하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

이 절차의 전반적인 목표는 개별 성체 마우스의 뇌실하 영역과 치상회(dentate gyrus)에서 부착 단층 또는 신경구로 신경 전구체 세포 배양을 동시에 생성하는 것입니다. 이것은 먼저 개별 성인 쥐의 뇌를 제거함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 심실하부(sub ventricular zone)를 미세절부하고 이랑(gyrus) 영역을 치열화하는 것입니다.

다음으로, 조직은 단일 세포 현탁액으로 해리됩니다. 마지막 단계는 전구체 세포를 부착 단층 또는 신경구로 배양하는 것입니다. 궁극적으로, 신경 구체 분석법과 부착 단층 배양 시스템은 성체 신경 줄기 세포의 증식 또는 분화 가능성을 결정하는 데 유용한 도구입니다.

체외에서, 이 방법을 사용하면 성인 신경 발생 분야에서 몇 가지 매우 흥미로운 질문을 해결할 수 있습니다. 이를 통해 우리는 개별 동물의 세포를 보고 비교할 수 있으며, 이는 개인차, 또는 예를 들어 대조군과 비교한 개별 형질전환 또는 녹아웃 마스크 간의 차이점을 살펴보는 맥락에서 중요합니다. 우리 그룹의 선임 과학자인 타라 워커(Tara Walker)는 뇌 해부 전에 이 방법을 발표하곤 했다.

가장자리가 둥글게 될 때까지 유리 목초지 피펫을 화염에서 회전시켜 중형 및 작은 멧돼지로 불 광택 피펫을 준비합니다. 그런 다음 오토클레이브에서 살균하십시오. 먼저, PBS가 들어 있는 10cm 플라스틱 페트리 접시에 뇌를 옮긴다.

페트리 접시를 저배율로 해부 현미경 아래에 놓고 뇌를 복부 표면에 위치시킵니다. 그런 다음 소뇌를 잡고 있는 동안 미세한 곡선 겸자를 사용하여 후각구를 제거합니다. 다음으로, 뇌를 등쪽으로 회전시킵니다.

SVZ를 미세 해부하기 위해 메스로 시신경 수준에서 뇌를 관상동맥으로 절단합니다. 절단된 관상 표면이 위를 향하도록 뇌의 배부 부분을 접시에 대십시오. 더 높은 배율에서는 중격을 제거하고 폐기하십시오.

그런 다음 미세한 곡선 겸자의 한쪽 블레이드 끝을 측면 심실의 측면 모서리에 배치하여 심실을 둘러싼 얇은 조직층인 SVZ를 해부합니다. 말뭉치(corpus callosum)와 다른 쪽 잎 바로 아래, 뇌실에 바로 인접한 조직으로 약 1mm. 접시 바닥과 심실의 복부 쪽쪽으로 집게를 눌러 작은 삼각형 조직 조각을 제거합니다.

그 후, 절개된 SVZ를 얼음 위의 페트리 접시에 넣어 DEG 장소, 페트리 접시에서 뇌의 유아 부분을 미세 해부하고 해부 현미경으로 메스를 사용하여 세로 균열을 따라 자릅니다. 소뇌와 염료 두부를 제거합니다. 이제 DG 주변의 경계가 보이도록 현미경의 초점을 다시 맞춥니다.

dg를 제거하려면 27 게이지 바늘 끝을 삽입하고 DG와 아멘 호른 사이의 경계를 따라 밉니다. 그런 다음 SVZ 조직 해리를 위해 미세 집게를 사용하여 주변 조직에서 DG를 제거합니다. 큰 조각이 남지 않을 때까지 메스 날을 사용하여 1분 동안 조직을 다집니다.

그런 다음 소생합니다. EDTA에서 1ml의 Prewarm 0.05% 트립으로 다진 조직을 매달아 놓습니다. 그런 다음 15ml 튜브에 옮기고 섭씨 37도로 설정된 수조에서 7분 동안 배양합니다.

효소 반응을 멈추려면 DNA 백조가 함유된 트립신 억제제 1ml를 넣고 튜브를 튕겨 내용물을 혼합합니다. 다음으로 300Gs에서 5분 동안 원심분리하여 현탁액을 펠릿화하고 흉터를 만듭니다. 그 후 sennett는 펠릿을 1 밀리리터의 성장 배지에 재현탁시키고 gly와 연관시킵니다.

P 1000 피펫을 사용하여 약 7-10회 위아래로 피펫팅. 그런 다음 총 부피 5ml에 성장 배지를 추가하고 세포 현탁액을 40마이크로미터 체에 통과시켜 파편과 관련 없는 조직 덩어리를 제거합니다. 그런 다음 300G에서 5분 동안 원심분리합니다.

supinate와 reus를 버리십시오. 생성된 펠릿을 DG 조직 해리를 위해 200마이크로리터의 성장 배지에 현탁시킵니다. 큰 조각이 남지 않을 때까지 메스 날을 사용하여 약 1분 동안 조직을 다집니다.

다음으로, 다진 조직을 예열 PDD 효소 혼합물로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 20분 동안 배양하고 3-5분마다 튜브를 뒤집어 혼합합니다. 다음으로, 중간 구멍의 소방 광택 목초지 피펫을 사용하여 조직을 위아래로 부드럽게 10회 피펫팅하여 기계적으로 해리한 다음 섭씨 37도에서 10분 더 배양하고 3-5분마다 튜브를 튕겨 혼합합니다. 더.

조직을 기계적으로 해리시키며, 작은 멧돼지 불 광택이 나는 목초지 피펫을 사용하여 위아래로 부드럽게 10회 피펫팅합니다. 그 후, 130gs에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 후, supinate를 제거하고 펠릿을 1ml의 완충 용액에 재현탁시킵니다.

완충 용액으로 최대 10 밀리리터를 만드십시오. 130GS에서 5분 동안 원심분리 후. S 상등액을 제거하고 펠릿을 호출당 20%씩 5밀리리터로 재현탁합니다.

그런 다음 450GS에서 15분 동안 원심분리합니다. 스내트를 제거하고 펠릿을 10ml의 완충액에 다시 현탁시킵니다. 마지막으로, 130GS에서 5분 동안 원심분리하고 펠릿을 접착 배양을 위한 200마이크로리터의 성장 배지에 재현탁시키고, SPHE 배양을 위한 A PDL Lamin ENC 코팅 96웰 플레이트의 각 단일 웰에 있는 세포 200마이크로리터의 세포를 재현탁하고, 성장으로 희석하고, 코팅되지 않은 96웰 플레이트를 통해 웰당 200마이크로리터를 플레이트화한 다음, 6-12개월 후에 5%CO2로 섭씨 37도에서 배양합니다 일수는 정립 광 현미경에 장착된 IP gradi를 사용하여 신경 구체의 직경을 세고 측정합니다.

이 그림은 성체 마우스 전구 세포가 부착 단층 배양 또는 SVZ 및 dg의 신경구로 배양될 수 있음을 보여줍니다. 개별 마우스의 DG에 비해 SVZ에서 훨씬 더 많은 신경구가 생성되는 것으로 보이며, SVZ 및 DG 전구체 세포도 시험관 내 탈분극에 다르게 반응하여 장기적인 강화를 확인합니다. 신경구체는 10개의 통로에 걸쳐 확장되는 것으로 나타났습니다.

신경구는 빨간색에서 볼 수 있듯이 베타 3개의 튜불린 양성 뉴런, 녹색의 GFAP 양성 성상세포, 빨간색의 O 4개의 양성 희소돌기아교세포, 빨간색의 2개의 AB 양성 뉴런으로 분화될 수 있습니다. 이 절차에 따라 여러 세대에 걸쳐 세포 또는 신경구를 포장하거나 신경구를 분화한 후 조직학적 분석을 수행하는 것과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이것은 다중 잠재력 및 장기 잠재력과 같은 추가 질문에 답하는 데 도움이 될 것입니다.