멀티 깊이 원형 단면 Endothelialized 마이크로 채널 - 온 - 칩의 개발을위한 절차

본 절차의 전반적인 목표는 생체 내 미세혈관의 3D 기하학적 구조를 모방하며 제어된 연속 관류 흐름 하에 작동하는, 다중 깊이의 원형 단면 내피 세포 미세 채널 칩을 개발하는 것입니다. 이는 먼저 양성 리플로우 가능 포토레지스트를 사용하여 반원형 단면의 미세 채널 네트워크가 형성된 마스터 몰드를 포토리소그래피 공정으로 제작함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 이 마스터 몰드를 사용하여 두 개의 폴리디메틸실록산 미세 채널을 복제하고, 이를 정렬 및 접합하여 원통형 미세 채널 네트워크를 생성하는 것입니다.

다음으로, 1차 인간 제대정맥 내피세포를 마이크로채널 네트워크 내에 배치한 후, 4일에서 2주 사이의 기간 동안 제어된 연속 배지 관류 조건 하에서 세포를 배양합니다. 최종적으로, 현미경 상에서 막과 핵이 관찰되는 세포 단층의 합류가 마이크로채널 네트워크의 내면을 따라 형성되어, 복잡한 혈관 현상 연구를 위한 플랫폼이 될 수 있는 기능적 미세혈관의 계산이 가능해집니다. 하지만 세포 이동 분석, 관 형성 분석, 링 분석과 같은 기존의 개별 미세혈관 분석법들은 3차원적 기하학적 구조와 연속적인 흐름 제어 측면에서 개별 미세혈관을 재현하는 데 한계가 있습니다.

당사의 기존 미세가공법과 같은 기술의 주요 장점은 단면이 둥근 생체 내 미세 혈관의 복잡한 3D 기하학적 구조를 모방한 다층 깊이의 미세 유체 채널 네트워크를 관례적으로 제작할 수 있다는 점입니다. 또한, 이는 유체 흐름을 필요한 수준으로 유지하여 전반적인 채널 저항을 낮추고 네트워크 전체에 걸쳐 유량이 더 균일하게 흐르도록 하여 더욱 느린 속도에 근접한 미세혈관 생체자기 시스템을 설계할 수 있게 합니다. 본 절차는 제 연구실의 대학원생이 시연합니다. 이 과정은 텍스트 프로토콜에 상세히 기술된 대로 직경 30 µm에서 60 µm 사이의 미세 채널로 구성된 포토레지스트 마스터 몰드 제작부터 시작됩니다. 간단히 설명하자면, 사용 24시간 전에 4 °C 냉장고에서 리플로우 포토레지스트를 클린룸으로 옮겨 실온에서 가온해 둡니다.

텍스트 프로토콜의 절차에 따라 사전 세척된 실리콘 기판 위에 포지티브 리플로우 포토레지스트 층을 스핀 코팅하는 것으로 시작하십시오. 그런 다음 패턴 마스크를 통해 포토레지스트를 UV 광선에 노출시킨 후 패턴화된 마이크로 채널을 현상하십시오. 마지막으로, 리플로우 공정을 거쳐 반원형 단면의 마이크로채널 네트워크를 생성합니다.

마스터 몰드가 준비되면, 베이스와 경화제의 중량비를 10:1로 하여 폴리메틸실록산 또는 PDMS 용액을 준비하고, planetary centrifugal mixer를 사용하여 충분히 혼합합니다. 리플로우 처리된 포토레지스트 마스터 몰드 위에 PDMS 용액을 캐스팅합니다. 캐스팅된 PDMS를 데시케이터에 넣고 15분 동안 가스를 제거합니다.

필요한 경우 질소 가스를 사용하여 남아 있는 기포를 제거하십시오. PDMS를 60 °C 온도의 오븐에서 3시간 동안 가열하여 경화시킵니다. 그 후 경화된 PDMS 층을 마스터 몰드에서 제거하십시오.

날카로운 펀치를 사용하여 채널 네트워크에 구멍을 뚫어 입구와 출구 구멍을 만듭니다. 질소 가스를 사용하여 PDMS 표면을 세척합니다. 작동 압력 45 milato, 산소 유량 3.5 cubic feet per minute 조건의 플라스마 세척기 내부에서 두 개의 PDMS 층을 30초 동안 산소 플라스마 처리합니다.

그 다음, 광학 현미경 하에서 PDMS의 표면을 수동으로 정렬합니다. 정렬을 더 정밀하게 조절해야 하는 경우 필요에 따라 물 한 방울을 사용하십시오. 마지막으로, 영구적인 결합 배양을 위해 장치를 오븐에서 60 °C로 30분 동안 가열합니다.

10% 태아 송아지 혈청과 L-glutamine이 첨가된 배양액에서 primary human umbilical vein endothelial cells(VE)를 준비합니다. 작동 압력 45 mTorr, 산소 유량 분당 3.5 cubic feet 조건으로 5분 동안 산소 플라스마 처리를 통해 장치를 처리합니다. 그 후, 장치에 탈이온수를 채우고 층류 생물안전 작업대 내에서 8시간 동안 UV 광선으로 멸균 처리합니다.

세포 준비 하루 전, 장치를 1x 인산 완충 식염수(PBS)로 세척한 다음 피브로넥틴(fibronectin)으로 코팅합니다. 4°C 냉장고에서 하룻밤 동안 배양합니다. 세포가 합성(confluent)되면, 먼저 세포를 HEPES 완충 식염수로 헹구고, 트립신을 첨가한 뒤 트립신 EDTA로 처리하여 세포를 수확합니다.

세포를 37 °C에서 2~6분 동안 배양합니다. 트립신화가 완료되면, 트립신 중화 용액을 사용하여 트립신 EDTA를 중화합니다. 세포 수를 측정하고, 재현탁 전 원심 분리를 수행합니다.

8% 덱스트린(dextrin)이 포함된 배양 배지에 부유시키는 것은 배지의 점도를 높여 FI ENC 코팅 후 세포가 더 잘 안착되고 부착되도록 돕기 위함입니다. 장치를 1×PBS로 세척한 다음, 배양 배지를 채우고 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 그다음, 8% 덱스트린 배양 배지 내에 3~4 million cells/mL 농도로 부유된 세포를 장치에 주입합니다.

장치의 한쪽 입구에 20 µL의 세포 액적을 떨어뜨리고, 장치를 기울여 세포를 미세유체 채널 내부로 도입합니다. 15분에서 20분 후, 세포가 채널의 측벽에 부착되기 시작합니다. 세포가 더 균일하게 분포될 수 있도록 15분마다 장치를 회전시킵니다.

필요한 경우, 추가 로딩을 수행할 수 있습니다. 5~6시간 동안 정적 배양을 거치면 부착된 세포들이 완전히 퍼지기 시작합니다. 원격 제어 시린지 펌프 시스템을 사용하여 시간당 10 microliters의 일정 유량으로 장기 관류를 설정하십시오. 관류는 더 높은 유량으로 조정할 수 있으며, 4일에서 2주 사이의 기간 동안 유지될 수 있습니다.

장치 내부의 세포가 합류(confluence) 상태에 도달하면, 먼저 XPBS 1회로 장치를 세척하여 배지를 완전히 제거합니다. 그 다음, 장치를 실온의 암소에서 5분 동안 배양한 후 희석된 적색 염료를 주입합니다. 배양 배지로 세척하여 염색을 중단시킵니다.

염료를 장시간 배양하면 세포 독성이 발생하고 부착이 해제될 수 있습니다. 그런 다음 1X PBS로 희석한 청색 염료를 장치에 주입하고, 실온의 암소에서 5분 동안 배양한 후 1X PBS로 장치를 충분히 세척하십시오. 도립 광학 현미경을 통해 세포 염색 상태를 관찰하십시오.

염색 상태가 양호하면 마이크로채널에 고정액을 채운 다음, 장치를 고정액에 담그고 알루미늄 호일로 완전히 덮습니다. 장치가 건조해지는 것을 방지하기 위해 4 °C 온도의 냉장고에 보관하십시오. 고정된 장치는 이제 공초점 이미징을 할 준비가 되었으며, 이는 레이저 스캐닝 공초점 현미경, 주사 전자 현미경 및 광학 현미경을 통해 수행할 수 있습니다. 이는 리플로우 진행 전후의 리플로우 포토레지스트와 복제된 PDMS 채널의 특성을 분석하는 데 사용되었습니다.

PDMS 미세채널 네트워크의 기하학적 특징을 분석하여 여기에서 제시하였습니다. PDMS 몰드의 원형 단면은 각 분지 단계에서의 채널 치수를 보여줍니다. 결과에 따르면, 포토레지스트 리플로우(photoresist reflow) 기술을 통해 다중 깊이 분지 채널 네트워크를 보다 편리하게 제작할 수 있으며, 여기 제시된 머레이의 법칙(Murray's law)을 대략적으로 따르는 미세혈관 생체모방 시스템을 설계할 수 있음을 보여줍니다. 여기의 현미경 이미지는 적색의 형광 세포막 염색약과 청색의 세포핵 염색약을 사용하였습니다.

원형 단면도를 통해 VE가 서로 다른 분지 영역의 원통형 마이크로채널 네트워크 내면을 따라 배열되어 있음을 확인하였습니다. 생체 내 미세 혈관의 복잡한 기하학적 구조로 인해 이러한 미세 혈관을 실시간으로 모니터링하는 것은 어렵습니다. 개발된 PDMS 기반 칩은 우수한 광학적 특성을 제공하며, 원형 채널 네트워크를 따라 배열된 세포들의 공초점 영상에서 보는 바와 같이 내피 마이크로채널의 고품질 실시간 이미징을 가능하게 합니다.

이 영상을 시청한 후에는, 질량 모드(mass mode)를 위한 리플로우 제작 방법, 원형 단면의 PDMS 미세 채널 네트워크 구축, 장치 내 혈관 내피 세포(endo cell) 로딩 및 장기 배지 관류 설정 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 요약하자면, 개발된 칩 상의 직렬화된 내피 미세 채널은 체내 미세 혈관의 기하학적 구조를 모사하는 원형 단면의 다층 미세 채널 네트워크를 신속하고 재현성 있게 구축할 수 있는 방법을 제공합니다.

본 절차는 정밀 마이크로 제조 및 마이크로 유체 기술의 독특한 기능을 활용하여 장기적인 연속 관류 제어가 가능한 미세혈관 모델을 제작하는 방법을 보여주며, 세포 생물학, 조직 공학 및 바이오 공학 응용 분야에서 마이크로 유체 채널의 활용도가 높아짐에 따라 고품질의 실시간 이미징 역량을 제공합니다. 칩 상의 내피 세포 직렬화 미세 채널은 미세혈관 연구를 위한 잠재적인 분석 모델입니다.