멀티 깊이 원형 단면 Endothelialized 마이크로 채널 - 온 - 칩의 개발을위한 절차

이 절차의 전반적인 목표는 생체 내, 미세혈관의 3D 형상을 모방하고 제어된 연속적인 풍요 흐름에서 실행되는 칩에 다중 깊이 원형 단면 내피 생활 마이크로 채널을 개발하는 것입니다. 이것은 포지티브 리플로우 가능한 포토 레지스트를 사용하여 반원형 단면 마이크로 채널 네트워크를 갖는 마스터 몰드를 첫 번째 포토 리소그래피로 제작함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 마스터 몰드를 사용하여 두 개의 폴리 디메틸 soane 마이크로 채널을 복제하고 정렬하고 결합하여 원통형 마이크로 채널 네트워크를 만드는 것입니다.

다음으로, 1차 인간 제대 정맥 내피 세포는 4일에서 2주 사이의 기간 동안 통제된 연속 매체 관류 조건에서 세포를 배양하기 전에 미세채널 네트워크 내부에 위치합니다. 궁극적으로, 현미경 아래에 서 있는 멤브레인 및 핵에 의해 표시되는 합류 세포 단층은 마이크로 채널 네트워크의 내부 표면을 따라 개발되며, 복잡한 혈관 현상 연구를 위한 플랫폼을 제공할 수 있는 기능적 마이크로 혈관 계산. 그러나 anso 세포 이동 분석법, 2 형성 분석법, 우측 및 모스 틱 링 분석법과 같은 기존의 개별 마이크로 용기 분석은 3차원 기하학 및 연속 흐름 제어와 관련하여 개별 마이크로 용기를 재현하는 데 한계가 있습니다.

우리 기술의 주요 장점인 기존 미세 가공 방법은 둥근 단면을 가진 생체 내 마이크로 혈관의 복잡한 3D 형상을 모방하는 다중 깊이 미세유체 채널 네트워크를 전통적으로 제작할 수 있다는 것입니다. 또한 미세혈관 생체 자기 시스템을 설계할 수 있으며, 이는 대략 더 느리게 복종하고 유체 흐름을 필요한 수준으로 유지하여 전체 채널 저항이 낮고 우리가 잃어버린 흐름이 네트워크 전체에서 더 균일하여 절차가 제 연구실의 대학원생이 될 것임을 보여줍니다. 이 절차는 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 직경이 30미크론에서 60미크론 사이인 마이크로 채널로 구성된 포토레지스트 마스터 몰드를 제작하는 것으로 시작되며, 사용 24시간 전에 섭씨 4도의 냉장고에서 클린룸으로 리플로우 포토 레지스트를 간단히 옮기고 실온으로 예열합니다.

텍스트 프로토콜의 절차에 따라 포지티브 리플로우 포토 레지스트 층을 사전 세척 실리콘 기판에 스핀 코팅하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 패터닝된 마이크로 채널을 개발하기 전에 패턴화된 마스크를 통해 포토레지스트를 UV 광선에 노출시킵니다. 마지막으로, 리플로우 후 반원형 단면 마이크로채널 네트워크를 생성합니다.

마스터 몰드가 준비되면 폴리메틸 소안 또는 PDMS 용액을 경화제와 10:1 염기의 중량비로 준비하고 행성 원심 믹서를 사용하여 철저히 혼합합니다. PDMS 용액을 리플로우된 포토레지스트 마스터 몰드에 캐스팅합니다. 캐스팅된 PDMS를 15분 동안 건조제에 넣어 Degas에 넣습니다.

필요한 경우 질소 가스를 사용하여 남아 있는 기포를 제거합니다. PDMS를 섭씨 60도의 오븐에서 3시간 동안 굽고 경화시킵니다. 그런 다음 마스터 몰드에서 경화된 PDMS 층을 제거합니다.

날카로운 펀처를 사용하여 채널 네트워크에 구멍을 뚫어 입구 및 출구 구멍을 만듭니다. 질소 가스를 사용하여 PDMS의 표면을 청소합니다. 45milato의 작동 압력과 분당 3.5입방피트의 산소 유속으로 플라즈마 클리너 내부에서 30초 동안 산소 플라즈마로 두 개의 PDMS 층을 처리합니다.

그런 다음 광학 현미경 아래에서 PDMS의 표면을 수동으로 정렬합니다. 정렬을 더 잘 제어하기 위해 필요한 경우 물 한 방울을 사용하십시오. 마지막으로 섭씨 60도의 오븐에서 30분 동안 장치를 굽면 영구적인 접착 배양을 얻을 수 있습니다.

10% 소 태아 혈청이 보충된 L-글루타민이 함유된 배양 배지의 1차 인간 배꼽 정맥 내피 세포 또는 VE. 작동 압력이 45milit이고 산소 유속이 분당 3.5입방피트인 산소 플라즈마로 5분 동안 장치를 처리합니다. 그런 다음 장치에 탈이온수를 로드하고 살균을 위해 층류 생물 안전 후드에서 8시간 동안 자외선으로 처리합니다.

세포가 준비되기 하루 전에 1 x 인산염 완충 식염수 또는 PBS로 장치를 세척한 다음 피브로넥틴으로 코팅합니다. 섭씨 4도의 냉장고에서 하룻밤 동안 배양합니다. 세포가 합류하면 먼저 완충 식염수로 세포를 헹구고 트립신을 첨가한 후 트립신 EDTA로 세포를 처리하여 세포를 수확합니다.

섭씨 37도에서 2-6분 동안 세포를 배양합니다. 트립신 후 화가 완료되면 트립신 중화 용액으로 트립신 EDTA를 중화합니다. 세포를 세고 소생시키기 전에 원심분리하십시오.

8% 덱스트린이 함유된 배양 배지에 현탁하면 매체 점도를 증가시켜 FI enc ENC 코팅 후 더 나은 세포 착석 및 부착을 돕습니다. 하나의 XPBS로 장치를 세척한 다음 섭씨 37도의 온도에서 15분 동안 배양하기 전에 장치에 배양 배지를 로드합니다. 밀리리터당 3-400만 개의 세포 농도로 8% 덱스트린 배양 배지의 다음 세포가 장치에 로드됩니다.

장치의 한쪽 입구에 20마이크로리터의 세포 방울을 놓고 기울여 세포를 미세유체 채널로 도입합니다. 15분에서 20분 후에 세포가 채널의 측벽에 부착되기 시작합니다. 15분마다 장치를 회전하여 셀을 보다 균일하게 분포시킵니다.

필요한 경우 추가 로드를 수행할 수 있습니다. 5-6시간의 정적 배양 후 부착된 세포가 완전히 퍼지기 시작합니다. 시간당 10마이크로리터의 일정한 유량을 가진 원격 제어 주사기 펌프 시스템을 사용하여 장기 관류를 설정하고, 더 높은 유속으로 관류를 조정할 수 있으며 4일에서 2주 사이의 기간 동안 지속될 수 있습니다.

세포가 장치 내부의 합류점에 도달하면 먼저 하나의 XPBS로 장치를 세척하여 매체를 철저히 제거합니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 어두운 곳에서 장치를 배양한 후 희석된 빨간색 염료를 장치에 로드합니다. 얼룩을 막기 위해 배양 배지로 씻으십시오.

염료를 장기간 배양하면 세포 독성이 발생하고 접착력이 저하될 수 있습니다. 그런 다음 하나의 XPBS로 희석한 파란색 염료를 장치에 로드하고 실온에서 5분 동안 어두운 곳에서 배양한 후 하나의 XPBS로 장치를 철저히 세척합니다. 도립 광학 현미경으로 세포 염색을 검사합니다.

얼룩이 양호하면 마이크로 채널에 고정 매체를 넣은 다음 장치를 고정 매체에 담그고 알루미늄 호일로 완전히 덮으십시오. 장치가 마르고 표백되는 것을 방지하기 위해 장치를 섭씨 4도의 온도로 냉장고에 보관하십시오.고정 장치는 이제 레이저 스캐닝 공초점 현미경, 주사 전자 현미경 및 광학 현미경으로 수행할 수 있는 컨포칼 이미징 준비가 되었습니다. 리플로우 진행(reflow progress) 전후에 리플로우 포토레지스트(reflow photoresist)와 복제된 PDMS 채널을 특성화하는 데 사용되었다.

PDMS 마이크로채널 네트워크의 기하학적 특징을 특성화하여 여기에 표시했습니다. PDMS 금형의 원형 단면은 각 분기 레벨에서 채널 치수를 보여줍니다. 결과는 포토레지스트 리플로우 기법이 포토레지스트 리플로우 기법에 의해 보다 편리한 접근 방식으로 다중 깊이 분기 채널 네트워크를 생성할 수 있으며 여기에 표시된 Murray의 법칙을 대략적으로 준수하는 미세 혈관 생체 모방 시스템의 설계를 가능하게 한다는 것을 보여줍니다.

원형 단면도는 VE가 서로 다른 분기 영역에서 원통형 마이크로 채널 네트워크의 내부 표면을 정렬하는 것을 보여주었습니다. in vivo micro vasculature의 복잡한 형상으로 인해 이러한 작은 혈관의 실시간 모니터링은 어렵습니다. 개발된 P DM S 기반 칩은 우수한 광학 특성을 제공하고 원형 채널 네트워크를 따라 세포 내막의 이 컨포칼 동영상에서 볼 수 있듯이 내피 마이크로 채널의 고품질 및 실시간 이미징을 가능하게 합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 이 매스 모드에 대한 리플로우를 제작하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 원형 단면 PDMS 마이크로 채널 네트워크를 생성하고, 엔도 세포 세포를 장치에 로드하고, 장기 배지 풍부를 설정합니다. 요약하면, 개발된 엔도 직렬화 마이크로채널 온 칩은 InVivo 마이크로 혈관의 기하학적 구조를 모방한 원형 단면 다중 깊이 마이크로채널 네트워크를 생성하기 위한 빠르고 재현 가능한 접근 방식을 제공합니다.

이 절차는 첨단 마이크로 제조 및 마이크로 식품 기술에서 고유한 기능을 사용하여 장기적이고 지속적인 관류 제어를 갖춘 미세혈관 모델을 생성할 뿐만 아니라 세포 생물학, 조직 공학 및 생명 공학 응용 분야에서 마이크로 식품 채널의 활용도가 증가함에 따라 고품질 및 실시간 이미징 기능을 생성하는 방법을 보여줍니다. 칩의 엔도 직렬화된 마이크로 채널은 미세혈관 연구를 위한 잠재적인 에세이입니다.