Name: 성인 쥐의 뇌의 기존 및 비 인습적 인 지역에서 신경 줄기 세포 성장 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-18T20:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 배우세요 성인 설치류 뇌에서 신경줄기세포 배양법을 통해 신경과학 및 재생의학 연구에 활용하는 방법입니다. 이 기술은 내인성 신경줄기세포의 위치 파악과 조작에 필수적인 통찰을 제공합니다.

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헬름홀츠 협회의 이니셔티브 및 네트워크 기금, 그 밖의 Kroener-는 Fresenius 재단에서 부여하고, 도이치 Forschungsgemeinschaft에서 부여를 통해 이미징 및 치료 환경 대사 질환, (-이 작품은 헬름홀츠 얼라이언스 ICEMED으로 (부분적으로) 투자되었다 SFB 655 : 조직에 세포).

이 작품은 Helsinski의 선언과 ARVO 동물 정책을 준수합니다. 드레스덴 대학의 동물 시설의 지침에 따라 동물 조직 수집에 사용 된 모든 관련 방법은 미행했다. 동물은 취급 및 보관 실험 동물의 사용 및 관리에 대한 독일 연방 지침에 따라, 그리고 연구는 Landesdirektion 드레스덴에 의해 승인되었습니다했다. 적절한 안락사 방법에 대한 교육 기관의 동물 정책 (IACUC 또는 다른 보드)에 문의하십시오. 특정 주식 및 시약의 작업 농도는이 프로토콜에 수반되는 시약 테이블에서 찾을 수 있습니다. 1. 배양 접시 준비 <ol><li> 75 μg의 충분한 볼륨 코트 요리 / ㎖ 폴리-L-오르니 틴 (즉, 2 ㎖ / 잘 6 잘 플레이트의) 하룻밤 2 일전 예약 해부 현재까지 세포 배양 인큐베이터에서. </li><li&gt; 기음 폴리-L-오르니 틴 다음날 5 분 동안 PBS 3 ㎖와 잘 배 각각 세척. </li><li> 최종 세척을 제거한 다음 판에 피브로넥틴 (희석 1:250, PBS에 4 ㎍ / ml)에 추가하고 하룻밤 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. </li><li> 해부의 날에 피브로넥틴을 기음과 요리를 PBS로 2 배 씻는다. 여전히 해리 조직 배양을위한 준비가 될 때까지 최종 PBS가 인큐베이터에 씻어 포함 된 번호판을 반환합니다. 이 때, 조직을 도금하는 PBS 사전을 제거합니다. </li><li> 최대 3 주 동안 인큐베이터를 폴리-L은-ornithinein 코팅 스토어 플레이트. 피브로넥틴으로 코팅 된 플레이트는 최대 1 주 동안 저장 될 수있다. 긴급한 경우 피브로넥틴 코팅은 거의 같은 2 시간에서 수행 될 수있다. 피브로넥틴은 변성에 취약하며 솔루션을 선동하거나 요리를 건조하게하지 않는다. </li></ol> 2. 해부 / 도금 <ol><li> 이 프로토콜은 3 성인 쥐 (연령 3 ~ 6 개월)의 사용에 적용됩니다. </li><li> CHIL내가 전에 쥐를 안락사에 얼음 블록을 구획 뇌. </li><li> 얼음에 추가의 bFGF와 N2 매체의 5 ML을 포함하는 15 ML 팔콘 튜브를 놓습니다. </li><li> 교육 기관의 수의 정책에 따라 쥐를 안락사. </li><li> 머리의 중간 선 아래로 절개하여 두개골에서 뇌를 제거합니다. 신중하게 추출 할 수있는 두뇌를 허용 뼈를 벗겨 집게를 사용합니다. </li><li> 얼음 차가운 PBS를 포함하는 10cm 페트리 접시에 두뇌를 놓습니다. 이것은 남아있는 머리카락과 혈액을 제거합니다. (그림 1A) </li><li> 냉장 단면 블록에 두뇌를 놓습니다. (그림 1B) </li><li> 그림 1C에서 그림과 같이 블록에 하나의 새로운 깨끗한 면도날을 삽입합니다. </li><li> 그림 1D에 도시 된 바와 같이 처음에 두 번째 깨끗한 면도날 3mm의 꼬리를 삽입합니다. </li><li> 조심스럽게 그들과 함께 관심있는 부분을 고려하여 블록에서 블레이드를 들어 올립니다. </li><li> 초에게 플로트PBS에 침지시켜 블레이드 떨어져 위치시킵니다. (그림 1E) </li><li> 관심 영역에서 수확 조직 # 5 집게를 사용하여 (이 예제에서 우리는 앞쪽에 접합면 (전방) ACA, 그림 층을 사용)과의 bFGF를 포함하는 1 ㎖ N2 매체를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 수집합니다. </li><li> 멸균 조건 하에서 프로토콜의 나머지를 계속 층류 세포 배양 후드로 튜브를 이동. </li><li> 기계적 P1000 피펫의 부속 1 ㎖ 피펫 팁을 사용하여 조직을 해리. 상하 피펫 여러 번 (약 20X 초당 1 피펫 사이클의 속도로) 원뿔 튜브 (도 1G 1-3)의 아래에 대 피펫 팁의 개구를 누르면서. 용액이 균질 될 때 분쇄를 중지합니다. </li><li> 이 솔루션은 어떤 큰 nondissociated 조직이 바닥에 정착 할 수 있도록 2 분 동안 앉아 수 있습니다. (그림 1G 4) </li><li> homogen 수집eous 뜨는 및 N2 매체의 8.5 ML 플러스 20 NG / ML bFGF를, 500 NG / ML Dll4, 500 NG / ML ANG2, 200 nMJAK 억제제를 포함하는 원뿔 튜브에 배치합니다. </li><li> 3 희석 세포 솔루션의 ML / 잘 사용하여 6 - 웰 플레이트의 3 우물에 그들을 플레이트. </li><li> 37 ° C에서 5 % CO 2, 5 % O 2에 가습 세포 배양기에 플레이트를 놓습니다. </li></ol> 3. 데일리 케어 <ol><li> 도금 후 24 시간을 억제제의 bFGF, ANG2, Dll4 및 JAK를 포함 N2 매체와 배양 접시에 매체를 교체합니다. </li><li> 의 bFGF, Dll4, ANG2, 다음 날 JAK 억제제의 알약을 추가합니다. </li><li> 미디어의 변화 10-14 일 총 요소 추가이 교류 과정을 계속합니다. </li></ol> 4. 분화 유도 <ol><li> 매체를 포함 억제제의 bFGF, Dll4, ANG2 및 JAK을 철회하고 추가 요소를 포함하지 않는 N2 매체로 교체합니다. </li><li> 격일 매체를 변경합니다. </li><li> 10 일 이후 세포를 수정하고 면역 세포를 수행합니다. </li></ol> 5. 면역 세포 화학 감지 <ol><li> 매체를 대기음 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드의 2 ㎖의 세포 배양 접시를 고정합니다. </li><li> 5 분마다 PBS의 3 ㎖로 세척 배. </li><li> 대기음 PBS는, 투과 한 후, 20 분 동안 5 % 정상 당나귀 혈청 (NDS) 및 0.1 % 트리톤 X-100을 함유하는 PBS 중 2 ㎖를 첨가하여 세포를 차단. </li><li> 5 % NDS를 포함하는 PBS의 기본 항체 믹스를 준비합니다. TuJ1 (클래스 III β-튜 불린은), GFAP 및 CNPase 항체 분화 마커 트리플 염색을 위해 함께 사용될 수있는 반면 반대로 네 스틴 항체으로 SC를 식별하기 위해 사용될 수있다. </li><li> 차단 솔루션을 기음과 각 웰에 차 항체 혼합물의 1.5 ML를 추가합니다. 90 분 동안 실온에서 품어. </li><li> 기본 항체를 제거하고 PBS의 3 ㎖의 2 배를 씻어 5 분마다 5 % NDS를 포함하는 PBS의 3 ㎖로 1x는. </li><li> Prepar전자 PBS의 보조 항체는 5 % NDS를 포함. </li><li> 최종 세척을 기음과 각 웰에 차 항체 솔루션의 1.5 ML를 추가합니다. 실온에서 40 분 동안 어둠 속에서 배양한다. </li><li> 차 항체 솔루션을 제거하고 새로 제조 DAPI의 얼룩 2 ㎖ (PBS 500 겨 / ㎖)를 추가합니다. 3 분 동안 품어. </li><li> DAPI 솔루션을 대기음 후 5 분마다 PBS의 3 ㎖로 3 회 세척한다. 세포는 이제 형광 현미경으로 시각화 될 수있다. </li></ol>

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우리는 공개 아무것도 없어.

성공적으로 분리, 확장, 성인의 뇌에서 신경 줄기 세포의 분화에 중요한 단계의 대부분은 표준 조직 배양 기술에 공통으로 공유됩니다. 명심하는 목적은 성인의 뇌에서 분리 NSCs의 가능한 자신의 생체 내 특성 (그림 2,1)만큼을 유지해야한다는 것입니다. 종종 필요한주의와 적절한 속도 사이에 균형을 공격해야합니다. 두개골에서 뇌의 분리와 관심은 관심 영역의 식별이 훨씬 쉬워집니다. 동물 euthanization 다음 가능한 한 빨리 조직을 제거하고, 수확 및 세탁시 뇌 감기를 유지하는 것은 그것을 유지 더 엄격한과 크게 곰팡이를 구획 스테인리스 스틸에 배치 될 때 조직의 처리에 도움이됩니다. 이것은 또한 단면 처리 과정 동안 조직의 추출을위한 잠재력을 최소화한다. 프로토콜은 ABL 인의 혜택그들은 시험관에 배치되면이 세포 생존을 증가로 전자, 신속하게 도금의 지점에 세포를 얻을 수 있습니다. 이전 절편에 적절한 조직 세척 또한 문화에 오염의 가능성을 줄일 수 있습니다...

한 세기 이상 전에 라몬 Y.를 Cajal에 의해 뇌 cytoarchitecture의 기본 관찰에 의해 규정 신경 생물학의 중심 교리는, 사춘기가 CNS 1에서 발견되는 신경 네트워크의 복잡성을 주어진 후 신경이 어려울 것을 가졌다. 1960 년대에 알트만의 작품, 그리고 나중에 카플란, 3 H-티미 딘이 실제로 뉴런은 성인 뇌의 서로 다른 영역에서 생성되고 있었다 나타내는 성숙한 신경 세포에서 발견 될 수 있다는 것을 입증에도 불구하고, 교리는 2, 3을 유지하는 것을 계속했다. 증거는 가수 두뇌 4에 존재하는 뉴런의 수의 계절적 변화를 설명 Nottebohm의 연구를 탑재하는 것을 계속했다. 그것은 1999 년까지되지 않았을 때 쥐의 연관 학습 과제의 성능뿐만 아니라 Kornack 및 Rakic ​​시연의 관측과 해마 증가 뉴런의 생성에 굴드 등. 출판 일딸랑 딸랑 소리는 덜 엄격한, 더 플라스틱 뇌의 개념이, 5 인식 된 성인 짧은 꼬리 원숭이, 6에 신경을 계속했다. 이 새로이 생성 된 신경 세포의 세포 소스에 대한 검색은 7 벽감으로 불리는 뇌의 영역에있는 줄기 세포 (SC에)의 이산 인구의 발견으로 이어질. subventricular 영역과 해마의 하위 세부 영역은 두 가지 주요 신경성 지역 8,9로 간주됩니다. 이 위치에서 분리 된 세포는 고전적인 배아 또는 태아의 파생으로 SC의 특성,자가 재생과 분화 가능성을 표시합니다. 신경줄 기세포 (NSCs의)의 경우, 이들은 뉴런, 아스트로 사이트, 및 희소 돌기 아교 세포로 분화 될 수있다. 또한, 이러한 SCS는 이러한 중간 필라멘트 단백질 네 스틴 10 태아 NSC 마커에 대한 긍정적 인 얼룩. 최근의 작업은 SC에이 t에 한정되지 않을 수 있음을 강조지역 우와, 그리고이 사실에 단단히 혈관 (11)와 관련된 세포의 대부분 대기 인구로 뇌 전반에 걸쳐 현지화. SC에가 부상에 응답 동원 관측은 신경 퇴행성 질환 및 뇌졸중 (12, 13)에서 복구를 돕기 위해 회생 용으로 이들 세포를 이용할 수 있다는 가능성을 시사한다. 따라서 골아 세포, 연골 세포 및 지방 세포 (14)가 될 가능성이있는 혈관 주위 세포로 발견되는 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)이 결합 조직의 치유에 재생하는 역할 달리 아니다. 그러나 NSCs의 일상적인 흡인 및 밀도 구배 원심 분리 기술에 의해 골수에서 중간 엽 줄기 세포와 동일하게하여 수확 할 수없고 이후자가 세포 기반 치료에 활용. 결과적으로, 그러한의 emb 유래 태아 NSCs의 또는 신경 전구체의 사용과 같은 셀의 다른 소스ryonic 줄기 세포가 광범위하게 성공 (15)의 학위를 변화와 동물의 질병과 부상의 모델을 탐구하고 있습니다. 체세포 소스를 이용하여 유도 만능 줄기 세포 기술은 제한된 가용성 및 배아 세포와 태아 조직 (16)의 사용에 대한 윤리적 문제를 극복하고, 응용 프로그램의 광범위한 치료에 유용 세포 기반 치료법을 생산하는 또 다른 잠재적 인 수단을 제공합니다. 그러나, 이러한 연구 결과의 임상 번역 (17, 18)뿐만 아니라, 규제 통관에 구불 구불 한 경로를 접근 SC 기반 치료와 함께 다양한 신경 학적 조건을 치료하는 투쟁에서와 같이, 어려운 작업이 될 입증되었습니다. 다른 방법으로, 특정 약물 치료의 도입은 NSC의 숫자를 조절하고 파킨슨 질환과 뇌졸중의 19 모델의 회복을 촉진 할 수있다. 전략은 효과적으로 이러한 세포를 조작하는 방법을 이해 할 수있는 어떤접근 체외 시스템이 필요합니다. NSCs의의 문화는 neurosphere를로 알려진 집계 문화, 또는 단일 층 8,20로도 수행 할 수 있습니다. 두 기술은 널리 다 능성 전구 물질의 확장을 제공 정의 배양 조건, 유사 분열 물질 소스로 표피 성장 인자 (EGF) 또는 기본 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF의)의 예 사용의 설립을 허용, 사용되어왔다. neurosphere 배양 고립 셀 분류 클론 번식 능력을 연구에 더 적합 할 수 있지만, 시스템 (21)은 팽창시 세포의 혼합 집단을 생성하는 것으로 나타났다. 또, neurosphere를의 밀폐 구조는 세포의 약리 조작 비실용적하게하고, 이러한 요인이있을 수 영향 해석 인해 neurosphere 자체 내에 설립 미시로 혼동 할 수있다. 단층 배양, 다른 한편으로는, 일 수있다SC의 성장과 분화를 조절하고 특히이 세포 집단을 대상으로 새로운 화합물을 발견 할 수있는 기회를 여는 신호 전달 메커니즘을 탐구 할 수있는 강력한 도구를 제공하고, 작은 분자 라이브러리의 높은 처리량 화면에 사용. 결과적으로, 재현성 뇌 그 상이한 영역에서 성인 NSCs의 배양을 생성하는 기능은 중추 신경계 (CNS)의 개발 연구로부터 신규 한 재생 의료 방법을 탐구에 이르는 연구 광범위한 애플리케이션에 사용될 수있다 . 여기에 제시된 프로토콜은 해부 성인 쥐의 뇌에서 분리 CNS의 SC와의 차별화의 잠재력을 평가하는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>6-웰 조직 배양 접시</td><td>BD Biosciences</td><td>353934</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3655</td><td> 5 mg/ml 스톡 용액 이중 증류수에서 제조(-20°C에서 몇 달 동안 안정; C) . 물 중 작업 농도 0.5 mg / ml (4 &deg에서 1 개월 동안 안정; C). </td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td>R& D Systems</td><td>1030-Fn</td><td>원액을 교반하지 마십시오</td></tr><tr><td>여과 장치</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430769</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Mediatech</td><td>10-090-CV</td><td>완전한 N2 매체 준비는 아래 참고 사항을 참조하십시오</td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-2036</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-0516</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5780</td><td>1 M 재고 용액 ddH2O (20°C에서 안정; C 6 개월 동안)</td></tr> <tr><td>나트륨 셀레 나이트</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>S-5261</td><td>500 &마이크로; ddH2O의 M 원액(-20에서 안정 > C 6 개월 동안)</td></tr> <tr><td>프로게스테론</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>P-8783</td><td>100 &마이크로; 에탄올의 M 원액 (-20°C에서 안정; C 6개월)</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>인비트로겐</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB</td><td>작업 농도 20 ng/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>델타4 (Dll4)</td><td>R& D Systems</td><td>1389-D4</td><td>작업 농도&nbsp; 500 ng/ml</td></tr><tr><td>Angiopoetin 2 (Ang2)</td><td>R& D Systems</td><td>623-AN</td><td>작동 농도&nbsp; 500 ng/ml</td></tr><tr><td>JAK 억제제</td><td>Calbiochem</td><td>420099</td><td>작동 농도 200 nM&nbsp;</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2058</td><td></td></tr><tr><td>15 및 50 ml 원뿔형 튜브</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430053, 430829</td><td></td></tr><tr><td>기타 필요한 품목은 다음과 같습니다 : 면도날 및 집게를 포함한 일반 해부 도구, 성인 쥐 (3-6 개월; Sprague-Dawley 또는 Long Evans), CO2 중독 챔버, 세포 배양 및 인큐베이터용 층류 후드 인큐베이터(가습, 37 &deg; C, 5% CO2, 5% O2). 참고: 완전한 N2 배지 준비를 위해 DMEM/F-12(500ml) 한 병에 아포트랜스페린 0.05g, 인슐린 0.0125g(10mM NaOH 1ml에 갓 사전 용해), 50μ를 추가합니다. Putrescine의 l, 30 &mu; 나트륨 셀레 나이트의 l, 100 &mu; 프로게스테론 스톡의 l, 그리고 페니실린/스트렙토마이신 용액 5ml.&nbsp; 필요한 경우 pH를 7.2로 조정합니다. 필터 살균 및 4°C에서 보관; C는 최대 3 주 동안 빛으로부터 보호 합니다.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">면역형광 시약 표</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15719</td><td></td></tr><tr><td>일반 당나귀 혈청(NDS)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D-9663</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마-알드리치</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>4,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D-8417</td><td>5 mg/ml 재고 메탄올</td></tr><tr>의 용액<td colspan="4">1차 항체 테이블</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Chemicon</td><td>MAB353</td><td> 희석 계수: 1:400 종: 마우스 IgG1 </td></tr><tr><td>Hes3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-25393</td><td> 희석 계수: 1:100 종: 토끼 IgG </td></tr><tr><td>Sox2</td><td>R& D Systems</td><td>MAB2018</td><td> 희석 계수: 1:100 종: 마우스 IgG2a </td></tr><tr><td>CNPase</td><td>Chemicon</td><td>MAB326</td><td> 희석 계수: 1:200 종: 마우스 IgG1 </td></tr><tr><td>&beta;-tubulin III (TUJ1)</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1195</td><td> 희석 계수: 1:500 종: 마우스 IgG2a </td></tr><tr><td>신경교섬유산성 단백질(GFAP)</td><td>Dako North America</td><td>Z0334</td><td> 희석 인자 1:500 종: 토끼 </td></tr><tr><td colspan="4">2차 항체 표</td></tr><tr><td>Alexa&nbsp; &nbsp; 568</td><td>Invitrogen</td><td>A-21124</td><td> 희석 인자: 1:200 종: 염소 항 마우스 IgG1 </td></tr><tr><td>Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21131</td><td> 희석 인자: 1:200 종: 염소 항 마우스 IgG2a </td></tr><tr><td>Cy5</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>59883</td><td> 희석 계수: 1:200 종: 염소 안티 토끼 </td></tr></tbody></table>

성인 쥐의 뇌의 기존 및 비 인습적 인 지역에서 신경 줄기 세포 성장

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

최근 연구는 중추 신경계 (CNS) 재생 및 종양 줄기 세포의 인구 (SC에) 성인 뇌 내 거주자를 포함 것을 보여줍니다. 그러나 메커니즘이 정상적으로 정지 세포가 적절한 신경망의 기능뿐만 아니라, 신경 퇴행성 프로세스의 부상 및 완화 회복에 자신의 역할을 보장하기 위해 고용은 조금 이해된다. 이러한 세포는 혈관 및 면역 조절 성 시스템 모두로부터 신호들을 포함한 서스테인 환경을 제공 「틈새」이라고도 영역에 상주. 알 수없는 요인을 제외 정의 배양 조건에서 CNS의 SC와의 분리, 유지 보수 및 차별화, 따라서 자신의 생체 내 행동에 대한 통찰력을 제공하고, 약물 또는 유전자에 의한 치료에 액세스 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 성인 뇌의 특정 영역에서 CNS의 SC와의 문화를 생성하는 방법에 대한 자세한 정보를 제공하고 자신의 개발을 평가하는 접근신경 세포, 성상 세포, 그리고 체외에서 희소 돌기 아교 세포에 ifferentiation 가능성. 이 기술은 개별 SC에 자신의 자손을 연구하기 위해 시각화 할 수있는 단일 층 문화로 균일 한 세포 인구를 산출한다. 게다가, 다른 동물 모델 시스템과 임상 샘플을 가로 질러인가 될 수 손상된 성인 신경계 재생 반응을 예측하기 이전에 사용된다.

신경 줄기 세포를 수확되는 관심 영역을 확인하는 것은 중요한 첫 단계이며 그것은 세포의 합류 판을 얻​​는 데 걸리는 시간의 양을 정의 할 것이다. 예를 들어, SVZ는 고전 신경성 영역이며, 따라서 신경 줄기 세포의 상대적으로 높은 비율을 갖는다. 그러나, 여기에 제시된 기술은 종종 성인기 강력한 신경성 잠재력을 갖는 것으로 인식되지 않는 다른 영역으로 사용될 수있다. 이 프로토콜의 목적을 위해, 우리는 전방 접합면 (전방 부분)을 사용했다. 세포와 파편의 일부가 도금에 침전되지만, 매체는 일반적으로 다음의 본 저작이다 세포 물질의 양의 결과로 백탁 남아있을 것이다. 24 시간의 첫 번째 매체 변경이의 대부분을 제거합니다. 광학 현미경에 의해 시각 같이, 심지어 제 1 매질 변경 후에, 혈관과 함께, 남아있는 세포 물질의 다량있을 나타난다. 의 과정을 통해다음 몇 일, 별개의 증식 세포 인구의 식민지 현미경 (그림 2A)에서 표시 될 것입니다. 이들의 bFGF, ANG2, Dll4 및 JAK 억...

성인의 뇌에서 수확 한 신경 줄기 세포는 신경 시스템 개발의 기초 연구에서 재생 의학의 잠재적 인 임상 응용 프로그램을 탐험에 이르기까지 다양한 애플리케이션에 활용 증가하고있다. 이 실험 결과를 소리를하는 것이 중요합니다 이러한 세포를 성장하는 데 사용되는 분리 및 배양 조건에서 엄격한 통제를한다.

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

다음 실험의 전반적인 목표는 성인 설치류 뇌의 다양한 영역에서 신경 줄기 세포 배양을 생성하는 것입니다. 이는 신경 줄기 세포의 존재와 잠재력을 조사하기 위해 관심 영역에서 조직을 채취함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 단층 배양으로 도금을 위해 조직을 세포 현탁액으로 처리합니다.다음으로, 정의된 배양 조건을 사용하여 신경 줄기세포를 선택적으로 증식시켜 자가 재생 가능성을 검증합니다. 신경 줄기 세포가 분화 잠재력에 따라 다능하다는 것과 다양한 요인이 자기 재생과 운명에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 보여주는 시험관 내 결과가 얻어졌습니다. 이 방법은 내인성 신경 줄기세포가 어디에 있고 어떻게 조작하는지와 같은 신경 과학 및 재생 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.우리는 신호 감소 경로를 발견했을 때 이 기술을 처음 생각했습니다. 이를 통해 우리는 추정되는 내인성 신경 줄기세포를 확인하고 그 수를 조절할 수 있었습니다. 그래서 우리는 이 지식을 적용하여 뇌의 다른 영역에서 이러한 세포의 강력한 배양을 확립했습니다.그들의 특성을 연구하고 그것이 실제로 줄기 세포입니까? 적절한 배양 접시 준비는 예정된 해부 이틀 전에 접시에 폴리, L, 오르니틴, 밀리리터당 75마이크로그램으로 코팅하는 것이 중요합니다. 그런 다음 다음날 밤새 플레이트를 배양하고 폴리 L 오르니틴 인을 흡인하고 세척 당 5 분 동안 3 밀리리터의 PBS로 각 웰을 두 번 세척합니다.그런 다음 플레이트를 최대 3주 동안 인큐베이터에 보관할 수 있습니다.최종 세척을 제거한 후 부드러운 피펫팅으로 PBS에 1-250으로 희석된 섬유 닌을 추가합니다. 용액을 과도하게 휘젓지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 해부 당일 밤새 플레이트를 배양합니다.피브로넥틴을 흡인하고 PBS로 접시를 두 번 씻습니다. 최종 PBS 세척이 완료된 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣고 해리된 조직을 기다립니다. 사용하지 않은 플레이트는 최대 일주일 동안 인큐베이터에 보관할 수 있지만 건조되지 않도록 하거나 흔들지 마십시오.이 프로토콜의 시연은 3마리의 성체 쥐로 확장되었습니다. 먼저, 첫 번째 쥐를 안락사시키기 전에 얼음 위에서 뇌 절편 블록을 식히십시오. 그런 다음 얼음 위에 15ml 원뿔형 튜브를 5ml의 N, 2, 중간 및 기본 FGF와 함께 준비합니다.안락사된 쥐의 뇌를 적출한 후, 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 10cm 페트리 접시에 뇌를 넣는다. 그런 다음 머리카락이나 혈액이 남지 않은 두 번째 PBS 접시로 뇌를 옮깁니다. 이제 뇌를 냉장 절편 블록에 넣고 세포가 생성될 관심 영역에 가까운 블록에 깨끗한 새 면도날 하나를 삽입합니다.그런 다음 두 번째 깨끗한 면도날을 삽입합니다. 첫 번째 면도날에는 3mm가 꽉 찼다. 관심 부분을 함께 가져가 블록에서 블레이드를 조심스럽게 들어 올립니다.PBS에 담그어 블레이드에서 섹션을 띄웁니다. 이제 5번 집게를 사용하여 관심 영역을 수확합니다. 이 예에서 섹션에는 전방 커미셔너가 포함되어 있습니다. 물론.기본 FGF가 있는 5밀리리터의 N 2개 매체가 들어 있는 15ml 원추형 튜브에 섹션을 수집합니다. 그런 다음 용액의 부피를 1-2 밀리리터로 줄이십시오. 다음으로, 세포 배양 후드에서 1밀리리터 피펫 팁을 원뿔형 바닥에 담그고 약 20개의 용액 흐름을 사용하여 조직을 기계적으로 분리합니다.용액이 균질해지면 tation을 중지하고 더 큰 연관되지 않은 조직이 바닥에 가라앉을 수 있도록 몇 분 동안 그대로 두십시오. 이제 조직 덩어리가 없는 균질한 상등액을 8.5밀리리터의 보충 매체와 두 개의 매체가 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 튜브 내용물을 섞고 6개를 준비합니다.웰 플레이트. 웰에서 PBS를 제거한 다음 배양 후 10-14일 동안 웰당 3밀리리터의 세포 혼합물을 3개의 웰에 추가합니다. 격일로 매일 도금 후 24 시간 부터 격일로 신선한 보충 N 2로 매체를 교체하고 N 2에 새로운 양의 보충제를 추가하십시오.이미 세포에 있는 배지 또는 배지. 배지 조건에 대한 주의는 세포를 분화되지 않은 상태로 유지하고 세포가 증식할 수 있도록 하는 데 필수적입니다. 첫 번째 매체 변화 후, 많은 양의 세포 파편이 혈관과 함께 남았습니다.그러나 그 후 며칠 동안 뚜렷하게 증식하는 줄기세포 군체가 눈에 띄게 되었습니다. 또한 세포 집단과 같은 더 길쭉한 방추체가 존재했습니다. 이들은 신경 줄기 세포가 아니며 신경 줄기 세포가 증식함에 따라 결국 추월당했습니다.그 후 2주 동안 신경 줄기세포는 합류점에 도달할 때까지 더 조밀하게 성장했습니다. 이러한 배양은 SOX 2, hesi 및 nest를 포함한 여러 줄기 세포 마커에 대해 양성으로 염색되었습니다. 따라서 선택되고 확장된 세포 집단이 실제로 신경 줄기세포라는 확신을 제공합니다.배지에서 FGF를 회수한 후 추가 확인이 이루어졌으며, 이를 통해 세포는 10일 동안 뉴런, 성상세포 및 모든 센드라 세포로 분화할 수 있었습니다. 차별화를 유도하기 위해. 보충된 N2 배지를 unsu 보충된 N2로 교체하고, 배지를 배양하고 10일 동안 세포를 배양하고, 10일 후 48시간마다 N 2개를 교체하고, 배지를 흡인하고 20분 동안 웰당 2밀리리터의 4%파라 포름알데히드로 세포를 고정합니다.PBS 3ml로 고정액을 세척할 때마다 5분 동안 두 번 씻어냅니다. 두 번째 세척 후 5%일반 당나귀 혈청과 0.1% tritton X 100이 함유된 PBS 2ml를 주입하여 세포를 퍼밍하고 차단하며 세포가 실온에서 20분 동안 배양하는 동안 세포를 차단합니다. 5%NDS를 함유하는 PBS에서 1차 항체 혼합물을 준비합니다.이 예에서는 anti T UJ one 항체를 적용하여 뉴런을 식별하고, GFAP와 CPA의 항체는 각각 성상세포와 희소돌기아교세포를 시각화하는 데 사용됩니다. 20분 후 차단 용액을 흡인하고 각각에 1차 항체 혼합물 1.5ml를 추가합니다. 세포를 잘 배양하십시오.90분 후 90분 동안 실온을 추가하고 두 번의 PBS 수조로 세포를 세척한 다음 5% NDS를 함유한 PBS를 한 번 도포하여 3밀리리터의 용액과 5분 수조를 사용합니다. 최종 세척을 제거한 후 각각 5%NDS를 함유한 PBS에 1.5ml의 2차 항체를 도포합니다. 그런 다음 접시를 어두운 곳에 놓고 실온을 더한 다음 40분 동안 기다립니다.40분 후 2차 염색제를 새로 준비한 DPI 염색 2밀리리터로 교체하고 3분 동안 기다립니다. DPI 용액을 흡입한 후 세척당 5분 동안 3ml의 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 그런 다음 세포는 이 절차에 따라 현미경 검사를 할 준비가 됩니다.웨스턴 블롯(western blots)과 같은 다른 방법을 수행하여 약리학적 치료 또는 세포 분화 과정에서 발생하는 단백질 발현 및 인산화의 변화를 관찰할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 실제로 신경 과학 분야의 연구자들이 생쥐, 쥐, 심지어 영장류를 포함한 여러 종에서 연구에서 구현한 새로운 방법을 테스트할 수 있는 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오 프로토콜은 성인 마우스 periventricular 지역에서 신경 줄기 세포를 생성하고 확장 neurosphere 분석 방법을 보여줍니다, 그리고 하나는 재현성 neurosphere 문화를 달성할 수 있도록 기술적인 통찰력을 제공합니다.

절연 및 Neurosphere 어세를 사용하여 성인 마우스 신경 줄기 세포의 확장

이 비디오는 성체 쥐의 척수 뇌실 주위 조직에서 신경 줄기/전구 세포를 분리하는 방법을 제시합니다. 이 기술에는 단백질 분해 효소가 포함된 용액에서 조직 조각을 배양하여 세포 외 기질을 파괴하고 세포를 방출하는 것이 포함됩니다. 그 후, 방출된 세포는 신경 줄기/전구 증식을 강화하고 3차원 신경구로의 응집을 촉진하는 특정 성장 인자를 포함하는 배지에 도금됩니다.

성체 쥐의 척수 뇌실 주위 영역에서 신경 줄기 전구 세포의 격리

이 프로토콜은 단일 세포 현탁액 분해없이 구형 신경 줄기 및 전구 세포 응집체의 확장을 허용 신규 기계적 자르고 방법을 설명한다. 세포 / 세포의 접촉을 유지하는 것은 40 구절에 대한 신속하고 안정적​​인 성장을 할 수 있습니다.

인간의 신경의 집계의 cGMP-해당 확장 방법은 줄기 및 전구 세포는 다 능성 줄기 세포 또는 태아 뇌 조직에서 파생 된

여기서 우리는 subventricular 영역과 개인 성인 쥐의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서, 부착 단층 또는 neurosphere를 하나로서, 신경 전구 세포 배양의 동시 발생에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

다 자란 포유류의 척수에는 배양에서 분리 및 확장될 수 있는 신경줄기세포/전구세포(NSPC)가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 쥐와 인간 장기 이식 기증자로부터 성인 척수의 뇌실 주위 영역에서 생성된 NSPC의 수확, 분리, 배양 및 전달을 설명합니다.

뇌실 주위 백질 성인 쥐의 지역 및 인간의 척수에서 신경 줄기 / 전구 세포의 분리

우리는 성체 쥐 뇌의 뇌실하부(SVZ)에서 신경줄기세포(NSC)와 그 자손을 분리하기 위한 FACS(Fluorescent Activated Cell Sorting) 기반 방법을 보고합니다. FUCCI(Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator) 형질전환 마우스에 적용되어 라이브 이미징을 통한 세포 주기 진행을 연구할 수 있습니다.

셀 성인 마우스 뇌실 영역에서 신경 줄기 및 전구 세포의 정렬과 세포주기 역학의 라이브 이미징

성체 신경 줄기세포(aNSCs) 확장을 위한 배양 시스템을 구축하면 치료를 위한 aNSC를 검사하고 적용할 수 있습니다. 굳은살하영역(subcallosal zone, SCZ)은 최근 성체 마우스에서 새로운 신경아세포 형성 영역으로 인식되고 있습니다. 여기에서는 SCZ-aNSC의 분리, 확장 및 분화 방법에 대해 설명합니다.

마우스 뇌량 밑 영역에서의 분리 및 성인 신경 줄기 세포의 문화

송곳니 뇌는 성인 신경 연구에 귀중한 모델입니다. 분리 및 기본 뇌 조직에서 성인 개 해마 신경 전구 세포 확장을위한 프로토콜은 여기에 표시됩니다.

분리 및 성인 개 해마 신경 전구체의 확장

여기, 전자13 마우스 배아 절 예 하에서 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 새로운 microsurgical 기술을 소개합니다.

절연 및 마우스 배아 신경 줄기 세포의 문화

살아있는 쥐의 뇌에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하는 방법이 여기에 실험적으로 자세히 제시되어 있습니다. 그것은 그들의 웰빙을 손상시키지 않고 동일한 동물로부터 이러한 세포를 여러 번 수집할 수 있습니다.

살아있는 쥐에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하기 위한 "뇌 착유" 방법

여기에서는 성체 쥐 뇌실 영역에서 분리된 확장된 신경 줄기 세포(NSC)에서 유전자 전달 효율성을 향상시키도록 설계된 핵절충 시스템에 대해 설명합니다. 이 연구 결과는 이 방법이 NSC의 유전자 섭동을 크게 개선하여 기존 transfection 프로토콜의 효과를 능가하고 세포 생존율을 향상시킨다는 것을 보여줍니다.

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

배우세요 성인 설치류 뇌에서 신경줄기세포 배양법을 통해 신경과학 및 재생의학 연구에 활용하는 방법입니다. 이 기술은 내인성 신경줄기세포의 위치 파악과 조작에 필수적인 통찰을 제공합니다.

성인 쥐의 뇌의 기존 및 비 인습적 인 지역에서 신경 줄기 세포 성장

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