바이오 마커 연구 차세대 조직 마이크로 어레이 (ngTMA) 프로토콜

다음 절차의 목적은 바이오마커 연구에서 후속 사용을 위해 최적 또는 표적 조직 마이크로어레이를 구성하는 것입니다. 먼저, 대표적인 조직 슬라이드에서 디지털 슬라이드 아카이브를 생성합니다. 관심 분야는 디지털 슬라이드에 주석이 달려 있어 조직 마이크로레이 블록으로 전달될 해당 공여체 블록의 정확한 영역을 지정합니다.

조직 마이크로어레이 설계 및 레이아웃이 생성되면 기증자 블록이 자동으로 펀칭되고 원인이 조직 마이크로어레이에 로드됩니다. 이 정밀하고 빠르며 자동화된 차세대 접근법을 사용하면 정확한 조직학적 영역 또는 특정 그룹의 세포를 정확하게 캡처하여 조직 마이크로어레이로 전송할 수 있습니다. 집에서 만든 또는 반자동 장치를 사용하는 것과 같은 기존 조직 마이크로 링 방법에 비해 우리 기술의 주요 장점은 분명히 조직학적 정확성입니다.

이는 디지털 병리학의 강점과 조직학적 전문 지식을 결합함으로써 달성되며, 오늘날 그 절차를 시연하는 자동화된 조직 마이크로 링은 Kalin Hamman과 Jose Galvan입니다. 우리 실험실의 두 가지 기술 지원스캔 소프트웨어를 사용합니다. 먼저 명시야 스캔을 위한 자동 모드를 선택합니다.

그런 다음 스캔 옵션을 클릭하여 슬라이드 품질 매개변수를 조정합니다. 이제 슬라이드 스캔을 로컬에 저장하거나 서버 매개 변수를 클릭하여 웹에 저장하도록 선택하고 스캔 대상을 케이스 센터로 설정하십시오. 이제 슬라이드를 매거진에 로드하기 전에 슬라이드를 준비하십시오 스캐너의 경우 슬라이드가 깨끗한지 확인하십시오.

필요한 경우 에탄올을 사용하면 각 매거진에 최대 25개의 슬라이드를 로드할 수 있으며 스캐너에는 최대 10개의 매거진을 로드할 수 있습니다. 여러 개의 탄창이 장전될 때 쌓여 있습니다. 슬라이드가 로드되면 모든 슬라이드, 파일 이름을 지정하고 케이스 중앙에 저장 폴더를 설정합니다.

이제 녹색 화살표를 클릭하여 슬라이드 스캔을 시작합니다. 이 섹션에서는 슬라이드에서 조직 샘플이 펀칭되는 위치가 디지털 슬라이드에 대한 주석으로 설정됩니다. 디지털 슬라이드 폴더를 열어 시작합니다.

보기 소프트웨어에서 폴더 자체를 변경할 수 있습니다. 메모를 추가하고, 슬라이드를 재정렬하고, 첨부 파일로 사용자 권한을 설정할 수 있습니다. 이제 슬라이드를 클릭하여 슬라이드에 주석을 달기 시작합니다.

뷰어에 나타납니다. 뷰어에서. 확대 도구를 사용하여 슬라이드를 평가하고 차세대 TMA에 통합할 관심 영역을 찾습니다.

TMA 주석 도구를 사용하여 원하는 코어의 크기와 주석의 색상을 선택합니다. 슬라이드를 클릭하여 이 주석을 슬라이드에 첨부합니다. 그런 다음 주석을 원하는 조직학적 구조로 이동합니다.

이러한 주석은 해당 조직 블록의 펀치 위치를 표시합니다. 모든 슬라이드에 주석이 추가될 때까지 이 과정을 반복합니다. 조직 원인에 대한 대안적인 옵션은 분자 분석을 위해 0.2 밀리리터 PCR 튜브로 보내는 것입니다.

다른 색상 표시를 사용하여 슬라이드에 주석을 달아 이러한 지점을 TMA인 지점과 구별합니다. 모든 주석이 만들어지면 해당 주석과 주석 색상이 있는 모든 슬라이드 목록이 포함된 스프레드시트 파일을 저장합니다. 이제부터 주석이 달린 모든 디지털 슬라이드에 대해 해당 파라핀 조직 블록을 검색하여 조직 미세 재구성을 시작합니다.

기부자 블록이라고 합니다. 디지털 슬라이드와 동일한 순서로 블록을 정렬합니다. 각 블록의 두께가 4mm 이상인지 확인합니다.

그렇지 않다면, 그 조직은 컴퓨터에서 재발명되어야 할 것이다. 소프트웨어의 조직 마이크로어레이를 열고 프로젝트 이름을 입력합니다. 공구 교환으로 이동하여 필요한 공구 직경을 선택하십시오.

이제 최대 12개의 수신자 블록을 기계에 로드합니다. 블록 이름을 기록해 둡니다. 일관성을 위해 모두 동일한 번호 매기기 시스템을 사용하여 레이블을 지정해야 합니다.

그런 다음 소프트웨어에서 각 블록에 적절한 이름을 할당하여 TMA 레이아웃을 생성합니다. 먼저 펀치의 행, 열, 빈 선 및 간격을 할당하여 새로운 TMA 디자인을 만듭니다. 배치를 저장하고 블록에 지정합니다.

그런 다음 다음 블록에 대해 이 과정을 반복합니다. 새 레이아웃 또는 동일한 레이아웃을 사용하면 수신자 블록 간에 코어 크기를 변경할 수 있습니다. 그런 다음 최대 60개의 도너 블록을 기계에 로드합니다.

각 행에는 최대 10개의 블록이 들어갈 수 있습니다. A부터 F.까지의 나머지 도너 블록은 나중에 소프트웨어에서 로드됩니다. 각 기부자 블록에 식별 가능한 이름을 지정합니다.

각 블록의 이미지가 자동으로 획득됩니다. 이제 디지털 슬라이드를 해당 기부자 블록에 맞춥니다. 먼저 블록을 선택합니다.

그런 다음 슬라이드를 클릭하고 슬라이드와 블록 이미지를 나란히 비교합니다. 도너 블록 이미지에서 해당 디지털 슬라이드의 특정 점에 해당하는 참조점을 선택합니다. 그런 다음 다음을 클릭하면 주석이 기부자 블록의 이미지로 이동합니다.

주석이 올바르면 각 주석을 클릭하여 위치를 확인합니다. 그런 다음 시작을 클릭합니다. 이렇게 하면 마이크로어레이가 수신자 블록의 기준점에 구멍을 뚫은 다음 동일한 위치에 있는 도너 블록에서 구멍을 뚫고 코어를 수신자 블록으로 전송하도록 유도합니다.

A PCR 튜브에 코어를 수집하려면 블록에 대한 PCR 도구를 클릭합니다. 튜브에 조직을 공급하기 위해 최대 4개의 주석을 사용할 수 있습니다. 설정이 완료되면 시작을 클릭하면 기증자가 호출되고 튜브가 로드됩니다.

기계가 드릴링하고 펀치를 날린 후, 코어, 도너 블록의 이미지를 업데이트합니다. 다음 블록에 대한 정렬 및 주석 추가를 반복합니다. 그런 다음 코어를 사용하십시오.

모든 기부자 블록에 대해 이 작업을 계속하십시오. 그것은 TMA에 있을 것입니다. 60개의 도너 블록의 첫 번째 세트가 완료되면 이를 언로드하고 60개의 블록을 더 로드합니다.

모든 도너 블록이 배열될 때까지 프로세스를 계속합니다. 약 500개의 코어를 취한 후 드릴을 청소하면 펀칭 도구가 xle이 됩니다. 배열이 완료되면 프로젝트를 내보냅니다.

프로젝트 데이터가 포함된 스프레드시트 파일은 내보내기 폴더에 있습니다. 각 TMA 블록 내에서 각 샘플의 위치를 보여줍니다. 그런 다음 겹쳐진 주석이 있는 도너 블록 이미지를 JPEG 파일로 내보내기 폴더에 저장합니다.

이것으로 TMA 블록을 생성하는 프로세스가 완료됩니다. 이 TMA 레이아웃은 어레이를 채우기 위해 12개의 최종 블록에 대해 2개의 복사본으로 구성된 6개의 NG TMA 블록을 보여줍니다. 각 종양 블록에는 402개의 조직 반점이 있었고 각 정상 조직 블록에는 268개의 반점이 있었습니다.

60개의 기증자 블록에 주석을 단 후 원인을 펀칭했습니다. 코어 전송 시간은 약 12초였습니다. 코어 손실은 최소화되었으며 어레이의 총 시간인 이 프로젝트는 총 약 24시간이었습니다.

여기에는 N-G-T-M-A 공정 후 후속 분자 분석을 위한 원인을 펀칭하는 데 걸린 시간이 포함되었습니다. 세포 혼성화의 면역조직화학(immunohistochemistry) 및 특수 염색과 같은 다른 방법은 다른 조직에서 어떤 유전자 또는 단백질이 발현되거나 심지어 변경되는지와 같은 몇 가지 질문에 답하기 위해 이러한 조직 마이크로어레이에 적용할 수 있습니다.