성인 쥐의 뇌의 기존 및 비 인습적 인 지역에서 신경 줄기 세포 성장

다음 실험의 전반적인 목표는 성인 설치류 뇌의 다양한 영역에서 신경 줄기 세포 배양을 생성하는 것입니다. 이는 신경 줄기 세포의 존재와 잠재력을 조사하기 위해 관심 영역에서 조직을 채취함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 단층 배양으로 도금을 위해 조직을 세포 현탁액으로 처리합니다.

다음으로, 정의된 배양 조건을 사용하여 신경 줄기세포를 선택적으로 증식시켜 자가 재생 가능성을 검증합니다. 신경 줄기 세포가 분화 잠재력에 따라 다능하다는 것과 다양한 요인이 자기 재생과 운명에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 보여주는 시험관 내 결과가 얻어졌습니다. 이 방법은 내인성 신경 줄기세포가 어디에 있고 어떻게 조작하는지와 같은 신경 과학 및 재생 의학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

우리는 신호 감소 경로를 발견했을 때 이 기술을 처음 생각했습니다. 이를 통해 우리는 추정되는 내인성 신경 줄기세포를 확인하고 그 수를 조절할 수 있었습니다. 그래서 우리는 이 지식을 적용하여 뇌의 다른 영역에서 이러한 세포의 강력한 배양을 확립했습니다.

그들의 특성을 연구하고 그것이 실제로 줄기 세포입니까? 적절한 배양 접시 준비는 예정된 해부 이틀 전에 접시에 폴리, L, 오르니틴, 밀리리터당 75마이크로그램으로 코팅하는 것이 중요합니다. 그런 다음 다음날 밤새 플레이트를 배양하고 폴리 L 오르니틴 인을 흡인하고 세척 당 5 분 동안 3 밀리리터의 PBS로 각 웰을 두 번 세척합니다.

그런 다음 플레이트를 최대 3주 동안 인큐베이터에 보관할 수 있습니다.최종 세척을 제거한 후 부드러운 피펫팅으로 PBS에 1-250으로 희석된 섬유 닌을 추가합니다. 용액을 과도하게 휘젓지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 해부 당일 밤새 플레이트를 배양합니다.

피브로넥틴을 흡인하고 PBS로 접시를 두 번 씻습니다. 최종 PBS 세척이 완료된 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣고 해리된 조직을 기다립니다. 사용하지 않은 플레이트는 최대 일주일 동안 인큐베이터에 보관할 수 있지만 건조되지 않도록 하거나 흔들지 마십시오.

이 프로토콜의 시연은 3마리의 성체 쥐로 확장되었습니다. 먼저, 첫 번째 쥐를 안락사시키기 전에 얼음 위에서 뇌 절편 블록을 식히십시오. 그런 다음 얼음 위에 15ml 원뿔형 튜브를 5ml의 N, 2, 중간 및 기본 FGF와 함께 준비합니다.

안락사된 쥐의 뇌를 적출한 후, 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 10cm 페트리 접시에 뇌를 넣는다. 그런 다음 머리카락이나 혈액이 남지 않은 두 번째 PBS 접시로 뇌를 옮깁니다. 이제 뇌를 냉장 절편 블록에 넣고 세포가 생성될 관심 영역에 가까운 블록에 깨끗한 새 면도날 하나를 삽입합니다.

그런 다음 두 번째 깨끗한 면도날을 삽입합니다. 첫 번째 면도날에는 3mm가 꽉 찼다. 관심 부분을 함께 가져가 블록에서 블레이드를 조심스럽게 들어 올립니다.

PBS에 담그어 블레이드에서 섹션을 띄웁니다. 이제 5번 집게를 사용하여 관심 영역을 수확합니다. 이 예에서 섹션에는 전방 커미셔너가 포함되어 있습니다. 물론.

기본 FGF가 있는 5밀리리터의 N 2개 매체가 들어 있는 15ml 원추형 튜브에 섹션을 수집합니다. 그런 다음 용액의 부피를 1-2 밀리리터로 줄이십시오. 다음으로, 세포 배양 후드에서 1밀리리터 피펫 팁을 원뿔형 바닥에 담그고 약 20개의 용액 흐름을 사용하여 조직을 기계적으로 분리합니다.

용액이 균질해지면 tation을 중지하고 더 큰 연관되지 않은 조직이 바닥에 가라앉을 수 있도록 몇 분 동안 그대로 두십시오. 이제 조직 덩어리가 없는 균질한 상등액을 8.5밀리리터의 보충 매체와 두 개의 매체가 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 튜브 내용물을 섞고 6개를 준비합니다.

웰 플레이트. 웰에서 PBS를 제거한 다음 배양 후 10-14일 동안 웰당 3밀리리터의 세포 혼합물을 3개의 웰에 추가합니다. 격일로 매일 도금 후 24 시간 부터 격일로 신선한 보충 N 2로 매체를 교체하고 N 2에 새로운 양의 보충제를 추가하십시오.

이미 세포에 있는 배지 또는 배지. 배지 조건에 대한 주의는 세포를 분화되지 않은 상태로 유지하고 세포가 증식할 수 있도록 하는 데 필수적입니다. 첫 번째 매체 변화 후, 많은 양의 세포 파편이 혈관과 함께 남았습니다.

그러나 그 후 며칠 동안 뚜렷하게 증식하는 줄기세포 군체가 눈에 띄게 되었습니다. 또한 세포 집단과 같은 더 길쭉한 방추체가 존재했습니다. 이들은 신경 줄기 세포가 아니며 신경 줄기 세포가 증식함에 따라 결국 추월당했습니다.

그 후 2주 동안 신경 줄기세포는 합류점에 도달할 때까지 더 조밀하게 성장했습니다. 이러한 배양은 SOX 2, hesi 및 nest를 포함한 여러 줄기 세포 마커에 대해 양성으로 염색되었습니다. 따라서 선택되고 확장된 세포 집단이 실제로 신경 줄기세포라는 확신을 제공합니다.

배지에서 FGF를 회수한 후 추가 확인이 이루어졌으며, 이를 통해 세포는 10일 동안 뉴런, 성상세포 및 모든 센드라 세포로 분화할 수 있었습니다. 차별화를 유도하기 위해. 보충된 N2 배지를 unsu 보충된 N2로 교체하고, 배지를 배양하고 10일 동안 세포를 배양하고, 10일 후 48시간마다 N 2개를 교체하고, 배지를 흡인하고 20분 동안 웰당 2밀리리터의 4%파라 포름알데히드로 세포를 고정합니다.

PBS 3ml로 고정액을 세척할 때마다 5분 동안 두 번 씻어냅니다. 두 번째 세척 후 5%일반 당나귀 혈청과 0.1% tritton X 100이 함유된 PBS 2ml를 주입하여 세포를 퍼밍하고 차단하며 세포가 실온에서 20분 동안 배양하는 동안 세포를 차단합니다. 5%NDS를 함유하는 PBS에서 1차 항체 혼합물을 준비합니다.

이 예에서는 anti T UJ one 항체를 적용하여 뉴런을 식별하고, GFAP와 CPA의 항체는 각각 성상세포와 희소돌기아교세포를 시각화하는 데 사용됩니다. 20분 후 차단 용액을 흡인하고 각각에 1차 항체 혼합물 1.5ml를 추가합니다. 세포를 잘 배양하십시오.

90분 후 90분 동안 실온을 추가하고 두 번의 PBS 수조로 세포를 세척한 다음 5% NDS를 함유한 PBS를 한 번 도포하여 3밀리리터의 용액과 5분 수조를 사용합니다. 최종 세척을 제거한 후 각각 5%NDS를 함유한 PBS에 1.5ml의 2차 항체를 도포합니다. 그런 다음 접시를 어두운 곳에 놓고 실온을 더한 다음 40분 동안 기다립니다.

40분 후 2차 염색제를 새로 준비한 DPI 염색 2밀리리터로 교체하고 3분 동안 기다립니다. DPI 용액을 흡입한 후 세척당 5분 동안 3ml의 PBS로 세포를 세 번 세척합니다. 그런 다음 세포는 이 절차에 따라 현미경 검사를 할 준비가 됩니다.

웨스턴 블롯(western blots)과 같은 다른 방법을 수행하여 약리학적 치료 또는 세포 분화 과정에서 발생하는 단백질 발현 및 인산화의 변화를 관찰할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 실제로 신경 과학 분야의 연구자들이 생쥐, 쥐, 심지어 영장류를 포함한 여러 종에서 연구에서 구현한 새로운 방법을 테스트할 수 있는 길을 열었습니다.