동시에 두 광자 생체 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

아래에 설명된 모든 실험 절차는 폴란드 과학 아카데미의 Nenscki Institute of Experiemental Biology의 지역 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 이 비디오는 1G의 발 형질전환 라인에서 생체 내 이광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 배측 해마에서 아데노 관련 바이러스(AAV)를 발현하는 mCherry를 주사하는 것과 결합됩니다.

함께 결합하여, 이러한 기술은 후비장 피질에서 경험 된 의존성, 구조적 가소성을 장기간 모니터링 할 수 있습니다. 이 논문에서는 생체 내 이광자 현미경 검사에 대한 가능한 관심 영역이 아닌 후비장 피질 위의 두개골 창을 이식할 것을 제안합니다. 신경 세포의 형태학적 변화를 시각화하기 위해, 우리는 뇌에 있는 신경 세포의 약 10%에서 형광 GFP 단백질이 발현되는 B 마우스의 1-G를 사용합니다.

우리가 제안하는 또 다른 혁신은 AAV를 주입하는 것인데, 이는 해마와 같은 뇌의 더 깊은 구조로 뉴런 특이적 프로모터 아래에서 형광 단백질 mCherry를 발현하여 후비장 피질로의 구조 투영을 시각화하는 것입니다. 모든 도구, 액체용 유리 용기 및 면봉을 오토클레이브에서 소독하십시오. 당신은 없어서는 안 될 장갑입니다.

수술대, 정위 프레임 및 모든 주변 부위를 70% 에탄올로 청소하십시오. 멸균 수술 패드를 사용하여 멸균된 모든 장비를 위한 멸균 공간을 만드십시오. 젤 폼을 작은 조각으로 자르고 멸균 식염수에 담그십시오.

동물을 유도 챔버에 넣고 이소 플루란 수준을 5 %로 설정하고 산소 흐름을 분당 2 리터로 설정합니다. 이 절차는 약 3분 정도 걸립니다. 동물을 유도실에서 꺼냅니다.

동물이 완전히 진정되었는지 확인하기 위해 꼬리나 발가락 꼬집음을 사용하십시오. 정확한 트리머를 사용하여 머리 뒤쪽, 귀 사이, 눈까지 수염을 면도하십시오. 동물을 정위 프레임에 놓고 이어 바로 머리를 안정시킵니다.

마취 수준을 1.5-2%이소플루란으로 설정하고 분당 3리터의 산소를 영점으로 설정합니다. 눈 연고를 바릅니다. 염증, 통증 및 감염을 예방하기 위해 톨페딘(tolfedine, 킬로그램당 4mg), 부피미도르(butomidor, kg당 2mg), 베이트릴(Baytril, kg당 5mg

뇌 부종을 방지하기 위해 킬로그램당 0점 2mg인 덱사메타손을 동물에게 근육 주사합니다. 베타딘과 70% 에탄올이 함유된 멸균 면봉을 사용하여 피부를 청소합니다. 장갑을 교체하고 70% 에탄올을 뿌립니다.

집게로 피부를 들어 올리고 마이크로 가위를 사용하여 머리 바닥을 따라 피부를 수평으로 절개 한 다음 눈 사이의 앞쪽 지점까지 비스듬히 절개합니다. 피부 덮개를 제거합니다. 멸균 면봉으로 리도카인 연고를 골막에 바르면 과도한 출혈과 통증을 예방할 수 있습니다.

멸균 면봉이나 메스를 사용하여 골막을 제거합니다. 멸균 면봉으로 두개골을 말리십시오. 멸균 바늘을 사용하여 피부 가장자리에 조밀한 시아노아크릴레이트 접착제를 바르면 피부 가장자리가 움직이지 않게 하고 치과용 시멘트와 더 이상 접촉하지 않도록 합니다.

접착제가 마를 때까지 기다립니다. 멸균 3mm 덮개 유리를 양모양 봉합사 앞쪽의 두개골 위에 놓습니다. 커버 슬립을 후방 비장 좌표, 전방, 후방 브레그마 마이너스 2 포인트 8, 내측 측면 브레그마 0으로 중앙에 놓습니다.

멸균 바늘로 두개골 표면을 긁어 덮개 슬립 가장자리를 표시합니다. 커버 유리를 70% 에탄올이 함유된 멸균 용기에 다시 넣습니다. 직경이 작은 버가 있는 고속 치과용 드릴을 사용하여 직경 3mm의 원의 윤곽을 그립니다.

멸균 식염수 면봉으로 뼈 먼지로부터 시추 부위를 청소합니다. 젤 폼과 면봉을 사용하여 간헐적인 출혈을 멈추고 뼈를 청소합니다. 드릴링 사이에 뼈 원을 부드럽게 만지고 이동성을 확인하여 미세한 집게로 뼈 두께를 확인합니다.

봉합사 부위의 뼈가 더 두껍다는 점을 명심하십시오. 뼈 원이 움직이고 둘레에 균일한 얇은 뼈 층만 남을 때 드릴링을 중지하십시오. 식염수 면봉으로 남아 있는 모든 뼈 가루의 작업 필드를 청소합니다.

멸균 식염수를 드릴링 영역에 떨어뜨려 천공된 원을 덮습니다. 가는 집게로 뼈 원을 조심스럽게 들어 올린 다음 뼈를 위로 들어 올려 부드럽지만 단단히 제거합니다. 경막의 손상을 방지하기 위해 뼈 서클을 들어 올리는 동안 뼈 서클을 비뚤어지지 않도록 주의하십시오.

멸균 식염수에 적신 젤 폼을 경막에 부드럽게 바르면 출혈이 가라집니다. 모든 출혈이 완전히 멈출 때까지 기다립니다. 응고 과정을 방해하지 않도록 젤 폼을 조심스럽게 제거하십시오.

봉합사 부위는 혈관화가 높기 때문에 이 시점의 출혈이 심한 것으로 판명될 수 있습니다. 출혈이 멈출 때까지 충분한 시간을 기다리는 것이 중요합니다. 주입 펌프를 정위 타워에 연결하고 컨트롤러를 연결합니다.

35게이지 바늘을 주입 주사기에 삽입합니다. 주사기를 에탄올로 10회 세척하여 살균하고 멸균 식염수로 10회 세척하여 미량의 에탄올을 제거합니다. 주사기에서 기포를 제거합니다.

펌프에 주사기를 삽입합니다. AV 제제를 한 번 채우고 얼음 위에 보관하십시오. 주사기에 바이러스 용액을 채웁니다.

바늘을 브레그마의 중앙에 놓고 다음 좌표를 사용하여 해마에 부드럽게 삽입합니다: 전방, 후방 마이너스 2, 내측 측면 플러스 마이너스 1, 등쪽 복부 마이너스 1. 이 좌표는 두개골 영역의 가장자리 근처에 위치합니다. 조직이 안정화될 때까지 5분 동안 기다립니다.

영점 7마이크로리터의 AV 용액을 분당 50나노리터의 속도로 주입합니다. 바이러스가 완전히 흡수될 때까지 10분 동안 기다립니다. 바늘을 부드럽게 제거합니다.

출혈이 발생하면 젤 폼으로 닦아내십시오. 반대쪽 쪽도 반복합니다. 뚫린 원형 프레임의 dura 상단에 멸균 건조 덮개 유리를 놓습니다.

앞두근으로 커버 유리를 잡고 경막을 부드럽게 평평하게 하고 커버 유리 가장자리를 두개골 표면에 더 가깝게 가져옵니다. 멸균 바늘을 사용하여 촘촘한 시아노아크릴레이트 접착제를 커버 유리 가장자리에 바르고 두개골에 부착합니다. 접착제가 마를 때까지 기다립니다.

고정 막대, 안톤 너트 또는 맞춤형 디자인을 두개골 앞부분에 놓습니다. 참고로, 고정 막대는 이미징 세션 동안 두개골 창의 수평 배치가 가능한 위치에 배치되어야 합니다. 막대 가장자리에 접착제를 바르십시오.

접착제가 마를 때까지 기다립니다. 고정 막대는 창에서 가능한 한 멀리 배치해야 합니다. 창에 너무 가깝게 배치하면 바를 맞춤형 홀더와 연결하는 나사가 이미징 프로세스 중에 대물렌즈에 장애물이 될 수 있습니다.

치과용 아크릴을 준비하고 유리 주변의 두개골 표면에 바릅니다. 창문 주위에 분화구 같은 모양을 형성하는 것이 도움이 됩니다. 나중에 물 대물렌즈로 이미징하기 위해 적용되는 물을 위한 캐비티를 생성합니다.

치과용 아크릴로 캡을 만들어 나머지 작업 영역, 피부 가장자리, 고정 막대를 덮고 두개골 창 주변의 분화구를 다시 강화합니다. 치과 시멘트가 굳을 때까지 기다리십시오. 정위 프레임에서 동물을 제거하고 회수실에 넣습니다.

동물이 수술에서 회복될 때까지 기다리면서 생리적 기능을 관찰합니다. 수술 후 마취제인 시로프로페린(킬로그램당 10mg)과 항생제 치료제인 베이트릴(킬로그램당 5mg)을 48시간 동안 투여합니다. ti 사파이어 레이저를 시작하고 현미경의 전원을 켭니다.

이 실험에 사용된 시스템에는 이광자 레이저, OPO 시스템 및 이중 갈륨 비소 위조 PMT가 장착되어 있습니다.동물을 유도실에 넣고 마취를 유도합니다. 유도 챔버에서 동물을 꺼내 현미경 아래에 가스 마취 마스크에 넣습니다.

산소 흐름을 분당 3리터로 낮추고 이소플루란 농도를 1.52%로 낮추십시오.MT 나사 또는 다른 맞춤형 시스템을 사용하여 동물을 맞춤형 현미경 프레임에 고정합니다. 두개골 창을 수평으로 맞춥니다. 현미경 제조업체의 헤드 고정 시스템을 사용할 수 있지만 특정 맞춤형 프레임은 더 나은 결과, 향상된 헤드 안정성, 만성 실험 중 여러 세션에서 일정한 위치를 제공합니다.

저배율 대물렌즈인 광시야 현미경 설정을 사용하여 후비장 피질의 측면 중 하나에 시야를 중앙에 놓고 커버 슬립 표면에 초점을 맞춥니다. 분화구 같은 아크릴 우물에 물방울을 바릅니다. 장거리 침수 목표로 전환합니다.

물 반월판이 표본과 대물렌즈를 연결할 때까지 대물렌즈를 두개골 창 쪽으로 이동합니다. 이광자 설정으로 전환하고 가장 낮은 줌을 사용하여 표본을 위에서 아래로 스캔하기 시작합니다. 경막 물질의 교차는 높은 비특이적 신호의 눈부심으로 볼 수 있습니다.

전체 동적 범위를 커버하기 위해 형광 세포의 신호 강도에 따라 GFP 및 mCherry 두 채널에서 현미경 획득 설정을 조정합니다. 수지상 나무가 다른 세포와 분리된 적절한 뉴런을 찾은 후 5미크론의 가장 낮은 줌 및 Z 거리로 설정된 GFP 필터만 사용하여 초기 스캔을 수행합니다. 스캔 스택의 최대 투영을 얻고 반전된 색상을 사용하여 주석을 위해 인쇄합니다.

원하는 형태학적 세부 사항을 이미지화할 수 있는 값으로 zoom을 설정합니다. 최대 투영을 가이드로 사용하여 GFP 및 mCherry 채널에서 전체 수지상 나무를 이미지화합니다. 이 프로토콜을 사용하면 후비장 피질(retrosplenial cortex)의 시냅스 전후 구조를 반복적으로 모니터링할 수 있습니다.

이 접근법은 수상 돌기, 시냅스 가시 또는 시냅스 전 중성자의 형태가 변화할 때 상관 관계가 있을 것으로 예상되는 행동 조작이 예상되는 만성 실험과 함께 활용될 수 있습니다. 이미징 세션은 모든 빈도로 수행할 수 있지만 동물의 적절한 회복을 허용하고 마취의 영향을 최소화하기 위해 24시간 간격이 선호됩니다. 이 기술을 적절하게 적용하면 몇 달 동안 여러 이미징 세션을 수행할 수 있습니다.