Name: 가상 현실 환경을 탐색 마우스의 두 광자 칼슘 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-20T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 학습하세요 가상 현실 환경에서 탐색하는 마우스의 만성적 두 광자 칼슘 이미징 방법을. 공기 지지 트레드밀과 LED 프로젝터를 활용하여 움직임 아티팩트와 빛 누출을 최소화하고 고품질 신경 활동 측정을 달성하는 안정적인 이미징 설정을 개발합니다.

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이 작품은 생물 의학 연구를위한 프리드리히 Miescher 연구소, 막스 플랑크 사회, 인간 프론티어 과학 프로그램에 의해 지원되었다.

모든 동물의 절차는 승인 광저우 바젤 슈타 트의 수의학 부서의 지침에 따라 수행 하였다. 1. 하드웨어 및 소프트웨어 설치 <ol><li> 두 광자 주사 현미경 설정 : <ol><li> 조명 원 (펄스 폭 &lt;120 FSEC)로 펄스 적외선 레이저를 사용합니다. </li><li> . 8 또는 12 kHz의 공진 스캐너와 표준 검류계 주 구성 스캔 헤드를 사용 :이 750 X 400 픽셀에서 40 또는 60Hz의 프레임 속도를 가능하게한다. 높은 프레임 레이트는 뇌 운동 유도 화상의 왜곡을 최소화하기 위해 중요하다. 또한, 빠른 공진 스캔 높은 신호 수율 결과와 감소는 16 광독성을 photobleaching에. </li><li> 여러 깊이에서 획득 시간 인터리빙 된 이미지를 순차적으로 압전 고속 Z-스테퍼를 사용하여 참고.이 선택 및 프레임 레이트의 희생 데이터 수율을 높이기 위해 사용된다. </li><li> 오전을 사용하여조직에 레이저 노출을 줄이기 echanical 랭커. 스캐너의 공진 진폭에 따라 블 랭커의 폭을 조정 주 :. 인해 공진 스캐너의 스캔 경로의 정현파 성질, 레이저 빔 주사 턴어라운드 점에서 비교적 느린 이동. 레이저 노광이 가장 크다 이러한 턴어라운드 지점에서 조직의 손상을 방지하기 위해, 기계적 랭커는 레이저 빔을 정지 스캔 및 튜브 렌즈 사이의 초점면에 도입된다. </li><li> . 데이터 수집을위한 필드 프로그래머블 게이트 어레이 (FPGA) 주와 함께 고속 디지타이저 (800 메가 헤르츠)를 사용 : FPGA 고역 통과 필터 및 화소로 PMT 신호 궤. 대역 통과 필터의 PMT 증폭기 결과에 FPGA 및 효과적인 저역 통과 필터의 고역 통과 필터의 조합은 대략 레이저 (80 메가 헤르츠)의 반복률을 중심. 샘플 FPGA 코드는 보충 교재로 제공된다. </li></ol></li><li> Dombeck 및 동료의 디자인을 기반으로 항공 지원 디딜 방아 설치 2 <ol><li> 적어도 10mm 내경의 공기 공급 튜브를 이용하여 공기 공급관로 볼 홀더를 연결한다. 볼 홀더 급기 입구의 단면적을 최대화하고 메인 급기와 볼 홀더 주 사이 튜브의 충분한 양을 넣. 증가 단면과 공기 공급 튜브의 증가 된 길이는 소음 발생을 감소시킨다. </li><li> 맞춤 설계 및 3D 인쇄 볼 홀더에 스티로폼 볼 (20cm 직경)를 놓습니다. </li><li> 행동 패러다임은 앞으로 (뒤로) 운동이 필요한 경우, 볼의 측면에 핀 (예를 들어, 19 G 피하 주사 바늘)를 삽입하여 수평 (피치) 축에 공의 움직임을 제한 참고 :. 일반적으로 동물에 적응 이 감소 회전 패러다임에서 훨씬 빨리 설치. </li><li> 하나 또는 두 개의 광학 컴퓨터 마우스를 사용하여 공의 궤도 운동각각 두 개의 주위에 운동 또는 세 축 모두를 감지 할 수 있습니다 :. 컴퓨터 마우스 이상적 이미징 이상 간섭 적외선 다이오드와 함께 작동해야합니다. </li></ol></li><li> 가상 현실 환경 설정 <ol><li> 가상 현실 환경을 준비합니다 :. Panda3D를, 자유롭게 사용 가능한 게임 엔진을 기반으로 샘플 환경을 보충 교재로 제공된다. 가상 환경의 목적은 Wings3D, 오픈 소스 3D 모델링을 사용하여 생성됩니다. 샘플 프로그램 데이터 수집 카드에 위치 정보를 판독하고, 가상 환경에서 운동으로 이러한 변환한다. 코드는 또한 토 로이드 형 스크린 상에 투영되는 환경에 필요한 비선형 변환을 수행한다. 토 로이드 형 화면의 상세한 구성 밖에도 14, 17 설명되었다. </li><li> 가상 환경을 표시하는 LED 프로젝터 또는 LED 백라이트 컴퓨터 화면을 사용합니다. 게이팅 CIR 통합. 촬상 주 동안 LED의 빠른 플리커위한 CUIT : 시각 자극 동안 두 광자 이미징 본질적인 문제는 대물 차폐함으로써 감소 될 수있는 시각적 자극 시스템에서 발생하는 광 누설이다. 이미징 동안 시각적 인 자극에 사용되는 LED 무대와 함께 이루어집니다 그러나, 시각적 자극 시스템에서 빛 누수가 완전히 (데이터가 수집되지 않음) 공진 스캐너의 선회 지점에 프로젝터의 빛 출력을 동기화하여 폐지 할 수있다 초파리 18. 이 시각적 인 자극 및 데이터 수집의 효과적인 고속 교대 (그림 2 참조)가 발생합니다. 플리커 주파수 (24 ㎑의) 깜빡 거림이 더 이상 동물에 의해 감지되지 않는 이상, 플리커 융합 임계 값 이상 규모의 명령입니다. 시판 LED 프로젝터에 본 변형의 전자 회로도가도 3에 도시된다. </li></ol></li><li> 새끼를 낳다일리노이 추적 <ol><li> 동공 위치 추적을위한 CMOS 기반의 비디오 카메라 (30 fps)를 사용합니다. 카메라가 적외선 차단 필터를 포함하지 않는 있는지 확인하십시오 :. 학생 인해 눈을 통해 나오는 두 광자 여기 레이저에서 미광에 녹음하는 동안 높은 반면에 볼 수 있습니다. 학생의 위치와 직경은 Sakatani와 사 (19)의 디자인을 기반으로 사용자 정의 프로그래밍 소프트웨어를 사용하여 실시간으로 추출된다. </li></ol></li></ol> 2. 유전 칼슘 표시기 및 창 임플란트의 주입 이전에 다음과 같은 추가 설명 된 바와 같이 칼슘 표시기 (20)와 두개골 창 (21)의 주입의 주입이 수행된다 : <ol><li> 바이러스 용액을 채워서 및 압력 분사 시스템에 연결된 유리 주입 피펫을 이용하여 관심 영역에 바이러스를 주입. 피펫에 따라 압력을 조정 안직경, 일반적으로 약. 70-140 밀리바, 1 ~ 2 분에 걸쳐 바이러스 솔루션의 약 100 NL을 주입한다. 저주파 (2 Hz에서 0.05 초 펄스)에 전달 저용량 분사 펄스는 주사 동안 피펫 따라 바이러스의 오버 플로우를 방지하기 위해 사용되어야한다 참고. 주입량을 모니터하기 위해, 피펫은 소규모로 표시 될 수있다 , 스테레오 현미경 균등 길이 (예 : 0.5 mm). 마킹 사이의 메 니스 커스의 변위는 주입 부피를 추정하는데 사용될 수있다. </li><li> 몇 주 후 주입이 약 500 μm의 직경과 밀도가 표지 세포의 알약 발생한다. 또한 지역 GECI 발현 효능 GECI 프로모터 및 배합의 선택뿐만 아니라, 전염성 역가 및 사용 재조합 AAV의 혈청 형에 따라 주 :. 대표적인 예로서, AAV2/1-EF1α-GCaMP5의 분사 바이러스 가슴만족스러운 표정에 마우스 결과의 일차 시각 피질에 8 × 10 12 GC / ㎖ 어에는 약 2 주 동안 주사 (그림 1)을 배치한다. </li><li> 헤드 바는 마우스의 시야를 방해하지 말고 행동하는 동안 안정된 영상을 허용 할 정도로 단단해야한다. 이것은 일반적으로 머리 바의 양쪽에 부착 2 점 (그림 1 참조)이 필요합니다. 단단히 두개골에 머리 막대를 연결하려면, 머리 막대가 첨부됩니다 노출 된 두개골의 영역을 극대화하고 건조해야합니다. 또한, 메스 나 주사기를 사용함으로써 접착에 대한 표면적을 증가 표면 홈을 만들 두개골 긁힐. 치과 용 시멘트로 머리 줄을 연결하기 전에 시아 노 아크릴 레이트 조직 접착제로 뼈를 커버. </li></ol> 3. 실험 절차 <ol><li> 바이러스 주입 다음 2 ~ 3 주를, 에피에서 선명도와 표현의 두개골 창 임플란트를 확인형광 조명. 표재성 혈관 분명히 가시적이고 선명하게 정의 경계 윈도우 임플란트 (도 1 참조) 이미징에 적합 함 좋은 지표이다. </li><li> 측정 시료에 50 mW의 이하 값으로 레이저 파워를 조정한다. </li><li> 구형 디딜 방아로의 공기 흐름을 켭니다. </li><li> 현미경으로 머리 고정을 위해, 간단하게 스트레스를 줄이기 위해 이소 플루 란과 동물을 마취. 이소 플루 란 마취 용기에 동물을 배치하고 동물 정지가 (약 10 초) 이동 때까지 기다립니다. 동물을 제거하고 즉시 머리 현미경으로 고정합니다. </li><li> 여전히 동물에 대한 액세스를 허용하는 동물에 최대한 가까운 영상 표시 시스템을 배치합니다. 이하 가시 동물 실험으로, 적은 동물은 실험의 초기 단계에서 강조 될 것이다 갖는다. </li><li> 두개골 창 임플란트는 먼지와 먼지가 묻어 있는지 확인합니다. 물 청소필요한 경우. </li><li> 두개골 창 및 물 침수 목표 사이의 침수 매체로 명확한 초음파 젤을 적용합니다. 이는 수분 증발 또는 누설 느린 이미지 저하의 문제를 해결하고 물을 잡아 머리 줄에 콘을 장착 할 필요가 완화 참고 :. 원심 분리기 젤을하기 전에 모든 공기 방울을 제거하고 공기를 생성하지 않도록주의하는 사용 젤을 적용하는 동안 거품. 기포가 심하게 화질을 저하시킬 수있다. </li><li> 차광을위한 목적과 머리 바 주위에 검은 색 테이프의 조각을 감싸십시오. </li><li> 최종 위치로 가상 환경 분야를 이동하고 동공 추적을위한 비디오 카메라를 조정합니다. </li><li> 실험 동안에 사용 스캔 진폭과 일치하도록 레이저 블 랭커를 설정한다. </li><li> 데이터 기록을 시작합니다. </li></ol>

<ol><li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Miniature+Head-Mounted+Two-Photon+MicroscopeHigh-Resolution+Brain+Imaging+in+Freely+Moving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals.</a> Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice-specific+sequences+in+parietal+cortex+during+a+virtual-navigation+decision+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task.</a> Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).</li>
<li>Huber, D., Gutnisky, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li>
<li>Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+mismatch+signals+in+primary+visual+cortex+of+the+behaving+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse.</a> Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).</li>
<li>Akerboom, J., Chen, T. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., Araki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators.</a> Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).</li>
<li>Mittmann, W., Wallace, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).</li>
<li>Katona, G., Szalay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+in+vivo+imaging+with+three-dimensional+random-access+scanning+in+large+tissue+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.</a> Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).</li>
<li>Mank, M., Santos, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li>
<li>Margolis, D. J., Lütcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+cortical+population+activity+imaged+throughout+long-term+sensory+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation.</a> Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).</li>
<li>Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li>
<li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li>
<li>Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats+are+able+to+navigate+in+virtual+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rats are able to navigate in virtual environments.</a> J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).</li>
<li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRT+letter%3A+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching).</a> Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li>
<li>Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+Reality+for+Mice%2C+mousevr.blogspot.com%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com.</a> Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).</li>
<li>Sakatani, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+spontaneous+saccade-like+rapid+eye+movements+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice.</a> Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).</li>
<li>Golshani, P., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+2-photon+calcium+imaging+in+layer+2%2F3+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice.</a> J. Vis. Exp. (13), (2008).</li>
<li>Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+spatial+navigation+in+the+medial+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

행동 두 광자 이미징의 성공의 열쇠는 두 가지 방법으로 제제의 안정성 : <ol><li> 일 포스트 창 주입의 과정을 통해, 조직의 염증 반응은 육아 조직 및 방해 또는 영상을 방지 할 수 연골의 형성의 향상으로 이어질 수 있습니다. </li><li> 실험 기간 동안 뇌는 신경 활동과 관련된 형광 신호를 손상시키지 모션 아티팩트를 방지하기 위해 충분히 안정되어 있습니다. </li></ol> 두개골 창 이식 수술이 빨리 뇌에 가능 직접 손상으로 실시해야 최소한으로 염증성 면역 반응을 유지하기 위해 어떤 희생을 치르더라도 피해야한다. 가장 중요 두개 창 임플란트는 염증을 방지하기 위해 실험 전체 기간에 대한 기밀 유지되도록하는 것이다. 뇌의 움직임을 최소화하기 위해 관련 영상 유물이 손상되지 않도록주의를 취하거나수술시 경막을 제거합니다. 남은 운동 유도 뇌 운동 모션이 결상면 (X / Y 평면)에 평행 한 평면에 한정되는 경우에 ...

(유전자 GCaMP5 7 R-GECO 8, OGB 또는 Fluo4 같은 합성 염료와 같은 인코딩) 칼슘 지표의 두 광자 영상은 쥐에게 1-6 행동에 신경 활동을 측정하는 강력한 방법으로 떠오르고있다. 약 800 μm의 뇌 표면 9,10 아래까지 거의 하나의 활동 전위 해상도에서 수백 개의 셀의 활동의 동시 측정을 가능하게합니다. 또한, 유전자에 의해 코딩 칼슘 지표 (GECIs)하여 신경 활성 만성적 5,11,12을 측정 할 수 있고, 유 전적으로 정의 세포 유형 13. 함께,이 방법은 생체 내에서 신경 계산의 연구에 새로운 가능성의 군중을 열어 시간과 공간 해상도의 정도를 제공합니다. 외과 적 수술은 이미지에 마우스 뇌를 노출하고 레이블 할 필요가있다. 셀은 일반적으로 재조합 아데노 - 관련 비르를 사용하여 형질<html> GECI 배송 및 두개골 창 우리 (AAV) 시스템은 뇌에 광 액세스를 얻기 위해 주사 부위에 주입된다. 헤드 바는 다음 두 광자 현미경으로 머리 고정 용 두개골에 부착된다. 웨이크 이미징 문제의 대부분은 제조에서 불안정성으로부터 발생으로 다음 단계의 설계 및 구현은 중요하다. 이상적으로 여기에 기술 된 절차는 수술 후 수개월까지의 만성 이미징을 허용한다. 두 광자 이미징 동안 시각적으로 유도 동작을 사용하려면, 머리 고정 마우스는 가상 현실 환경을 탐색하는 데 사용할 수있는 공기를 지원하는 구형 디딜 방아에 앉아있다. 트레드밀 마우스 운동력은 마우스 14,15를 둘러싼 환형 화면에 표시되는 가상 환경으로의 이동에 연결된다. 그러한 운동, 시각적 자극과 동공 위치와 같은 행동 변수가 6을 기록 할 수있다. t는 &quot;&gt; 우리는 가상 현실 환경을 탐험 생쥐의 만성 두 광자 이미징에 관련된 절차에 대해 설명합니다 해결하는 핵심 사항은 다음과 같습니다. 운동 유물의 감소, 빛 누수의 감소를 동시에 기록 세포의 수의 최대화 및 최소화 사진을 손상. 우리는 또한 공중 지원 디딜 방아, 눈동자 추적, 가상 현실 환경을 설정하는 방법에 대한 세부 사항을 제공합니다. 여기에서 설명하는 절차는 행동 패러다임의 잠재적 다양한 머리 고정 생쥐의 형광 표지 세포 인구 이미징 사용할 수 있습니다 .

<table><tbody><tr><td>커버 슬립 (직경 = 3-5 mm)</td><td>Menzel</td><td></td><td>창 임플란트</td></tr><tr><td>InSight DeepSee 레이저</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>현미경</td></tr><tr><td>12kHz 공진 스캐너</td><td>Cambridge Technology</td><td>G1-003-30026</td><td>현미경</td></tr><tr><td>갈보미터</td><td>Cambridge Technology</td><td>G6215H</td><td>현미경</td></tr><tr><td>디지타이저</td><td>National Instruments</td><td>NI 5772</td><td>microscope</td></tr><tr><td>FPGA</td><td>National Instruments</td><td>PXIe 7965R</td><td>현미경</td></tr><tr><td>수집 카드</td><td>National Instruments</td><td>PCIe 6363</td><td>현미경</td></tr><tr><td>방출 필터 525/50</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td>현미경</td></tr><tr><td>압전 z-drive</td><td>Physikinstrumente</td><td>P-726.1CD</td><td>현미경</td></tr><tr><td>컨트롤러 압전 드라이브</td><td>Physikinstrumente</td><td>E665 LVPZT</td><td>현미경</td></tr><tr><td>대물렌즈 16X, 0.8NA</td><td>Nikon</td><td>CFI75</td><td></td></tr><tr><td>현미경 전류 증폭기</td><td>Femto</td><td>DHPCA-100</td><td>현미경</td></tr><tr><td>광전자 증배관</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>현미경</td></tr><tr><td>USB 카메라 IR 필터 없음</td><td>이미징소스</td><td>DMK22BUC03</td><td>동공 추적</td></tr><tr><td>대물렌즈 50mm</td><td>ImagingSource</td><td>M5018-MP</td><td>동공 추적</td></tr><tr><td>매크로 어댑터 링</td><td>ImagingSource</td><td>LAexSet</td><td>동공 추적</td></tr><tr><td>광학 컴퓨터 마우스</td><td>Logitech</td><td>G500</td><td>모션 추적</td></tr><tr><td>스티로폼 공 20cm</td><td>예: idee-shop.de</td><td>08797.00.15</td><td>가상 환경</td></tr><tr><td>LED 프로젝터</td><td>Samsung</td><td>SP-F10M</td><td>가상 환경</td></tr><tr><td>수집 카드</td><td>National Instruments</td><td>NI 6009</td><td>가상 환경</td></tr><tr><td>Panda3D 게임 엔진</td><td></td><td><a href="http://www.panda3d.org/">www.panda3d.org</a></td><td>가상 환경</td></tr><tr><td>Python</td><td></td>용 Numpy 라이브러리<td><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td><td>가상 환경</td></tr><tr><td>Scipy Python용 라이브러리</td><td><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td><td>가상 환경</td>NI-DAQmx 드라이버 National Instruments<a href="http://www.ni.com/">www.ni.com</a>가상 환경 초음파 젤 Dahlhausen 5701.0342.10 이미징 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

가상 현실 환경을 탐색 마우스의 두 광자 칼슘 이미징

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

이 동작을 1-6 동안 유전자 식별 세포의 활동의 만성 측정을 허용하는 최근 몇 년 동안, 두 광자 이미징, 신경 과학에서 매우 중요한 도구가되고있다. 여기서 우리는 동물이 가상 현실 환경을 탐색하는 동안 마우스 피질에서 두 광자 이미징을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 밝은 조명을 가상 환경에서 행동하는 동물 이미징 열쇠입니다 실험 절차의 측면에 초점을 맞추고있다. 우리가 여기에 주소가이 실험 장치에서 발생하는 주요 문제 : 뇌 운동 관련 유물을 최소화 가상 현실 프로젝션 시스템에서 빛의 누출을 최소화하고, 레이저 유도 조직의 손상을 최소화. 또한 가상 현실 환경을 제어하고 동공 추적 할 샘플 소프트웨어를 제공한다. 이러한 절차 및 그와는 생쥐 행동에 사용하기위한 종래 이광자 현미경으로 변환 할 수 있어야한다.

GECI로 표지 된 세포 집단의 2 광자 칼슘 이미징 화질은 크게 두개 창 임플란트의 품질에 의존한다. 바이러스 주입에게 두개골 창을 다음과 같은 두 주 동안 명확성을 위해 검사를해야한다. 더 육아 조직 또는 뼈의 재성장 표시 (그림 1A)이 없어야합니다. 더욱이, 표재성 혈관의 패턴은 변경되지 않고 남아 있어야하고 혈관의 경계가 선명하게 정의되어야한다. 동시에 GECI 발현도 확인할 수있다. 표지 세포의 리바 르주 구 아야나시 마 탄은 표면 형광 현미경 (그림 1B)에서 명확하게 볼 수 있어야합니다. 이상적으로 준비는 충분히 쥐의 운동에 의해 유도 된 두 광자 이미지의 왜곡 프레임 등록 (그림 2) 후 이미지에 표시되지 않도록 안정적이다. 공명 스캐너의 스캔 경로는 비선형 이미지 왜곡의 결과 사인입니다. TU 중rnaround 포인트 데이터로 인해 스캔 경로의이 부분에서 스트레칭 이미...

여기에서 우리는 가상 현실 환경에서 동작하는 동안 마우스 피질의 두 광자 영상에 포함 된 실험 절차에 대해 설명합니다.

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

다음 실험의 전반적인 목표는 가상 현실 환경을 탐색하여 생쥐에서 만성 이광자 이미징의 주요 측면을 수행하는 것입니다. 이는 행동하는 마우스에서 빠르고 안정적인 이미징을 위해 이광자 현미경을 수정함으로써 달성됩니다. 다음으로, 이동 추적이 가능한 공기 지원 트레드밀이 설정됩니다.그런 다음 광 누출을 최소화하기 위해 현미경과 동기화된 LED 프로젝터를 사용하는 가상 현실 환경을 준비합니다. 결과적으로 움직임 아티팩트의 감소, 빛 누출의 감소, 사진 손상 가장자리의 최소화로 인해 양호하고 안정적인 이미지 녹화를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 가상 현실 환경에서 탐색 중 신경 활동을 측정하는 데 사용할 수 있지만 시각적 자극이 필요한 다양한 행동 패러다임에 쉽게 적용할 수도 있습니다.모든 동물 절차는 Canton Basil sta의 수의학과 지침에 따라 승인되고 수행되었습니다. 이 실험에 사용된 두 개의 광자 현미경은 8kHz 또는 12킬로헤르츠 공진 스캐너와 표준 검류계로 구성된 스캔 헤드로 구성됩니다. 이를 통해 750 x 400 픽셀에서 40 또는 60 헤르츠의 프레임 속도를 가능하게 하고 뇌 움직임으로 인한 이미지 왜곡, 광표백 및 광독성을 줄일 수 있습니다.압전 고속 Z 스테퍼는 여러 깊이에서 시간 인터리브 이미지를 순차적으로 획득하는 데 사용됩니다. 기계식 블랭커는 스캔 경로의 턴어라운드 지점에서 조직에 대한 레이저 노출을 줄이는 데 사용되며, 블랭커는 너비를 설정하기 위해 조정할 수 있어야 합니다. 공진 스캐너의 진폭에 따라 내경이 10mm 이상인 공기 공급 튜브를 트레드밀의 볼 홀더에 연결하고 주 공기 공급 장치와 볼 홀더 사이에 BLE 양의 튜브를 배치하여 소음을 줄입니다.직경 20cm의 폴리스티렌 폼 볼을 맞춤 설계된 3D 프린팅 볼 홀더에 놓습니다. 행동 패러다임이 전진 및 후진 이동만 필요한 경우 공 측면에 19게이지 피하 주사 바늘과 같은 핀을 삽입합니다. 수평 축에서 볼의 움직임을 제한하려면 하나 또는 두 개의 광학 컴퓨터 마우스를 사용하여 각각 두 개 또는 세 개의 축 주위에서 볼의 움직임을 추적합니다.가상 현실 환경을 준비하려면 LED 프로젝터 또는 LED 백라이트 컴퓨터 화면을 디스플레이에 사용하십시오. 이미징 중 LED가 빠르게 깜박일 수 있도록 게이팅 회로를 통합합니다. 24킬로헤르츠의 깜박임 주파수는 깜박임 융합 임계값보다 훨씬 높으며, 그 이상에서는 동물이 더 이상 깜박임을 감지하지 못합니다.정확한 깜박임 주파수와 듀티 사이클을 조정하여 프로젝터의 광 출력을 동공 추적을 위한 공진 스캐너의 턴어라운드 포인트와 동기화하고 CMO 기반 비디오 카메라를 사용합니다. 카메라에 적외선 차단 필터가 없는지 확인하십시오. 유전적 칼슘 지시약을 주입하고 두개골 창을 이식한 후 약 2-3주 후에 epi 형광 조명을 사용하여 두개골 창 임플란트의 투명도와 발현을 확인합니다.명확하게 볼 수 있고 선명하게 정의됩니다. 표재성 혈관의 경계는 창문 임플란트가 하루에서 이틀 후의 이미징에 적합하다는 좋은 표시입니다. 두 광자 실험을 수행하려면 샘플에서 레이저 출력을 측정하고 50밀리와트 미만의 값으로 조정합니다.그런 다음 구형 트레드밀로 가는 공기 흐름을 켭니다. 다음으로 머리, 구형 러닝 머신에 동물을 고정하십시오. 처음 몇 번은 마우스가 머리가 고정되어 있습니다.이 과정은 iso 불소로 동물을 잠시 진정시킴으로써 완화 될 수 있습니다. 동물이 절차에 익숙해지면 일반적으로 진정제 없이 장착을 수행할 수 있습니다. 이 과정에서 동물에 대한 스트레스를 최소화하는 것이 중요합니다.그런 다음 시각적 디스플레이 시스템을 동물에 최대한 가깝게 배치하여 동물에 계속 접근할 수 있도록 합니다. 두개창 임플란트에 먼지가 없는지 확인하고 필요한 경우 물로 세척하고, 차광을 위해 두개창과 물 이멀젼 대물렌즈 사이에 투명한 초음파 젤을 침지 매체로 바릅니다. 대물렌즈와 헤드 바에 검은색 테이프를 감습니다.가상 환경 경기장을 최종 위치로 이동하고 동공 추적을 위해 비디오 카메라를 조정합니다. 마지막으로, 실험 중에 사용된 스캔 진폭과 일치하도록 레이저 블랭커를 설정하고 실험이 완료되면 데이터 기록을 시작합니다. 해당 기관의 지침에 따라 동물을 안락사시킵니다.유전적 칼슘 지표로 표지된 세포 집단의 두 광자 칼슘 이미징의 이미지 품질은 바이러스 주입 후 두개창의 투명도를 확인할 때 여기에서 입증된 바와 같이 두개창 임플란트의 품질에 따라 크게 달라지며, 육아 조직이나 뼈 재생이 보이지 않아야 합니다. 또한, 표재성 혈관의 패턴은 변하지 않아야 하며 혈관 구조의 경계는 명확하게 정의되어야 합니다. 동시에 표지된 세포의 BOI는 epi 형광 현미경에서 명확하게 볼 수 있어야 합니다.이상적으로는, 제제는 마우스의 이동에 의해 유도된 두 광자 이미지의 왜곡이 프레임 등록 후 이미지에서 보이지 않을 만큼 충분히 안정적입니다. 시각 자극 시스템에서 발생하는 빛 누출은 프로젝터의 광 출력을 공진 스캐너의 턴어라운드 포인트까지 정확하게 타이밍을 맞추면 완전히 제거할 수 있습니다. 데이터를 획득하지 못할 때 광원의 깜박임 주파수는 스캔 주파수의 두 배여야 합니다.이 예에서는 시각적 자극 중 주황색 상자에 표시된 빛 누출의 효과를 설명하기 위해 블랭커를 제거했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 이미징, 마우스 동작, 가상 현실 환경 탐색에서 두 가지를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 여기에 설명된 대로 이미징 및 가상 현실 시스템을 설정하는 것 외에도 이러한 실험에서 성공의 열쇠는 두개창 임플란트 기술을 마스터하는 것입니다.깨끗한 임플란트는 고품질 이미지와 안정적인 녹음을 위한 전제 조건입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

네크로 텍스의 microcircuits의 네트워크 역학을 이해하기 위해서는 동시에 뉴런의 다수의 활동을 기록하는 것이 필수적입니다. - 생체내에서 두 광자 칼슘 이미징 하나는 단일 셀 해상도 고밀도의 연결 인구의 활동을 기록하는 수있는 유일한 방법입니다.

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

출처: Maruoka, H., et. al. 깨어 있는 쥐의 미세아교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징.J. Vis. Exp. (2022) 이 비디오는 시각적 자극 중 깨어 있는 쥐의 신경 활동과 미세아교세포 역학을 이미징하기 위한 이광자 현미경 절차를 보여주며 칼슘 과도 및 세포 상호 작용을 강조합니다.

깨어 있는 쥐에서 미세아교세포의 역학과 신경 활동의 동시 이미징(Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse)

출처: Lee, H. et. al., Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Vihaving Mouse(자유롭게 행동하는 마우스의 편도체에서 헤드 마운트 소형 현미경을 사용한 성공적인 생체 내 칼슘 이미징). J. Vis. Exp. (2020)이 비디오는 구배 굴절률 또는 GRIN 렌즈와 소형 현미경을 사용하여 마우스의 생체 내 칼슘 이미징을 보여줍니다. 이 설정은 마찰이 없는 이동식 케이지 시스템 내에서 머리를 고정하여 뉴런을 자극하고 칼슘 이온 유입을 유발합니다. GRIN 렌즈는 뇌의 칼슘 신호를 포착하여 신경 활동을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

자유롭게 움직이는 마우스의 실시간 미세내시경 칼슘 이미징

출처: Thapa, R., et. al., 심부 뇌를 위한 입체성 바이러스 주입 및 그라디언트 인덱스 렌즈 이식 생체 내 칼슘 이미징.  J. Vis. Exp. (2021)이 비디오는 형질주입된 쥐의 미니스코프를 사용하여 뉴런 활동과 행동을 연관시키는 실시간 칼슘 이미징을 보여줍니다.

Miniscope를 사용한 쥐 내측 전전두엽 피질의 실시간 칼슘 이미징

이 비디오는 Thy1-GFP 형질전환 라인에서 생체 내 2광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 mCherry 발현 아데노 관련 바이러스를 배측 해마에 주입하는 것과 결합됩니다. 이러한 기술을 통해 RSC에서 경험 의존적 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

우리는 복부 측에서 성인 마우스의 뇌간을 노출하는 프로토콜을 제시합니다. 소형 현미경을 가진 그라데이션 굴절 지수 렌즈를 사용하여, 칼슘 화상 진찰은 생체 내의 열등한 올리브 신경 소마타의 활동을 검사하기 위하여 이용될 수 있습니다.

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

Miniscope in vivo 칼슘 이미징은 자유롭게 행동하는 마우스에서 신경 역학과 미세 회로를 연구하는 강력한 기술입니다. 이 프로토콜은 미니 스코프를 사용하여 좋은 생체 내 칼슘 이미징을 달성하기 위해 뇌 수술을 수행하는 것을 설명합니다.

입체 택시 바이러스 주입 및 생체 내 심부 뇌를위한 그라디언트 인덱스 렌즈 이식

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

본 프로토콜은 식품 랩, 투명 실리콘 및 커버 유리를 사용하여 큰(6 x 3 mm2) 두개골 창을 만드는 방법을 설명합니다. 이 두개골 창은 동일한 마우스에서 생체 내 광시야 및 2광자 칼슘 이미징 실험을 허용합니다.

생체 내 큰 두개골 창을 사용한 마우스의 광시야 및 2광자 칼슘 이미징

여기에서는 가상 현실(VR)을 사용하여 마우스 공간 학습을 조사하기 위한 간소화된 오픈 소스 하드웨어 및 소프트웨어 설정을 제시합니다. 이 시스템은 마이크로 컨트롤러 네트워크와 사용하기 쉬운 Python 그래픽 소프트웨어 패키지를 실행하는 단일 기판 컴퓨터를 활용하여 휠에서 실행되는 머리 구속 마우스에 대한 가상 선형 트랙을 표시합니다.

머리가 구속된 마우스의 공간 학습 측정을 위한 오픈 소스 가상 현실 시스템An open-source virtual reality system for the measurement of spatial learning in head-trained mice

이 프로토콜은 야생형 마우스에서 피질을 그대로 유지하면서 이광자 현미경으로 단일 뉴런 활동을 이미징하고 부분 피질 돌연변이 마우스에서 광시야 현미경으로 전체 SC를 이미징하는 것을 포함하여 깨어 있는 마우스의 상구(SC)에서 칼슘 반응을 이미징하는 절차를 자세히 설명합니다.

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

학습하세요 가상 현실 환경에서 탐색하는 마우스의 만성적 두 광자 칼슘 이미징 방법을. 공기 지지 트레드밀과 LED 프로젝터를 활용하여 움직임 아티팩트와 빛 누출을 최소화하고 고품질 신경 활동 측정을 달성하는 안정적인 이미징 설정을 개발합니다.

가상 현실 환경을 탐색 마우스의 두 광자 칼슘 이미징

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