</td><td></td></tr><tr><td>DNAse 1</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>1,000 U (1 U/&micro; l)</td></tr> <tr><td>말단 전이 효소</td><td>3333574001 Roche 400 U. 효소 및 코엔자임 (CoCl2).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DLR-1a</td><td>Affymetrix</td><td>900542</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization 내부 제어 B2 및 20x 진핵 교잡 제어</td><td>Affymetrix</td><td>900454</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Hybridization, 세척 및 염색</td><td>Affymetrix</td><td>900720</td><td>PreHybridization Mix 및 2x Hybridization Mix 포함 30 반응</td></tr><tr><td>10x One-Phor-All Buffer PLUS</td><td></td><td></td><td>DEPC 처리 된 물의 조성 : 100 mM 트리스 - 아세테이트 pH 7.5; 100mM 마그네슘 아세테이트; 500mM 아세트산 칼륨.</td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>RNA cleanup protocol</td></tr><tr><td>WT-Ovation RNA 증폭 시스템</td><td>Nugen</td><td>2210-24</td><td></td></tr><tr><td>QIAquik PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Material Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments Nanodrop</td></tr><tr><td>1000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GeneChip 스캐너 3000 7G</td><td>Affymetrix</td><td>GS30007G</td><td>옵션: 오토로더</td></tr><tr><td>GeneChip Fluidics Station 450</td><td>GeneChip</td><td>FS450</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip Hybridization 640</td><td>Oven Affymetrix</td><td>640</td><td>GeneChip 프로브 어레이 캐리어</td></tr> <tr><td>4개 포함GeneChip Scanner 3000 고해상도 스캐닝 패치</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HERV-V2 칩</td><td>Affymetrix</td><td></td> 맞춤형 어레이를 포함한 GeneChip 운영 소프트웨어(GCOS)가 로드된 워크스테이션<td>. 마이크로어레이 가용성(연구 전용)은 다음 연락처로 문의하십시오. Fran&ccedil; ois Mallet Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioM&eacute; rieux 의료 진단 발견 부서 Centre Hospitalier Lyon Sud, B&acirc; timent 3F 69495, Pierre B&eacute; nite cedex France 전화: 33 (0)4 72 67 87 85 이메일: francois.mallet@biomerieux.com</td></tr><tr><td colspan="4">HERV-V2 conception 전용 데이터베이스 및 주석 전용 데이터베이스 구축, 6개의 HERV 계열에 속하는 게놈 HERV 염기서열 그룹화, (i) 각 HERV 계열의 가장 완전하고 대표적인 서열을 문헌에서 선택하고 프로토타입 서열로 정의했습니다(그림 2). (ii) 6개의 프로토타입에는 LTR(U3/R/U5) 및 내부 부품(gag/pol/env)을 참조하여 기능적으로 주석이 달렸습니다. (iii) 그런 다음 이러한 기능 시퀀스를 입력 라이브러리로 사용하여 RepeatMasker44를 적용했습니다. 모든 관련 염기서열에 대한 게놈 전체 검색은 최소 80% 상동성(NCBI 36/hg18)을 기반으로 인간 게놈에 대해 수행되었습니다. (iv) 마지막으로, 이 프로세스에 의해 검색된 기능 서열은 게놈 위치를 기반으로 별개의 유전자좌로 조립되고 최종적으로 전용 HERV 데이터베이스에서 구현되었습니다. HERV-gDB3라고 하는 이 데이터베이스에는 10,035개의 개별 HERV loci35. Locus specific probes design HERV-gDB3부터 시작하여 25-mer 후보 프로브의 중첩 트랙이 먼저 생성되었습니다. 그런 다음 교차 혼성화 가능성을 평가하기 위해 KASH 45를 사용하여 각 후보 프로브를 인간 게놈에 대해 정렬했습니다. 이 후자의 추정은 이 목적을 위해 특별히 개발되었으며 EDA+라고 하는 모델에 의해 수행되었습니다. 간단히 말해서, EDA+의 원칙은 25-mer 타겟/프로브 혼성화 복합체의 불일치 및 갭으로 인한 불안정성을 고려하는 것입니다. 낮은 교차 혼성화 위험(즉. 적은 수의 비특이적 게놈 표적)을 나타내는 후보 프로브를 선택하고 마지막으로 probesets. Custom HERV GeneChip microarray 맞춤형 HERV GeneChip은 23,583개의 HERV 프로브 세트를 통합하고 5,573개의 개별 HERV 요소를 구별할 수 있습니다. 단독 LTR, 완전 및 부분 프로바이러스로 구성됩니다(그림 2). 편향되지 않은 증폭 및 혼성화를 위한 표준 Affymetrix 제어 프로브도 마이크로어레이에 포함되었습니다.</td></tr></tbody></table>

전립선 암의 바이오 마커 발견에 신청 : 개인 herv 궤적 발현 마이크로 어레이 기반의 식별

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

전립선 - 특이 항원 (PSA)은 임상 사용에서 전립선 암을위한 진단 바이오 마커 메인이지만, 특히 낮은 투여 한 값에, 특이성 및 감도 부족하다. &#39;PSA를 사용하는 방법&#39;중 하나 명확한 감별법이 암과 noncancer 2 사이 또는 환자 다음에하는 것을 허용하지 않습니다 2.5-10 NG / ㎖의 혈청 농도에 해당하는 회색 영역으로 진단을 위해, 현재의 문제가 남아있다 업 수술 후 PSA의 분석으로 운동 매개 변수는 실용적인 응용 프로그램 3,4 상당한 도전을 제기 할 수 있습니다. 또한, 비 암호화 RNA를 (ncRNAs)는, 질병 등의 새로운 마커를 제공 전립선 암 5,6의 예 PCA3 종양 생물학의 특성화되지 않은 부분을 공개 할 잠재력을 지닌, 인간의 암의 핵심 분자로 부상하고있다. 또한 2012 년에 발표 된 ENCODE 프로젝트의 데이터는 다른 RNA 유형이 세대의 약 62 %를 커버 것으로 나타났다오메. 또한 전사 조절 모티브의 양이 단백질 - 코딩 엑손에 대응 한보다 적어도 4.5 배 더 높은 것으로 보인다. 그것은 전염성 레트로 바이러스에서의 기본 기능이기 때문에 따라서, 인간의 내인성 레트로 바이러스 (에 HERVs)의 긴 터미널 반복 (LTR에 의해 둘러싸는), 추정 / 후보 전사 조절 서열의 넓은 범위를 구성한다. 인간 게놈 전체에 퍼져에 HERVs는 복사 - 붙여 넣기 전파 과정 다음에 인간 게놈의 8 %를 차지하는 가족 (엑손은 우리의 게놈의 2 %에 걸쳐 있습니다 다중 사본을 선도 세균 라인 내 조상의 독립 감염에서 시작 ). 일부 HERV 궤적은 여전히 암 ~ 10 등 여러 가지 병리와 관련 된 단백질을 표현한다. 우리는 최적 나은 그들이 ncRNA 전사 또는 m을 구동하는 경우가, 활성화 될 수 있는지를 이해하기 위해, 개별 HERV 궤적 식의 특성을 목표로, 어피 메트릭스 형태로, 고밀도 마이크로 어레이를 설계했다odulate 유전자 발현을 코딩. 이 도구는 전립선 암 필드 (그림 1)에 적용되었습니다.

transcriptomic 연구 값은 생물학적 출발 물질의 품질에 주로있다. RNA 추출이 최적의 조건에서 수행되는 경우, RNA 무결성 번호 (RIN)은 일반적으로 7 이상 (그림 4A)입니다. 어피 메트릭스 HERV-V2 칩의 cDNA 2 μg을 혼성화 할 필요성은 증폭 과정의 사용을 의미한다. 성공적인 증폭 단계는 종 모양의 분포 (그림 4B)로 연결됩니다. 이어서, DNAse1 단편화는 약 100 뉴클레오타이드 혼성화 (도 4C)의 앞에 cDNA의 크기 분포를 균일화하기 위해 수행된다. 하이브리드 및 스캔 (그림 4D) 한 후, 이미지의 육안 검사 그리드가 아니라 반점 (그림 4E)에 정렬되어 있는지 확인하는 하나의 수 및 하이브리드 컨트롤이 일치하는 경우 (그림 4 층). 이 단계는 마이크로 어레이를 제외하기 위해 유용하는 공기 기포 나 오류<html> 실험하는 동안 오류가 발생했습니다. 칩은 QC (그림 5)를 통과하고 정상화, 리옹 쉬 병원에서 5 경기 페어 종양과 정상 전립선 RNA 샘플의 통계 분석은 차등 발현 값으로 207 HERV의 probesets의 식별 (p.val을 주도하면 &lt;0.05) (그림 6A). 이 기록을 지원하기 위해 전립선 관련 정보를 얻기 위해, 35 추가 일치 쌍 샘플 (결장, 난소, 고환, 유방, 폐, 전립선)은 결국 확인 된 분석 및 SAM-FDR 절차 (FDR은 = 20 %)에 추가 된 44 전립선 특이 HERV의 probesets. 그 중 가장 중요한 10 HERV 구조는 (그림 6B)에 설명되어 있습니다. 또한 임상 연구는 이러한 후보 생체의 감도 및 특이성의 값을 평가하기 위해 요구 될 것이다. pload/50713/50713fig1.jpg &quot;폭 =&quot;는 500px &quot;/&gt; . 병원에서 전반적인 절차의 그림 1 제도 후보 바이오 마커의 식별을 선도 : (샘플 준비, 목표 준비, 마이크로 어레이 처리 2-6) 벤치 (1 임상 및 병리학 자에 의해 조직 준비하여 전립선) (7 : HERV의 마이크로 어레이의 biocomputing 분석). 정상 조직에서 파생 된 핵산이 주황색으로 묘사되며, 종양의 지역에서 파생 된 핵산 (오렌지) 및 종양 특정 (블랙) 핵산 정상의 혼합으로 구성되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig2.jpg" width="500px" /> . 그림 2 개념과 HERV-V2 칩의 내용 : HERV 시퀀스인간 게놈에서 검색 HERV-gDB3라는 데이터베이스에 저장되어, 다음 25 메르 후보 프로브는 결과 목표 하위 영역이 각각 그려져있다 (결국 배열에 합성되기 전에 전용 하이브리드 모델링 절차 (EDA +)를 통과 가족). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig3.jpg" width="500px" /> 병리학 자에 의해도 3. 전립선 취급. (A) 신선한 과격한 전립선 시험편은 실험실로 전달된다. (BC) 전립선은 (왼쪽에 검은 색 오른쪽에 녹색) 스테인드된다. (D) 후방 측의 선 (腺)의 큰 횡단면. (E) 그대로, 조각 복장 여백을 남겨조직의 에스는 전립선의 다른 지역에서 해부된다. 조직의 (F) 코어는 에펜 도르프 튜브에 배치됩니다. (G) 봉합 실이 전립선을 닫고 선 왜곡과 수술 여백의 최소한의 중단을 방지하기 위해 사용됩니다. 그 후, 과격한 전립선 절제 표본은 조직 학적 분석을위한 일반적인 절차에 따라 포르말린에 고정하기위한 준비가되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig4.jpg" width="500px" /> 핵산 준비와 혼성화 효율의 그림 4. 품질 관리. (A) RNA 무결성, (B)의 cDNA 표적과 혼성화 단계에서 사용되는 (C) 단편화 표적 증폭. 일세 가지 품질 관리가 RNA 나노 칩과 진핵 생물 나노 세리에 II의 분석을 사용하여 Bioanalyzer로 얻을 수 있었다 이거지. (D) 스캔 후 HERV-V2 마이크로 어레이 하이브리드 영역, (E) 왼쪽 상단에 보여주는 그리드 정렬 컨트롤의 확대 및 하이브리드 컨트롤을 탐지 보여주는 중심 영역의 (F) 확대의 전체 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig4highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig5.jpg" width="500px" /> 신호의 그림 5. 처리. (A) 어피 메트릭스 폴리 A는 스파이크의 증폭을 제어합니다. 폴리 A는 B에서 튐,의 Thr, 반페 및리스 성적을 제어 서브 틸리 유전자가 RNA 샘플에서 아군의 전반적인 성공을 평가하는 역할을하는<html> 타겟의 준비 단계. 강도는 더 바이어스가 높은 저 발현 유전자의 WT-박수 증폭 동안 없었다 보장하기 위해 이러한 스파이크의 컨트롤 사이의 값을 감소에서 검출되어야한다. (B) Affymetrix의 스파이크에 하이브리드 제어합니다. E.에서 고립이 목표 대장균 및 P1 박테리오파지는 라벨 절차 전에 아군됩니다. BioB, BioC, BIOD과 크레에서 증가 값은 하이브리드의 전반적인 성공을 나타냅니다. RMA 정상화 후 칩 신호 (C) 강도 분포. 하위 2 6 (배경)보다 값 probesets 전시 신호의 대부분은 주로 어떤 특정 HERV의 궤적에 제한 전체 식을 나타낸다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig5highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . ftp_upload/50713/50713fig6.jpg &quot;폭 =&quot;는 500px &quot;/&gt; 그림 6. 데이터 분석. 정상 및 종양의 샘플 (A) 계층 적 클러스터링 분석. 아래 정상 및 종양의 샘플들 (블루) 레귤레이션 - 파티션 클러스터링은 유클리드 거리 함수 알고리즘을 사용하여 (빨강)까지로 probesets 그룹핑 정규화 발현 값을 적용 하였다. 전립선 암의 후보 바이오 마커로 확인 상위 10 HERV 구조 (B) 선택. 각 HERV 요소에 대해, 관련 HERV 제품군은, 게놈 좌표 (NCBI 36/hg18)과 HERV 구조에 대한 간략한 설명이 제공됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig6highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig7.jpg" width="500px" /> 그림 7. </strong&gt; HERV의 레퍼토리. (A) 인간 게놈의 시퀀싱 25,000 단백질 코딩 유전자 (엑손, 2 %) 20 만 긴 터미널 반복 (LTR) retrotransposons (HERV, 8 %) 등의 transposable 요소의 엄청난 금액을 공개했다. HERV-V2 칩의 내용에서 (B) 외삽 및 관련 발현 데이터 (종양의 조직 유형에 비해 보통 8에서 발생하는 79 샘플)는 HERV 레퍼토리의 3 분의 1이 전사적으로 활성화하는 것이 좋습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig7highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig8.jpg" width="500px" /> 그림 8. 칩에서 신호의 기능 해석. (A) 발기인 식별하고 성적인 제어 : U3 부정적인 신호 (적색 프로브, 5&#39;LTR) R-U5 긍정적 인 신호 대 (파란색 프로브, 5&#39;LTR)는 다른 소비재 메틸화 (검은 색 원) 종양의 조직 대 peritumoral 정상에 U3의 내용에 의해 지원 U3 기반의 전사를, 제안한다. (B) 접합 전략 : mRNA의 종양에 독점적으로 표현 인코딩 추정 3.1 KB 봉투는 프로브를 중복 SD1/SA2 스플 라이스 접합을 사용하여 식별됩니다. * 기타 비 태반 조직과 비교하여 추론. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig8highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

인간 게놈의 8 %를 차지 인간 내인성 레트로 바이러스 (HERV)는, 부족한 코딩 능력 만 십만 긴 터미널 반복 (LTR에 의해 둘러싸) 유지. 사용자 지정 Affymetrix의 마이크로 어레이는 개별 HERV의 궤적 표현을 식별하도록 설계되었으며, 향후 임상 연구에 대한 개념의 증거로 전립선 암 조직에 사용되었다.

전립선 암의 바이오 마커 발견에 신청 : 개인 HERV 궤적 발현 마이크로 어레이 기반의 식별

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

인간 전립선암 조직에 대한 이 전사체 분석은 개별 인간 내인성 레트로바이러스 발현 위치를 식별하여 바이오마커 발견을 위한 스크리닝 도구로서 맞춤형 고밀도 마이크로어레이를 평가합니다. 외과의가 환자에게서 전립선 장기를 제거한 후, 병리학자는 실험실에서 종양 및 인접 정상 조직을 별도로 추출, 정제 및 MR을 검증합니다. 정상 및 종양 조직의 NA는 whole transcriptome ovation kit를 사용하여 mRNA를 증폭한 다음 생성된 증폭 산물을 절단하고 라벨링합니다. 다음 연속적으로 H-E-R-V-V 2 microarray를 교잡하고, 세척하고 검사해서 충전하십시오.궁극적으로 바이오컴퓨팅 방법을 사용하여 중요한 신호 및 차등 발현을 나타내는 프로브 세트를 추적하여 전사 활성 개별 유전자좌를 식별할 수 있습니다. 수년 전에 우리는 다발성 경화증 샘플을 포함하여 다양한 맥락에서 IRV W 패밀리의 행동을 탐구했습니다. 태반 고환.저는 패밀리 내에서 IRV 요소의 겹치거나 겹치지 않는 하위 그룹이 표현된다는 것을 이해하기 시작했을 때 처음으로 그 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 상황에 따라 다릅니다. 선박 기술을 사용하면 여러 가족을 조율하여 탐사하고 각 유전자 자리에 대한 다른 지역을 동시에 분석할 수 있습니다.예를 들어, LTR에 대한 US three 및 UF 도메인은 병리학에서 직접적인 역할을 지원할 수 있습니다. 이 방법은 PSA와 같은 기존 단백질 바이오마커가 특이성과 민감도가 부족한 전립선암 진단과 같은 암 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 한편, PCA 3과 같은 비암호화 RNA가 더 유망한 것으로 보이며, 전립선 처리 절차를 입증하는 것은 병리학과의 기술자인 michel을 판매할 것입니다.Philippe per는 RNA 추출 표적 준비 및 분석을 시연하고 John Unit 실험실의 기술자인 al은 선박 절차를 시연합니다. 저온 유지 장치에서 OCT의 작은 마운드에 동결 조직 과정을 수직으로 장착합니다. 단일 5 미크론 절편을 가져 와서 Blu udine으로 염색 한 다음 빠른 조직 학적 검사를 수행하여 종양 조직에 대한 조직의 특성을 검사합니다.tural cell의 수량을 추정하고 tumoral cell이 80% 이상인 코어만 선택합니다. 또 다른 5 미크론 단면을 자르고 헤마틴, 어인 및 사프란으로 염색하십시오. 이제 30미크론 두께의 절편 15개를 잘라 RNA가 없는 고아 튜브로 옮깁니다.그런 다음 종양 세포의 양을 조절하기 위해 헤마틴(hematin), 어인(eoin) 및 사프란(saffron)으로 염색하기 위해 마지막 5미크론 절편을 취합니다. 절차가 끝나면 드라이 아이스에 담긴 샘플을 분자 생물학 실험실로 트랜스 옮깁니다. 조직이 완전히 용해될 때까지 휴대용 그라인더를 사용하여 얼음 위의 Triol 용액에 있는 조직을 균질화합니다.샘플을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 300마이크로리터의 클로로포름을 넣고 15초 동안 와류를 넣습니다. 실온에서 2분 후 12, 000G에서 섭씨 2도에서 8도까지 15분 동안 원심분리기.RNA의 경우 상단 수성상을 새 튜브로 조심스럽게 옮깁니다. 750마이크로리터의 이소프로판올을 첨가하고 반전으로 혼합한 다음 실온에서 10분 동안 배양합니다. 침전된 RNA를 펠릿화하기 위해 샘플을 원심분리하고 RNA 펠릿을 80% 에탄올 1밀리리터로 세척합니다.그런 다음 섭씨 4도에서 10분 동안 7, 500G에서 샘플을 원심분리합니다. P 1000 및 P 10 팁을 사용하여 상층액을 제거합니다. 남은 에탄올을 자연 건조시킵니다.다음으로, 100마이크로리터의 RNA 자유수를 추가합니다. 샘플을 섭씨 70도의 열 블록으로 옮깁니다. 펠릿을 용해하려면 제조업체의 지침에 따라 바이오분석기와 NanoDrop을 사용하여 RNA의 품질과 RNA 무결성을 확인하십시오.이상적인 RNA 추출에서 RNA 무결성 수는 일반적으로 7 이상입니다. 공급자의 지침에 따라 전체 전사체 대환영, RNA 증폭 키트를 계속 진행합니다. 그런 다음 생성된 단일 가닥 CD NA 생성물을 정제합니다.제조업체의 지침에 따라 바이오분석기와 NanoDrop을 사용하여 단일 가닥 CDNA의 수율과 크기 분포를 확인합니다. 증폭된 CD NA의 크기 분포는 일반적으로 길이가 101, 500개 사이여야 하며 피크는 약 600개 염기여야 하며 전체 종 모양 분포를 가져야 합니다. CDNA를 단편화하기 위해 30마이크로리터 스핀에 2마이크로그램의 CD NA에 6.6마이크로리터의 단편화 혼합물을 추가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다.그런 다음 섭씨 95도에서 10분 동안 DNA를 비활성화하고 얼음 위에 보관합니다. 애질런트 기반 크기 분포 검증을 위해 1마이크로리터의 단편화된 CDNA를 분취합니다. DNA의 한 가지 처리는 혼성화 전에 CD NA 크기 분포를 약 100개의 뉴클레오티드로 균질화합니다.사전 습식 바이오분석기 Pfizer를 사용하여 단일 가닥 CD NA 크기 분포를 확인합니다. 200마이크로리터의 사전 혼성화를 가진 HERV 유전자 칩. 섞어서 섭씨 50도, 60RPM에서 10분 동안 배양합니다.131 마이크로 리터의 혼성화 믹스를 69 마이크로 리터의 단편화되고 표지 된 CD NA에 실온 혼합물 및 자연에서 섭씨 95 도에서 2 분 동안 첨가합니다. 그런 다음 섭씨 50도에서 5분 동안 배양하고 5분 동안 최대 속도로 원심분리합니다. 이제 사전 습윤된 HERV 유전자 칩을 비우고 200마이크로리터 표적 제제를 로드합니다.두 개의 SEPTA hybridize에 어려운 부분을 적용하고 섭씨 50도, 60RPM에서 18시간 동안 하이브리드화합니다. HERV 유전자 칩을 비우고 프로브를 채웁니다. 250마이크로리터의 세척 버퍼가 있는 어레이, 600마이크로리터의 SAPE 용액 혼합물 및 600마이크로리터의 항체 용액 혼합물을 1번과 2번 위치에 배치하고 800마이크로리터의 어레이 유지 버퍼를 위치에 배치합니다.셋째, 바늘을 아래로 누르십시오. 각 모듈에 올바른 칩을 할당합니다. FS 4 5 0 0 0 4 프로토콜을 선택하고 소프트웨어의 지시에 따라 각 모듈을 실행합니다.누출을 방지하기 위해 SEPTA에 거친 부분을 적용하십시오. 그런 다음 칩을 자동 로더에 로드하거나 스캐너에 직접 로드합니다. 스캔을 시작합니다.생성된 칩 도트 CEL 파일을 스캔한 후 이미지를 확인하고 그리드를 스폿에 정렬하여 프로브 셀을 식별합니다. 또한 칩에 여러 가지 품질 관리 측정을 실시합니다. 이제 칩을 정규화하고 계층적 클러스터링 접근 방식을 적용하여 데이터 세트를 탐색한 후 정규화 후 마이크로어레이 절차에서 차등적으로 발현된 유전자를 검색하기 위해 상당한 분석을 수행한 후 5개의 매치 페어 종양 및 정상 전립선 RNA 샘플에 대한 잘못된 발견 비율 보정을 수행했습니다.이를 통해 차등 발현 값을 가진 207개의 HERV 프로브 세트를 식별할 수 있었습니다. 다른 암 조직에서 채취한 35개의 추가 매치 페어 샘플에 대한 추가 분석을 통해 44개의 전립선 특이적 HERV 프로브 세트가 확인되었습니다. 다음은 가장 관련성이 높은 10가지 HERV 구조입니다.마지막으로, 기능 분석은 H-E-R-V-V 2 어레이에 존재하는 전용 특정 프로브와 함께 상단에 라벨링되고 기능적 레트로바이러스 영역인 LTR gag POLE N으로 라벨링된 상위 10개의 식별된 proviral 구조에서 선택된 하나의 H-E-R-V-W 요소로 설명된 주석이 달린 관심 시퀀스로 구성된 전용 인터페이스에서 수행할 수 있으며, 5개의 프라임 LTRU 3개 및 U 5개의 하위 도메인에 초점을 맞춥니다. RT PCR 검증을 위한 PCR 프라이머의 후속 설계. 이 동영상을 시청한 후에는 기존의 바이오 마커 발견뿐만 아니라 지구용 마이크로레이 사용에 성공하기 위한 품질 전제 조건인 샘플 및 표적 준비와 관련된 중요한 단계를 마스터하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 우리는 아메트리 형식의 고밀도 마이크로어레이를 설계했으며, 건조한 non-con area NA 전사 또는 조절 코딩 유전자 발현이 활성화될 수 있는지 여부를 더 잘 이해하기 위해 유전자좌 발현의 개인을 최적으로 특성화하는 것을 목표로 합니다.이 기술은 활성 발성의 체계적인 식별이 다양한 병리학의 유발 요인으로 유전적, 바이러스 및 환경적 가설을 통합할 수 있기 때문에 만성 및 전염병 분야의 연구자들에게 길을 열어줍니다. 기술 개념 증명 실험에서 제한된 수의 샘플로 작업하는 것은 바이오마커를 성공적으로 발견하고, 분석법의 견고성을 포함하여 통계적으로 검증된 워크플로우를 존중하고, 대상 환자 모집단의 대표 표본추출을 존중하는 등의 예방 조치를 취하는 것이 까다로울 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

인간의 전립선 암이 동 소성 모델에 폐 종양 세포와 구별 전이의 형성을 순환, 종양 크기의 정량을 허용한다. 세포가 일차 장기 탈출해야 같이, 혈류를 입력하고, 보조 사이트에 이식,이 모델은 인간에서 효과적으로 시나리오 되풀이되었습니다.

인간의 전립선 암 전이의 동소 쥐과 모델

에스트로겐과 마이크로 RNA 모두를 통해 신호 분자는 유방암의 발전과 성장에 중요하다. 에스트로겐은 전사 인자이다 에스트로겐 수용체를 활성화합니다. 많은 전사 인자는 마이크로 RNA의 발현을 조절할 수 있으며, 에스트로겐 조절 마이크로 RNA는 다른 대규모 기법을 사용하여 프로파일 링 할 수있다.

유방암 세포에서 에스트로겐 조절 마이크로 RNA의 프로파일

이 프로토콜은 바이오 마커 연구를위한 건설 및 조직 마이크로 어레이의 품질을 최적화하는 것을 목표로하고있다. 그것은 계획 및 디자인, 디지털 병리학, 가상 슬라이드 주석 및 자동화 된 조직으로 배열의 측면을 포함한다.

바이오 마커 연구 차세대 조직 마이크로 어레이 (ngTMA) 프로토콜

그대로 클래스 I HLA / 펩타이드 복합체는 암 관련 잠재적 바이오 마커를 나타내는 암세포 흘린된다. 모노클로 날 항체, 쉐드 MIF / HLA-A의 검출을 흉내 라벨없는 센서 기술 및 T 세포 수용체를 활용 * 02 : MDA-MB-231 세포 상청액 01 착물은, 인간 혈청 아군 및 환자 혈장의 개발을 가능하게 입증된다 새로운 암 진단 플랫폼입니다.

라벨이없는 바이오 센서 기술을 활용 유방암 인간 백혈구 항원 바이오 마커의 검출

여기에서는 정량적 실시간 PCR(RT-PCR) 및 ISH(in situ hybridization)를 사용하여 보관된 포르말린 고정, 파라핀 내장(FFPE) 또는 신선 냉동 전립선암(PCa) 임상 조직에서 microRNA(miRNA) 발현 분석을 위한 간소화된 프로토콜을 설명합니다.

전립선 암 임상 조직에서의 miRNA 식 분석

이 프로토콜의 목표는 다운스트림 RNA 분석을 위해 이질적인 전립선 조직에서 세포 유형의 순수한 집단을 분리하는 효과적인 방법으로 레이저 캡처 미세 해부를 사용하는 것입니다.

RNA 분석을위한 인간의 전립선 상피 세포의 레이저 캡처 이외에 Microdissection

Immunohistochemistry는 조직 내 단백질 국소화 및 발현을 평가하기 위한 강력한 실험실 기술입니다. 현재의 반자동 정량 분석 방법은 주관성을 도입하고 종종 재현성 없는 결과를 생성합니다. 여기에서는 다중 스펙트럼 이미징을 사용하여 multiplexed immunohistochemistry 및 단백질 발현 및 공동 국소화의 객관적인 정량화를 위한 방법을 설명합니다.

멀티 플렉스 면역 조직 화학적 염색 및 멀티 스펙트럼 영상을 사용하여 단백질 발현 및 공동 현지화의 정량

여기서, 우리는 공개적으로 접근 가능한 다양 한 데이터베이스 로부터 도출 된 풀링된 임상 데이터 세트의 종합적인 분석을 기반으로 유방암의 바이오 마커 및 생존 예측 인자를 탐구 하는 프로토콜을 제시 하 고, 발현, 상관관계 및 생존 분석 단계.

여러 공개적으로 접근 가능한 데이터베이스를 사용 하 여 유방암에서 바이오 마커의 데이터 마이닝 및 통합 분석 수행

이 프로토콜은 단일 실험 내에서 35kb만큼 큰 고유한 miRNA 클러스터 부재 결실 조합을 운반하는 유전자 변형 세포주 패널의 신속한 생성을 가능하게 하는 마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 고처리량 클러스터 규칙적인 간격 간 짧은 팰린드로믹 반복(CRISPR) 유전자 편집 워크플로우를 기술합니다.

마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 CRISPR 유전자 편집 도구

우리는 조류 배아 모델 동적, 실시간 intravital 이미지를 사용하여 인간의 xenografted 종양의 vasculature에 nanoparticle의 국제화를 수치 소설 접근법을 제시한다.

Intravital 이미징을 사용하여 실시간으로 종양의 Nanoparticle의 이해 평가

배우세요 전립선암 조직에서 HERV 발현 좌위를 식별하는 맞춤형 마이크로어레이 기법을 활용한 바이오마커 발굴 방법을. 이 기술은 암 진단을 위한 새로운 바이오마커 개발에 기여합니다.

전립선 암의 바이오 마커 발견에 신청 : 개인 HERV 궤적 발현 마이크로 어레이 기반의 식별

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