Name: 동시에 두 광자 생체 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 45 s
Description: 학습하세요 생쥐 후방대상피질에서 두 광자 현미경을 이용한 뉴런의 만성 이미징 방법을. mCherry 발현 아데노관련바이러스 주입과 두개골창 삽입을 통해 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

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저자는 촬영에 도움을 음성 녹음, 그림에 대한 M. Borczyk, 바이러스 생산을위한 A. Trąbczyńska, 유전자형에 대한 M. Ziókowska 및 A. Mirgos에 대한 M. Steczkowski에게 감사의 말씀을 전합니다. KR은 K. Deisseroth에서 CaMK 프로모터의 제어하에 형광 단백질 mCherry을 표현하는 재조합 아데노 관련 바이러스 (rAAV)의 종류 선물을 인정합니다. 이 프로젝트는 유럽 연합 (EU)에 의해 재정 CEPT ​​인프라를 사용하여, 조직의 구조와 기능, 신경 생물학, 실험 생물학의 Nencki 연구소의 센터의 동물 모델 및 연구소의 실험실의 핵심 시설에서 수행 한 - 유럽 지역 개발 기금 내를 2,007에서 2,013 사이의 운영 프로그램 &quot;혁신 경제&quot;. 이 작품은 국립 과학 센터에서 보조금에 의해 지원되었다 : 소나타 비스 2012 / 05 / E / NZ4 / 0299​​6, 하모니아 2013 / 08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013 / 08 / W / KR과 소나타 비스 2014 NZ24 / 00691 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC에

아래에 설명 된 모든 실험 절차는 실험 생물학의 Nencki 연구소, 과학 폴란드어 아카데미에서 현지 윤리위원회에 의해 승인되었다. 참고 : 관련 동영상의 장면 중 일부는 가속된다. 속도 계수는이 장면에 표시됩니다. 1. 수술 준비 <ol><li> 오토 클레이브에 액체와 면봉을위한 모든 도구, 유리 용기를 소독. 비용 소비 장갑을 사용합니다. 수술 테이블, 정위 프레임과 70 % 에탄올 모든 주변 지역을 청소합니다. 모든 살균 장비에 대한 멸균 공간을 만들기 위해 무균 수술 패드를 사용합니다. 작은 조각으로 gelfoam을 잘라 및 멸균 식염수를 흡수. 참고 : 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따르면, 에탄올 멸균이나 높은 수준의 소독제도 아니다. 그것은 단지 이전에 멸균 표면 세정 / 탈지 화제로서 사용되어야한다. </li><li> 일에 동물을 넣어전자 유도 챔버 / 분 2 L의 5 % 이소 플루 란 레벨 및 산소의 흐름을 설정한다. 이 절차는 약 3 분 정도 소요됩니다. </li><li> 유도 챔버에서 동물을 가져 가라. 동물이 완전히 진정되었는지 확인하기 위해 꼬리 또는 발가락 핀치를 사용합니다. </li><li> 정밀 트리머가 눈까지 (귀 사이) 머리의 뒤쪽에서 머리를 면도 사용. </li><li> 정위 프레임에 동물을 배치하고 귀 막대 머리를 안정. </li><li> 1.5 %의 이소 플루 란과 0.3 L / 분 산소 마취 수준을 설정합니다. </li><li> 눈 연고를 적용합니다. </li><li> 각각, 염증, 통증 및 감염을 예방하기 Tolfedine (4 ㎎ / ㎏) Butomidor (2 밀리그램 / kg) 및 Baytril (5 ㎎ / ㎏)을 동물에 피하 주입한다. </li><li> 뇌 부종을 방지하기 위해 덱사메타손과 동물의 근육 (0.2 ㎎ / ㎏)을 주입한다. 주 : 덱사메타손 피하 주사 또는 복강 내 근육의 손상을 방지 할 수있다. </li><li> (S)를 이용하여 피부를 닦아Betadine와 terile 면봉은 70 % 에탄올 하였다. </li><li> 장갑을 변경하고 70 % 에탄올로 스프레이. 참고 : 멸균 필드를 터치하지 않는 일회용 장갑을 사용하는 동안. 단지 무균 수술기구 및 멸균 면봉의 팁 동물을 터치합니다. </li></ol> 2. 두개골 창 외과 <ol><li> 집게로 피부를 들어 올려 마이크로 가위가 눈의 앞 지점에 비스듬히 다음 머리의 기본을 따라 수평으로 피부를 절개하고 사용. 피부 플랩을 제거합니다. </li><li> 과도한 출혈과 통증을 방지하기 위해 골막에 멸균 면봉으로 리도카인 연고를 적용합니다. </li><li> 골막을 제거하기 위해 멸균 면봉이나 메스를 사용합니다. 멸균 면봉와 두개골을 건조. </li><li> 멸균 된 바늘을 사용하여 그들을 고정하고 치과 용 시멘트와의 접촉을 방지하기 위해 피부의 가장자리에 밀도 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용합니다. 접착제가 마를 때까지 기다립니다. </li><li> t 이상 멸균 3mm의 커브 글라스를하다lambdoid 봉합에 전방 그는 두개골. RSC에서 커버 슬립을 중심 좌표 : AP, 브레 그마 -2.8; ML은 멸균 된 바늘로 두개골 표면을 긁어서 0 표 커버 슬립의 가장자리를 정수리. 70 % 에탄올로 멸균 용기에 다시 커브 글라스를 넣습니다. </li><li> 3mm 직경의 원형 윤곽을 소경으로 버어 고속 치과 드릴을 사용한다. 멸균 식염수에 담근 면봉와 뼈 먼지 드릴링 사이트를 청소합니다. 가끔 출혈을 중지하고 뼈를 청소 gelfoam을하고 면봉을 사용합니다. </li><li> 드릴링 사이에서 부드럽게 뼈 원을 터치하고 이동성을 확인하여 미세 집게로 뼈의 두께를 확인합니다. 뼈 봉합의 지역에 두꺼운 있음을 알아 두셔야합니다. 뼈 원 모바일이며 뼈의에도 얇은 층 주상에 남아있는 경우 드릴링 중지. 식염수 담근 면봉에 남아있는 모든 뼈 먼지의 작동 필드를 청소합니다. </li><li> 드릴 CIR을 포함, 시추 지역에 멸균 생리 식염수를 삭제CLE. 조심스럽게 부드럽게 한 다음 미세 집게와 함께 뼈 원을 올립니다 단단히 위쪽으로 들어 올려 뼈를 제거합니다. 경질의 손상을 방지하기 위해 그것을 해제하는 동안 뼈 원을 왜곡하지 않도록주의하십시오. </li><li> 조심스럽게 출혈을 멈추게하기 위해 경질에 멸균 생리 식염수에 담가 gelfoam을 적용 할 수 있습니다. 모든 출혈이 완전히 중지 될 때까지 기다립니다. 조심스럽게 응고 과정을 방해하지 gelfoam을 제거합니다. 참고 :이 시점에서 출혈이 깊은 것을 입증 할 수 있도록 봉합 영역이 매우 혈관이다. 출혈이 완전히 중지하는 것은 충분한 시간 동안 기다릴 필요하다. 얼음에 배치하여 냉각 식염수 젖은 gelfoam을 유지하는 것이 도움이된다. </li></ol> 3. 바이러스 감염 <ol><li> 정위 타워에 주입 펌프를 부착하고 컨트롤러를 연결합니다. </li><li> 주사기에 35G 바늘을 삽입합니다. 그것을 소독 에탄올로 주사기 10 번 세척 및 멸균 식염수 10 회 전자의 흔적을 제거하는thanol. 주사기에서 공기 방울을 제거합니다. 펌프에 주사기를 삽입합니다. 참고 : 다른 소독제를 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> (10 ~ 12 PFU 권장) rAAV2 / 1 mCherry 준비의 단일 투여 량을 해동 얼음에 보관하십시오. 바이러스 솔루션과 주사기를 입력합니다. </li><li> 브레 그마에 바늘을 중앙에 다음 조심스럽게 다음 좌표를 사용하여 해마에 삽입 : AP -2, ML +/- 1.0, DV -1. 이 좌표는 개두술의 가장자리 근처에 위치한다. 조직 안정화를 위해 5 분 동안 기다립니다. </li><li> 50 NL / 분의 속도로 rAAV2 / 1 mCherry 용액 0.7 μl를 주입한다. 바이러스가 완전히 흡착하는 10 분을 기다립니다. 조심스럽게 바늘을 제거합니다. 출혈이 발생하는 경우 gelfoam을 함께시킨다. 반대측 사이트와 반복합니다. </li></ol> 4. 두개골 창 주입 <ol><li> 드릴 원 프레임의 경질의 상단에 살균, 건조 커브 글라스를 놓습니다. forc와 커브 글라스를 잡고분기 EPS 부드럽게 경질을 평평하고 커브 글라스을 가지고 &#39;두개골 표면에 가까운 가장자리. 참고 : 커브 글라스가 응고와 출혈이 다시 시작을 방해하는 것이 가능하다. 이런 경우, 커브 글라스를 올려 알코올, 건조에 배치 2.9 단계로 복귀. </li><li> 멸균 된 바늘이 커브 글라스 가장자리에 짙은 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용 사용하면 두개골에 첨부합니다. 접착제가 마를 때까지 기다립니다. </li><li> 두개골의 앞 부분에있는 고정 바 (M2 너트 또는 사용자 정의 만든 디자인)을 놓습니다. 바의 가장자리에 걸쳐 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용합니다. 접착제가 마를 때까지 기다립니다. <ol><li> 세션 이미징 동안 두개골 윈도우의 수평 위치를 사용하는 위치에 고정 줄​​을 놓습니다. 창에서 가능한 한 멀리 떨어져 배치합니다. 이 윈도우에 너무 가깝게 배치되는 경우, 맞춤형 홀더를 연결 바 나사 촬상 과정 대물위한 걸림돌 포즈 것이다. </li></ol></li><l난&gt; 치과 아크릴을 준비하고 유리 주위의 두개골 표면에 적용됩니다. 이 창 주위 분화구 형상을 형성하는 것이 도움이된다. 그것은 물 목적으로 이미징 나중에 적용 물 공동을 생성합니다. </li><li> 두개골 창 주위의 분화구를 강화, 운영 영역, 피부 가장자리, 고정 줄​​의 나머지 부분을 덮고, 치과 아크릴과 모자를 만듭니다. 치과 시멘트가 경화 될 때까지 기다립니다. </li><li> 정위 프레임에서 동물을 제거하고 회수 챔버에 넣어. </li><li> 생리 기능을 관찰하면서 동물이 수술에서 회복까지 기다립니다. </li><li> 48 시간 동안 수술 후 진통제 (카프로 펜, 10 ㎎ / ㎏) 및 항생제 치료 (baytril, 5 ㎎ / ㎏)을 적용합니다. </li></ol> 5. 이미지 <ol><li> 전원을 현미경, 사파이어 레이저 : 티를 시작합니다. 이 실험에 사용 된 시스템은 두 개의 광자 레이저, OPO 시스템과 이중 하나로 이루어질의 PMT를 구비한다. </li><li> induc에서 동물을 넣어기 챔버 마취를 유도한다. </li><li> 현미경 가스 마취 마스크 유도 챔버와 장소에서 동물을 제거합니다. 0.3 L / 분의 산소 유량과 1.5 %의 이소 플루 란 농도를 감소시킨다. </li><li> M2 나사 (또는 다른 사용자 정의 시스템)와 사용자 정의 현미경 프레임에 동물을 고정합니다. 두개골 창을 수준. 주 : 특정 맞춤 프레임 나은 결과 (개선 된 헤드 안정성 만성 실험 기간 동안 다수의 세션에서 일정한 위치)를 제공하지만 현미경 제조업체 헤드 고정 시스템을 사용하는 것이 가능하다. </li><li> retrosplenial 피질의 측면 중 하나에 위드 현미경 설정 및 낮은 배율 목표 중심 뷰를 사용하고, 커버 슬립의 표면에 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 분화구 모양의 아크릴 우물에 물 방울을 적용합니다. 장거리 침수 목표로 전환합니다. 물 메 니스 커스 콘 때까지 두개골 창으로 목표를 이동시편과 목표를 nects. </li><li> 두 광자 설정으로 전환하고 가장 낮은 줌을 사용하여 바닥에 시편 위로를 스캔 시작합니다. 뇌경막의 교차점 높은 비 특정 신호의 섬광으로 볼 수 있습니다. </li><li> 전체 동적 범위를 커버하기 위해 형광 세포에서의 신호 강도에 따라 두 채널 (GFP 및 mCherry)의 현미경 취득 설정을 조정한다. </li><li> (다른 세포로부터 분리 된 수지상 나무) 적절한 신경을 찾은 후 가장 낮은 줌과 5 미크론의 Z-거리 만 GFP의 filterset를 사용하여 초기 검사를 수행합니다. </li><li> 스캔 한 스택의 최대 투사를 구하여 (반전 색상을 사용하여) 주석을 위해 그것을 인쇄 할 수 있습니다. </li><li> 원하는 형태 세부 이미지에 수의 값으로 줌을 설정합니다. 이미지 기준으로 최대 투사를 사용하여 GFP 및 mCherry 채널의 전체 수지상 나무. </li></ol>

<ol><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
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</ol>

저자 (KL, MR, KR)은 특허에 대한 권리를이 조에서 사용되는 홀더 프레임 (PL410001을) 보류가 있습니다.

현재 논문에서 우리는 두개골 창을 통해 RSC에서 시냅스 입력과 시냅스 대상의 생체 내 이미징에서 동시에 두 광자를위한 프로토콜을 제시한다. 주입 절차는 몇 가지 주요 단계로 구성되어 있습니다. 첫째, 동물 깊이 마취 및 정위 프레임에 고정되어, 다음 RSC를 통해 두개골이 표시된 원형 라인을 따라 드릴 원형 뼈를 제거하여 얇게된다. 출혈이 중지되면 rAAV2 / 1 mCherry는 해마에 주입하고, 커버 유리 천공 영역 위에 두개골에 고정된다. 마지막 고정 막대가 헤드에 고정되며, 동물은 48 시간 동안 회수 챔버에 배치된다. 약 2~3주 바이러스 발현에 필요한 후, RSC는 가시화 될 수있다. 촬상 프로토콜은 다음과 같은 단계를 포함한다. 첫째, 동물은 마취 현미경으로 고정된다. 다음 위드 현미경을 사용하여 설정되어 초점 시스템이다 SWI이광자 모드 tched 관심있는 채널 (GFP 및 mCherry)이 가시화된다. 발표 기술은 앞에서 ...

이광자 현미경 살고 동물 행동에서 뇌 활동의 관찰 혁명. 1990 년 출시 이후 빠르게 인기를 얻고 지금은 생체 내 1,2에서 뇌 활동의 다양한 측면의 검토를 향해 가장 흥미롭고 혁신적인 접근 방법의 하나로서 구현된다. 이러한 애플리케이션 및 신경 세포의 형태 (칼슘 수준 지표 또는 즉각적인 초기 유전자의 발현을 사용하여, 예), 혈류 측정, 신경 활성을 포함한다. 실험실의 증가는 생체 뇌 영상을위한 새로운 표준으로 과학 세계 기술을 구현, 두 광자 현미경을 사용합니다. 표준 접근법은 뇌 창 주입 배럴 또는 마우스 뇌의 시각 피질 3 이상 (커버 유리 피복 두개의 원형 구멍)를 포함한다. 다음으로, 실험 프로토콜에 따라 각서SE 시간 걸쳐 4,5- 뇌 신경 활성 및 형태의 변화를 모니터링 할 수 있도록 시각화 행동 훈련 일련 겪는다. 두 경우 모두 개두술은 봉합을 횡단하지 않고 정수리 뼈에 영향을 미친다. 주로 기술의 주요 단점은 배럴 또는 시각 피질로 쉽게 접근 대뇌 피질에 제한된 응용 프로그램입니다 것으로 생각된다. 다른 지역에 걸쳐 두개골 창 주입으로 인해 과도한 출혈 및 / 또는 공간 방해로 어려움을 많이 포즈. 본 논문에서는 생체 현미경 (6)의 두 광자에 대한 관심의 또 다른 가능한 영역과 retrosplenial 피질 (RSC) 위의 두개골 윈도우의 주입을 제안한다. RSC는 공간 기억 형성을 담당 뇌 회로의 중요한 소자이다. 해부학, RSC는 대뇌 피질, 해마, 시상 영역 (7)를 연결하는 신경 네트워크의 일부입니다. 그것은이다주로 이러한 공간 학습 및 소등과 탐색 공간 (6)과 같은 행동의 범위에 포함했다. 신경 세포의 형태 학적 변화를 시각화하기 위해 우리는 thy1 발기인에서 녹색 형광 단백질 (GFP)를 발현하는 형질 전환 마우스 라인을 사용합니다. 이러한 쥐, GFP는 이광자 현미경 8을 사용 피질 축삭 돌기 명확한 시각화를 허용 뇌 신경 세포의 약 10 %에서 발현된다. 우리가 제안하는 또 다른 혁신은 RSC로 돌출 된 뇌의 깊은 구조로 신경 세포 특이 camkii 프로모터 (9)에서 적색 형광 단백질 (mCherry)를 코딩하는 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청 형 2/1 (/ 1 rAAV2)의 주입입니다 해마 등. Thy1-GFP 마우스의 해마에서 rAAV2 / 1 mCherry의 발현은 hippocampo-cortica의 사전 및 시냅스 요소를 동시에 시각화 할 수 있습니다난 10 시냅스. 단백질이 축삭 터미널에 충분한 수준에 도달 할 mCherry의 rAAV 중심의 표현은 2~3주이 필요합니다. 이 기간은 개두술 회복에 필요한 통상의 시간과 일치한다.

<table><tbody><tr><td><강력한>약물</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>박스터</td><td>에어라인 8DG9623</td><td>수술 전 5-2%</td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>박스터</td><td>에어라인 8DG9623</td><td>1.5-2% 수술 중</td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>스캔 수의사</td><td>덱사손 2mg/ml</td><td>0.2 mg/kg 근육 내</td></tr><tr><td>바이</td><td>엘</td><td>2.50%</td><td>5 mg/kg 피하</td></tr><tr><td>톨페딘</td><td>베토퀴놀</td><td>4%</td><td>4 mg/kg 피하</td></tr><tr><td>Butomidor</td><td>Richter Pharma</td><td>10 mg/</td><td>ml 2 mg/kg 피하</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>KRKA-Polska</td><td>Rycarfa 50mg/ml</td><td>10 mg/kg 피하</td></tr><tr><td>리도카</td><td>인 Jelfa</td><td>리그노카이늄</td><td>국소 투여</td></tr><tr><td>리도카인</td><td>Jelfa</td><td>20 mg/g</td><td></td></tr><tr><td>Surgery</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam</td><td>Ethicon</td><td>Spongostan 치과; REF MS0005</td><td></td></tr><tr><td>눈 연고</td><td>Dedra</td><td>Lubrithal</td><td>국소 CA</td></tr><tr><td>접착제</td><td>Pelikan Daniel</td><td>20G Huste</td><td></td></tr><tr><td>치과 아크릴</td><td>SpofaDental</td><td>Duracryl Plus</td><td></td></tr><tr><td>입체 프레임</td><td>스톨팅</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>Tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coverglass</td><td>Harvard 장치</td><td>: HSE-64-0720</td><td>3mm 직경</td></tr><tr><td>치과 드릴</td><td>Sigmed</td><td>Keystone KVet</td><td></td></tr><tr><td>고정 바</td><td>맞춤형</td><td>N / A</td><td>M2 또는 M3 나사 너트를 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>집게</td><td>Renex</td><td>PN-7B-SA</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 가위</td><td>Falcon</td><td>BM.183.180</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>KOZO</td><td>XTL6445T</td><td></td></tr><tr><td>Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Holder frame</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Two-photon microscope</td><td>Zeiss</td><td>Upright Axio Examiner Z1</td><td>Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm, 광학 파라메트릭 발진기 1050-1300nm. 목표: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 및 LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. 검출: Zeiss 대역통과 필터 BP 500-550 (GFP) 및 BP 570-610 (mCherry)은 560nm에서 빔 스플리터로 분리되고 두 개의 GaAsP 광검출기에 결합됩니다.</td></tr><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Virus</td><td>gift from K. Deisseroth</td><td></td><td>CaMK promoter의 통제하에 형광 단백질 mCherry를 발현하는 재조합 아데노연관 바이러스(rAAV)</td></tr></tbody></table>

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

이 비디오는 Thy1-GFP 형질전환 마우스 라인에서 생체 내 이광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질(RSC)의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근 방식은 생체 내에서 신경 세포 형태의 변화와 행동 조작의 상관 관계를 조사할 수 있는 가능성을 만듭니다.
두개골 창 이식 절차는 배럴 필드와 같이 쉽게 접근할 수 있는 피질 영역에만 국한되는 것으로 간주되었습니다. 우리의 접근 방식은 고도로 혈관화된 RSC의 뉴런을 시각화할 수 있습니다. RSC는 공간 기억을 담당하는 뇌 회로의 중요한 요소로, 이전에는 생체 내 이광자 이미징에 문제가 있는 것으로 간주되었습니다.
RSC 위의 두개골 창 이식은 mCherry 발현 재조합 아데노 관련 바이러스(rAAVmCherry)를 등쪽 해마에 주입하는 것과 결합됩니다. 발현된 mCherry는 해마에서 RSC까지 축삭돌기로 퍼져 피질의 시냅스전 축삭돌기와 시냅스후 수지상 가시 모두의 변화를 시각화할 수 있습니다. 
이 기술을 사용하면 RSC에서 경험 의존적 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

Thy1-GFP 기자 마우스에서 신경 세포의 일부에서 GFP의 발현은 대뇌 피질의 수상 돌기 및 RSC에서 지역 축삭 돌기의 생체 내 이미징에 있습니다. 그림 1a는 눈에 보이는 여러 GFP 양성 수상 돌기 이미지의 스택의 최대 투사를 보여줍니다. 세포체는 동맥에 의해 가려한다.도 1b는도 1a에 표시된 수지상 분기의 단일면 확대 이미지 (디지털 줌 3 배)를 보여줍니다. 수지상 형태 (쪽, filopodia)의 세부 사항은 명확하게 볼 수 있습니다. GFP 채널 대역 방출 500-550 nm의 필터를 사용하여 획득된다. 지느러미 해마에 rAAV2 / 1 mCherry의 주입은 RSC에 종료 해마 축삭과 시냅스 부 튼스의 시각화 할 수 있습니다. 이러한 단자 mCh...

이 비디오는 Thy1-GFP 형질전환 라인에서 생체 내 2광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 mCherry 발현 아데노 관련 바이러스를 배측 해마에 주입하는 것과 결합됩니다. 이러한 기술을 통해 RSC에서 경험 의존적 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

아래에 설명된 모든 실험 절차는 폴란드 과학원 Nenscki 실험생물학 연구소의 지역 윤리 위원회로부터 승인을 받았습니다. 이 영상은 thi one-G of feet 형질전환 라인 마우스의 후대상피질 내 뉴런을 인비보(in vivo) 이광자 현미경으로 만성적으로 이미징할 수 있게 하는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 배측 해마에 mCherry를 발현하는 아데노 부속 바이러스(AAV)를 주입하는 방법과 결합되었습니다.이러한 기술들을 결합하면 후대상피질(retrosplenial cortex)에서 경험된 의존성과 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다. 본 논문에서 우리는 이광자 생체 내 현미경(two-photon in vivo microscopy) 관찰을 위한 관심 영역으로서 후대상피질 상단에 두개골 창(cranial window)을 이식하는 방법을 제안합니다. 신경 구조의 형태학적 변화를 시각화하기 위해, 뇌 내 뉴런의 약 10%에서 형광 GFP 단백질이 발현되는 Thy1-GFP B 마우스를 사용합니다.우리가 제안하는 또 다른 혁신적인 방법은 후대상 피질로 향하는 구조적 투사를 시각화하기 위해, 해마와 같은 뇌의 심부 구조에 뉴런 특이적 프로모터 하에서 형광 단백질 mCherry를 발현하는 AAV를 주입하는 것입니다. 모든 도구, 액체용 유리 용기 및 면봉을 오토클레이브로 멸균하십시오. 일회용 장갑을 착용하십시오.70% ethanol을 사용하여 수술대, 정위 고정틀 및 모든 주변 영역을 세척하십시오. 멸균 수술 패드를 사용하여 모든 멸균 장비를 위한 멸균 공간을 조성하십시오. 젤 폼을 작은 조각으로 자른 후 멸균 식염수에 적셔 두십시오.동물을 유도 챔버에 넣고 이소플루란 농도를 5%, 산소 유량을 분당 2 L로 설정합니다. 이 과정은 약 3분 정도 소요됩니다. 유도 챔버에서 동물을 꺼냅니다.동물이 완전히 진정되었는지 확인하기 위해 꼬리나 발가락을 꼬집어 반응을 살핍니다. 정밀 트리머를 사용하여 귀 사이부터 눈까지 머리 뒷부분의 털을 깎습니다. 동물을 정위 고정 장치에 배치하고 이어바(ear bars)로 머리를 고정합니다.마취 수준을 isoflurane 1.5~2% 및 산소 0.3 L/min으로 설정하십시오. 안연고를 도포합니다. 염증, 통증 및 감염을 각각 예방하기 위해 tolfedine 4 mg/kg, butomidor 2 mg/kg, Baytril 5 mg/kg을 동물에게 피하 주사하십시오.뇌 부종을 방지하기 위해 동물에게 dexamethasone 0.2 mg/kg을 근육 내 주사합니다. betadine이 묻은 멸균 면봉으로 피부를 닦아낸 후 70% ethanol로 소독합니다. 장갑을 교체하고 70% ethanol을 분사합니다.포셉으로 피부를 들어 올리고, 미세 가위를 사용하여 머리 기저부를 따라 수평으로 피부를 절개한 후, 양눈 사이의 앞 지점까지 사선으로 절개합니다. 피부 플랩을 제거합니다. 과도한 출혈과 통증을 방지하기 위해 멸균 면봉을 사용하여 골막에 리도카인 연고를 도포합니다.멸균 면봉이나 메스를 사용하여 골막을 제거합니다. 멸균 면봉으로 두개골의 물기를 닦아냅니다. 멸균 바늘을 사용하여 피부 가장자리에 고농도 시아노아크릴레이트 접착제를 도포하여 고정함으로써 치과용 시멘트와 더 이상 접촉하지 않도록 합니다.접착제가 마를 때까지 기다립니다. 람다 봉합선(lambdoid suture)의 앞쪽에 3 mm 멸균 커버 글라스를 두개골 위에 놓습니다. 커버 슬립을 후대상피질(retrosplenial) 좌표인 bregma 기준 anterior-posterior -2.8, medial-lateral 0 위치에 맞추어 중앙에 배치합니다.멸균된 바늘로 두개골 표면을 긁어 커버슬립의 가장자리를 표시합니다. 커버글라스를 70% ethanol이 담긴 멸균 용기에 다시 넣습니다. 소구경 버(bur)가 장착된 고속 치과용 드릴을 사용하여 지름 3mm의 원을 따라 윤곽을 잡습니다.멸균 식염수를 적신 면봉으로 천공 부위의 골분(bone dust)을 제거합니다. 간헐적으로 발생하는 출혈을 멈추게 하고 뼈를 세척하기 위해 젤 폼(gel foam)과 면봉을 사용합니다. 천공 중간에 미세 핀셋으로 뼈의 원형 부분을 부드럽게 터치하여 가동성을 확인함으로써 뼈의 두께를 점검합니다.봉합선 부위의 뼈가 더 두껍다는 점에 유의하십시오. 뼈 원형 조각이 움직이고 둘레에 고르고 얇은 뼈 층만 남았을 때 드릴링을 중단하십시오. 식염수를 적신 면봉으로 수술 부위에 남은 모든 뼈 가루를 닦아내십시오.드릴링 부위에 멸균 식염수를 떨어뜨려 드릴링된 원형 영역을 덮습니다. 미세 핀셋을 사용하여 뼈 원형 조각을 조심스럽게 들어 올린 다음, 천천히 하지만 단단하게 위쪽으로 들어 올려 뼈를 제거합니다. 이때 경막에 손상을 줄 수 있으므로, 뼈 조각을 들어 올릴 때 비스듬하게 기울어지지 않도록 주의하십시오.지혈을 돕기 위해 멸균 식염수에 적신 젤 폼을 경막 위에 부드럽게 도포합니다. 모든 출혈이 완전히 멈출 때까지 기다립니다. 응고 과정이 방해받지 않도록 젤 폼을 조심스럽게 제거합니다.봉합 부위는 혈관 분포가 매우 많으므로 이 시점에서 출혈이 심할 수 있음에 유의하십시오. 출혈이 멈출 때까지 충분한 시간을 기다리는 것이 필수적입니다. 정위 고정 타워에 주입 펌프를 부착하고 컨트롤러를 연결하십시오.35-gauge 바늘을 충전용 주사기에 삽입합니다. 주사기를 멸균하기 위해 에탄올로 10회 세척하고, 에탄올 성분을 제거하기 위해 멸균 식염수로 10회 세척합니다. 주사기 내의 공기 방울을 제거합니다.시린지를 펌프에 삽입하십시오. AV 조제액 1회 투여량을 채운 후 얼음 위에 보관하십시오. 시린지에 바이러스 용액을 채우십시오.바늘을 브레그마(bregma) 중앙에 맞춘 다음, 다음 좌표를 사용하여 해마로 조심스럽게 삽입하십시오: Anterior, posterior -2, medial lateral ±1, dorsal ventral -1. 이 좌표들은 두개골 영역의 가장자리 부근에 위치하게 됩니다. 조직이 안정될 때까지 5분 동안 기다리십시오.AV 용액 0.7 µL를 분당 50 nL의 속도로 주입합니다. 바이러스가 완전히 흡수될 때까지 10분 동안 기다립니다. 바늘을 조심스럽게 제거합니다.출혈이 발생하면 젤 폼으로 닦아냅니다. 반대측에서도 동일하게 반복합니다. 드릴로 뚫린 원형 프레임 내의 경막 상단에 멸균된 건조 커버 글라스를 놓습니다.포셉으로 커버 글라스를 잡고 경막을 부드럽게 편 다음, 커버 글라스의 가장자리를 두개골 표면에 가깝게 밀착시킵니다. 멸균 바늘을 사용하여 커버 글라스 가장자리에 고밀도 시아노아크릴레이트 접착제를 도포하여 두개골에 고정합니다. 접착제가 마를 때까지 기다립니다.두개골 앞부분에 고정 바, 앤톤 너트(anton nut) 또는 맞춤 제작된 디자인의 고정 장치를 배치합니다. 이때 고정 바는 이미징 세션 동안 두개창(cranial window)을 수평으로 배치할 수 있는 위치에 놓여야 함에 유의하십시오. 바의 가장자리를 따라 접착제를 도포합니다.접착제가 마를 때까지 기다립니다. 고정 바는 창문에서 가능한 한 멀리 배치해야 합니다. 창문과 너무 가깝게 배치하면, 바와 맞춤 제작된 홀더를 연결하는 나사가 이미지 촬영 과정 중 대물렌즈의 장애물이 될 수 있습니다.치과용 아크릴을 준비하여 유리를 둘러싼 두개골 표면에 도포합니다. 윈도우 주변에 크레이터와 같은 모양을 형성하는 것이 도움이 됩니다. 이렇게 하면 나중에 수침 렌즈를 이용해 이미징할 때 사용할 물을 담을 수 있는 공간이 만들어집니다.치과용 아크릴로 캡을 만들어, 두개창 주변의 크레이터를 보강하고 수술 부위의 나머지 피부 가장자리 고정 바를 덮습니다. 치과용 시멘트가 경화될 때까지 기다립니다. 스테레오택틱 프레임에서 동물을 분리하여 회복실로 옮깁니다.생리적 기능을 관찰하며 동물이 수술로부터 회복될 때까지 기다립니다. 수술 후 48시간 동안 마취제인 cyroproferrin 10 mg/kg과 항생제인 baytril 5 mg/kg을 투여합니다. ti sapphire 레이저를 켜고 현미경의 전원을 올립니다.본 실험에 사용된 시스템은 이광자 레이저, OPO 시스템 및 듀얼 갈륨 비소 증폭 PMT를 갖추고 있습니다. 동물을 유도 챔버에 넣고 마취를 유도합니다. 유도 챔버에서 동물을 꺼내어 현미경 아래의 가스 마취 마스크에 놓습니다.산소 유량을 0.3 L/min으로, 이소플루레인 농도를 1.52%로 낮춥니다. MT 나사 또는 다른 맞춤형 시스템을 사용하여 동물을 맞춤형 현미경 프레임에 고정합니다. 두개창의 수평을 맞춥니다. 참고로, 현미경 제조사의 머리 고정 시스템을 사용할 수도 있으나, 특정 맞춤형 프레임을 사용하면 결과가 더 좋고, 머리 안정성이 향상되며, 만성 실험 중 여러 세션에 걸쳐 일관된 위치 잡기가 가능합니다.광시야 현미경 설정을 사용하여 저배율 대물렌즈로 후대상피질(retrosplenial cortex)의 한쪽 측면에 시야를 맞춘 후 커버슬립 표면에 초점을 잡습니다. 분화 형태의 아크릴 웰에 물 한 방울을 떨어뜨립니다. 그 후 장작동 거리 수침 대물렌즈로 교체합니다.물 표면의 메니스커스가 표본과 대물렌즈를 연결할 때까지 대물렌즈를 두개골 창(cranial window) 쪽으로 이동시킵니다. 이광자(two-photon) 설정으로 전환하고 가장 낮은 배율을 사용하여 표본의 상단부터 하단까지 스캔하기 시작합니다. 경막(dura mater)이 교차하는 지점은 비특이적 신호가 강하게 발생하는 글로어(glare) 현상으로 나타납니다.전체 동적 범위를 커버할 수 있도록 형광 세포의 신호 강도에 따라 GFP 및 mCherry 두 채널 모두에서 현미경 획득 설정을 조정합니다. 수지상 돌기 나무가 다른 세포들과 분리된 적절한 뉴런을 찾은 후, 최저 배율과 5 µm의 Z 거리로 설정된 GFP 필터만을 사용하여 초기 스캔을 수행합니다. 스캔 스택의 최대 투영 영상을 얻고, 이를 색상 반전 처리하여 주석 작성용으로 출력합니다.원하는 형태학적 세부 사항을 촬영할 수 있는 값으로 줌을 설정합니다. 최대 투영법(maximum projection)을 가이드로 사용하여 GFP 및 mCherry 채널에서 전체 수지상 돌기 구조를 촬영합니다. 본 프로토콜을 통해 후대상피질(retrosplenial cortex) 내의 시냅스 전 및 후 구조를 반복적으로 관찰할 수 있습니다.이 접근 방식은 수지상 돌기, 시냅스 가시 또는 시냅스 전 뉴런의 형태학적 변화와 상관관계가 있을 것으로 예상되는 행동 조작을 포함하는 만성 실험에 활용될 수 있습니다. 이미징 세션은 어떤 빈도로든 수행할 수 있으나, 동물의 적절한 회복을 돕고 마취 효과를 최소화하기 위해 24시간 간격을 두는 것이 권장됩니다. 이 기술을 적절하게 적용하면 수개월에 걸쳐 여러 번의 이미징 세션을 수행할 수 있습니다.

simultaneous-two-photon-vivo-imaging-synaptic-inputs-postsynaptic

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Wang, Z., et al. Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina.  J. Vis. 특급 (2021). 이 동영상은 이광자 현미경을 사용한 in vivo 망막 이미징 기술을 보여줍니다. 마취된 마우스는 머리를 고정하고, 눈 윤활제를 바르고, 눈 위에 커버슬립을 놓아 이미징을 준비합니다. 형광 단백질을 발현하는 망막 신경절 세포(Retinal ganglion cell, RGC)는 정렬을 위해 상피형광(epifluorescence)을 사용하여 먼저 시각화됩니다. 마지막으로, 이광자 이미징이 사용되어 망막 신경절의 고해상도 시각화가 가능합니다.

마우스 망막의 Two-Photon In Vivo 이미징

출처: Maruoka, H., et. al. 깨어 있는 쥐의 미세아교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징.J. Vis. Exp. (2022) 이 비디오는 시각적 자극 중 깨어 있는 쥐의 신경 활동과 미세아교세포 역학을 이미징하기 위한 이광자 현미경 절차를 보여주며 칼슘 과도 및 세포 상호 작용을 강조합니다.

깨어 있는 쥐에서 미세아교세포의 역학과 신경 활동의 동시 이미징(Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse)

출처: Kamei, R., et. al., 마우스 해마에서 미세아교세포의 생체 내 만성 이광자 이미징. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 해마 CA1(Cornu ammonis 1) 및 치상회에서 미세아교세포 역학의 생체 내 2광자 현미경을 위한 설정 및 이미징 프로세스를 보여 최적의 광학 정렬 및 구조적 무결성 평가를 보장합니다.

마우스 해마에서 미세아교세포 역학의 생체 내 2광자 이미징

방법은 네크로의 미리 결정된 기능 마이크로 도메인에 형광 염료와 뉴런을 라벨에 설명되어 있습니다. 첫째, 고유 신호 광학 이미징은 기능지도를 얻을하는 데 사용됩니다. 그런 다음 두 광자 현미경은지도의 마이크로 도메인 내에서 라벨 및 이미지 뉴런하는 데 사용됩니다.

특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링

뉴런의 경험에 의존하는 분자 변화는 행동 문제에 대한 응답으로 적응하는 뇌의 기능에 필수적입니다.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

살아있는 동물의 타임랩스 영상은 온전한 뇌의 구조적 재구성에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 여기에서는 이광자 현미경으로 살아있는 쥐 피질의 형광 표지된 시냅스 구조를 경두개 이미징할 수 있는 얇은 두개골 제제를 소개합니다.

두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

양국 주 somatosensory corticies (S1) Thy1에서 위의 듀얼 광 창을 통해 신경 활동을 측정 하기 위한 실험 절차 설명-GCaMP6s 유전자 변형 쥐 2 광자 (2 P) 현미경에서 vivo에서를 사용 하 여.

Thy1를 사용 하 여 기본 Somatosensory 피 질에서 신경 활동을 이미징-GCaMP6s 유전자 변형 쥐

이 방법은 살아있는 마우스의 해마에 광학적인 접근을 허용하는 만성 준비를 기술합니다. 이 제제는 몇 주 동안 신경 구조 가소성 및 활동 유발 세포 가소성의 세로 광학 이미징을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

살아있는 마우스에 있는 등도 해마 CA1의 세로 2 광자 화상 진찰

생체 내 이미징은 건강 및 질병 생물학 연구를위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 표준 2 광자 현미경으로 마우스 망막의 경공 영상을 설명합니다. 또한 망막의 여러 세포 코호트를 형광으로 표지하는 다양한 생체 내 이미징 방법을 보여줍니다.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

학습하세요 생쥐 후방대상피질에서 두 광자 현미경을 이용한 뉴런의 만성 이미징 방법을. mCherry 발현 아데노관련바이러스 주입과 두개골창 삽입을 통해 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

동시에 두 광자

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