가상 현실 환경을 탐색 마우스의 두 광자 칼슘 이미징

다음 실험의 전반적인 목표는 가상 현실 환경을 탐색하여 생쥐에서 만성 이광자 이미징의 주요 측면을 수행하는 것입니다. 이는 행동하는 마우스에서 빠르고 안정적인 이미징을 위해 이광자 현미경을 수정함으로써 달성됩니다. 다음으로, 이동 추적이 가능한 공기 지원 트레드밀이 설정됩니다.

그런 다음 광 누출을 최소화하기 위해 현미경과 동기화된 LED 프로젝터를 사용하는 가상 현실 환경을 준비합니다. 결과적으로 움직임 아티팩트의 감소, 빛 누출의 감소, 사진 손상 가장자리의 최소화로 인해 양호하고 안정적인 이미지 녹화를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 가상 현실 환경에서 탐색 중 신경 활동을 측정하는 데 사용할 수 있지만 시각적 자극이 필요한 다양한 행동 패러다임에 쉽게 적용할 수도 있습니다.

모든 동물 절차는 Canton Basil sta의 수의학과 지침에 따라 승인되고 수행되었습니다. 이 실험에 사용된 두 개의 광자 현미경은 8kHz 또는 12킬로헤르츠 공진 스캐너와 표준 검류계로 구성된 스캔 헤드로 구성됩니다. 이를 통해 750 x 400 픽셀에서 40 또는 60 헤르츠의 프레임 속도를 가능하게 하고 뇌 움직임으로 인한 이미지 왜곡, 광표백 및 광독성을 줄일

압전 고속 Z 스테퍼는 여러 깊이에서 시간 인터리브 이미지를 순차적으로 획득하는 데 사용됩니다. 기계식 블랭커는 스캔 경로의 턴어라운드 지점에서 조직에 대한 레이저 노출을 줄이는 데 사용되며, 블랭커는 너비를 설정하기 위해 조정할 수 있어야 합니다. 공진 스캐너의 진폭에 따라 내경이 10mm 이상인 공기 공급 튜브를 트레드밀의 볼 홀더에 연결하고 주 공기 공급 장치와 볼 홀더 사이에 BLE 양의 튜브를 배치하여 소음을 줄입니다.

직경 20cm의 폴리스티렌 폼 볼을 맞춤 설계된 3D 프린팅 볼 홀더에 놓습니다. 행동 패러다임이 전진 및 후진 이동만 필요한 경우 공 측면에 19게이지 피하 주사 바늘과 같은 핀을 삽입합니다. 수평 축에서 볼의 움직임을 제한하려면 하나 또는 두 개의 광학 컴퓨터 마우스를 사용하여 각각 두 개 또는 세 개의 축 주위에서 볼의 움직임을 추적합니다.

가상 현실 환경을 준비하려면 LED 프로젝터 또는 LED 백라이트 컴퓨터 화면을 디스플레이에 사용하십시오. 이미징 중 LED가 빠르게 깜박일 수 있도록 게이팅 회로를 통합합니다. 24킬로헤르츠의 깜박임 주파수는 깜박임 융합 임계값보다 훨씬 높으며, 그 이상에서는 동물이 더 이상 깜박임을 감지하지 못합니다.

정확한 깜박임 주파수와 듀티 사이클을 조정하여 프로젝터의 광 출력을 동공 추적을 위한 공진 스캐너의 턴어라운드 포인트와 동기화하고 CMO 기반 비디오 카메라를 사용합니다. 카메라에 적외선 차단 필터가 없는지 확인하십시오. 유전적 칼슘 지시약을 주입하고 두개골 창을 이식한 후 약 2-3주 후에 epi 형광 조명을 사용하여 두개골 창 임플란트의 투명도와 발현을 확인합니다.

명확하게 볼 수 있고 선명하게 정의됩니다. 표재성 혈관의 경계는 창문 임플란트가 하루에서 이틀 후의 이미징에 적합하다는 좋은 표시입니다. 두 광자 실험을 수행하려면 샘플에서 레이저 출력을 측정하고 50밀리와트 미만의 값으로 조정합니다.

그런 다음 구형 트레드밀로 가는 공기 흐름을 켭니다. 다음으로 머리, 구형 러닝 머신에 동물을 고정하십시오. 처음 몇 번은 마우스가 머리가 고정되어 있습니다.

이 과정은 iso 불소로 동물을 잠시 진정시킴으로써 완화 될 수 있습니다. 동물이 절차에 익숙해지면 일반적으로 진정제 없이 장착을 수행할 수 있습니다. 이 과정에서 동물에 대한 스트레스를 최소화하는 것이 중요합니다.

그런 다음 시각적 디스플레이 시스템을 동물에 최대한 가깝게 배치하여 동물에 계속 접근할 수 있도록 합니다. 두개창 임플란트에 먼지가 없는지 확인하고 필요한 경우 물로 세척하고, 차광을 위해 두개창과 물 이멀젼 대물렌즈 사이에 투명한 초음파 젤을 침지 매체로 바릅니다. 대물렌즈와 헤드 바에 검은색 테이프를 감습니다.

가상 환경 경기장을 최종 위치로 이동하고 동공 추적을 위해 비디오 카메라를 조정합니다. 마지막으로, 실험 중에 사용된 스캔 진폭과 일치하도록 레이저 블랭커를 설정하고 실험이 완료되면 데이터 기록을 시작합니다. 해당 기관의 지침에 따라 동물을 안락사시킵니다.

유전적 칼슘 지표로 표지된 세포 집단의 두 광자 칼슘 이미징의 이미지 품질은 바이러스 주입 후 두개창의 투명도를 확인할 때 여기에서 입증된 바와 같이 두개창 임플란트의 품질에 따라 크게 달라지며, 육아 조직이나 뼈 재생이 보이지 않아야 합니다. 또한, 표재성 혈관의 패턴은 변하지 않아야 하며 혈관 구조의 경계는 명확하게 정의되어야 합니다. 동시에 표지된 세포의 BOI는 epi 형광 현미경에서 명확하게 볼 수 있어야 합니다.

이상적으로는, 제제는 마우스의 이동에 의해 유도된 두 광자 이미지의 왜곡이 프레임 등록 후 이미지에서 보이지 않을 만큼 충분히 안정적입니다. 시각 자극 시스템에서 발생하는 빛 누출은 프로젝터의 광 출력을 공진 스캐너의 턴어라운드 포인트까지 정확하게 타이밍을 맞추면 완전히 제거할 수 있습니다. 데이터를 획득하지 못할 때 광원의 깜박임 주파수는 스캔 주파수의 두 배여야 합니다.

이 예에서는 시각적 자극 중 주황색 상자에 표시된 빛 누출의 효과를 설명하기 위해 블랭커를 제거했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 이미징, 마우스 동작, 가상 현실 환경 탐색에서 두 가지를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 여기에 설명된 대로 이미징 및 가상 현실 시스템을 설정하는 것 외에도 이러한 실험에서 성공의 열쇠는 두개창 임플란트 기술을 마스터하는 것입니다.

깨끗한 임플란트는 고품질 이미지와 안정적인 녹음을 위한 전제 조건입니다.