동시에 두 광자

아래에 설명된 모든 실험 절차는 폴란드 과학원 Nenscki 실험생물학 연구소의 지역 윤리 위원회로부터 승인을 받았습니다. 이 영상은 thi one-G of feet 형질전환 라인 마우스의 후대상피질 내 뉴런을 인비보(in vivo) 이광자 현미경으로 만성적으로 이미징할 수 있게 하는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 배측 해마에 mCherry를 발현하는 아데노 부속 바이러스(AAV)를 주입하는 방법과 결합되었습니다.

이러한 기술들을 결합하면 후대상피질(retrosplenial cortex)에서 경험된 의존성과 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다. 본 논문에서 우리는 이광자 생체 내 현미경(two-photon in vivo microscopy) 관찰을 위한 관심 영역으로서 후대상피질 상단에 두개골 창(cranial window)을 이식하는 방법을 제안합니다. 신경 구조의 형태학적 변화를 시각화하기 위해, 뇌 내 뉴런의 약 10%에서 형광 GFP 단백질이 발현되는 Thy1-GFP B 마우스를 사용합니다.

우리가 제안하는 또 다른 혁신적인 방법은 후대상 피질로 향하는 구조적 투사를 시각화하기 위해, 해마와 같은 뇌의 심부 구조에 뉴런 특이적 프로모터 하에서 형광 단백질 mCherry를 발현하는 AAV를 주입하는 것입니다. 모든 도구, 액체용 유리 용기 및 면봉을 오토클레이브로 멸균하십시오. 일회용 장갑을 착용하십시오.

70% ethanol을 사용하여 수술대, 정위 고정틀 및 모든 주변 영역을 세척하십시오. 멸균 수술 패드를 사용하여 모든 멸균 장비를 위한 멸균 공간을 조성하십시오. 젤 폼을 작은 조각으로 자른 후 멸균 식염수에 적셔 두십시오.

동물을 유도 챔버에 넣고 이소플루란 농도를 5%, 산소 유량을 분당 2 L로 설정합니다. 이 과정은 약 3분 정도 소요됩니다. 유도 챔버에서 동물을 꺼냅니다.

동물이 완전히 진정되었는지 확인하기 위해 꼬리나 발가락을 꼬집어 반응을 살핍니다. 정밀 트리머를 사용하여 귀 사이부터 눈까지 머리 뒷부분의 털을 깎습니다. 동물을 정위 고정 장치에 배치하고 이어바(ear bars)로 머리를 고정합니다.

마취 수준을 isoflurane 1.5~2% 및 산소 0.3 L/min으로 설정하십시오. 안연고를 도포합니다. 염증, 통증 및 감염을 각각 예방하기 위해 tolfedine 4 mg/kg, butomidor 2 mg/kg, Baytril 5 mg/kg을 동물에게 피하 주사하십시오.

뇌 부종을 방지하기 위해 동물에게 dexamethasone 0.2 mg/kg을 근육 내 주사합니다. betadine이 묻은 멸균 면봉으로 피부를 닦아낸 후 70% ethanol로 소독합니다. 장갑을 교체하고 70% ethanol을 분사합니다.

포셉으로 피부를 들어 올리고, 미세 가위를 사용하여 머리 기저부를 따라 수평으로 피부를 절개한 후, 양눈 사이의 앞 지점까지 사선으로 절개합니다. 피부 플랩을 제거합니다. 과도한 출혈과 통증을 방지하기 위해 멸균 면봉을 사용하여 골막에 리도카인 연고를 도포합니다.

멸균 면봉이나 메스를 사용하여 골막을 제거합니다. 멸균 면봉으로 두개골의 물기를 닦아냅니다. 멸균 바늘을 사용하여 피부 가장자리에 고농도 시아노아크릴레이트 접착제를 도포하여 고정함으로써 치과용 시멘트와 더 이상 접촉하지 않도록 합니다.

접착제가 마를 때까지 기다립니다. 람다 봉합선(lambdoid suture)의 앞쪽에 3 mm 멸균 커버 글라스를 두개골 위에 놓습니다. 커버 슬립을 후대상피질(retrosplenial) 좌표인 bregma 기준 anterior-posterior -2.8, medial-lateral 0 위치에 맞추어 중앙에 배치합니다.

멸균된 바늘로 두개골 표면을 긁어 커버슬립의 가장자리를 표시합니다. 커버글라스를 70% ethanol이 담긴 멸균 용기에 다시 넣습니다. 소구경 버(bur)가 장착된 고속 치과용 드릴을 사용하여 지름 3mm의 원을 따라 윤곽을 잡습니다.

멸균 식염수를 적신 면봉으로 천공 부위의 골분(bone dust)을 제거합니다. 간헐적으로 발생하는 출혈을 멈추게 하고 뼈를 세척하기 위해 젤 폼(gel foam)과 면봉을 사용합니다. 천공 중간에 미세 핀셋으로 뼈의 원형 부분을 부드럽게 터치하여 가동성을 확인함으로써 뼈의 두께를 점검합니다.

봉합선 부위의 뼈가 더 두껍다는 점에 유의하십시오. 뼈 원형 조각이 움직이고 둘레에 고르고 얇은 뼈 층만 남았을 때 드릴링을 중단하십시오. 식염수를 적신 면봉으로 수술 부위에 남은 모든 뼈 가루를 닦아내십시오.

드릴링 부위에 멸균 식염수를 떨어뜨려 드릴링된 원형 영역을 덮습니다. 미세 핀셋을 사용하여 뼈 원형 조각을 조심스럽게 들어 올린 다음, 천천히 하지만 단단하게 위쪽으로 들어 올려 뼈를 제거합니다. 이때 경막에 손상을 줄 수 있으므로, 뼈 조각을 들어 올릴 때 비스듬하게 기울어지지 않도록 주의하십시오.

지혈을 돕기 위해 멸균 식염수에 적신 젤 폼을 경막 위에 부드럽게 도포합니다. 모든 출혈이 완전히 멈출 때까지 기다립니다. 응고 과정이 방해받지 않도록 젤 폼을 조심스럽게 제거합니다.

봉합 부위는 혈관 분포가 매우 많으므로 이 시점에서 출혈이 심할 수 있음에 유의하십시오. 출혈이 멈출 때까지 충분한 시간을 기다리는 것이 필수적입니다. 정위 고정 타워에 주입 펌프를 부착하고 컨트롤러를 연결하십시오.

35-gauge 바늘을 충전용 주사기에 삽입합니다. 주사기를 멸균하기 위해 에탄올로 10회 세척하고, 에탄올 성분을 제거하기 위해 멸균 식염수로 10회 세척합니다. 주사기 내의 공기 방울을 제거합니다.

시린지를 펌프에 삽입하십시오. AV 조제액 1회 투여량을 채운 후 얼음 위에 보관하십시오. 시린지에 바이러스 용액을 채우십시오.

바늘을 브레그마(bregma) 중앙에 맞춘 다음, 다음 좌표를 사용하여 해마로 조심스럽게 삽입하십시오: Anterior, posterior -2, medial lateral ±1, dorsal ventral -1. 이 좌표들은 두개골 영역의 가장자리 부근에 위치하게 됩니다. 조직이 안정될 때까지 5분 동안 기다리십시오.

AV 용액 0.7 µL를 분당 50 nL의 속도로 주입합니다. 바이러스가 완전히 흡수될 때까지 10분 동안 기다립니다. 바늘을 조심스럽게 제거합니다.

출혈이 발생하면 젤 폼으로 닦아냅니다. 반대측에서도 동일하게 반복합니다. 드릴로 뚫린 원형 프레임 내의 경막 상단에 멸균된 건조 커버 글라스를 놓습니다.

포셉으로 커버 글라스를 잡고 경막을 부드럽게 편 다음, 커버 글라스의 가장자리를 두개골 표면에 가깝게 밀착시킵니다. 멸균 바늘을 사용하여 커버 글라스 가장자리에 고밀도 시아노아크릴레이트 접착제를 도포하여 두개골에 고정합니다. 접착제가 마를 때까지 기다립니다.

두개골 앞부분에 고정 바, 앤톤 너트(anton nut) 또는 맞춤 제작된 디자인의 고정 장치를 배치합니다. 이때 고정 바는 이미징 세션 동안 두개창(cranial window)을 수평으로 배치할 수 있는 위치에 놓여야 함에 유의하십시오. 바의 가장자리를 따라 접착제를 도포합니다.

접착제가 마를 때까지 기다립니다. 고정 바는 창문에서 가능한 한 멀리 배치해야 합니다. 창문과 너무 가깝게 배치하면, 바와 맞춤 제작된 홀더를 연결하는 나사가 이미지 촬영 과정 중 대물렌즈의 장애물이 될 수 있습니다.

치과용 아크릴을 준비하여 유리를 둘러싼 두개골 표면에 도포합니다. 윈도우 주변에 크레이터와 같은 모양을 형성하는 것이 도움이 됩니다. 이렇게 하면 나중에 수침 렌즈를 이용해 이미징할 때 사용할 물을 담을 수 있는 공간이 만들어집니다.

치과용 아크릴로 캡을 만들어, 두개창 주변의 크레이터를 보강하고 수술 부위의 나머지 피부 가장자리 고정 바를 덮습니다. 치과용 시멘트가 경화될 때까지 기다립니다. 스테레오택틱 프레임에서 동물을 분리하여 회복실로 옮깁니다.

생리적 기능을 관찰하며 동물이 수술로부터 회복될 때까지 기다립니다. 수술 후 48시간 동안 마취제인 cyroproferrin 10 mg/kg과 항생제인 baytril 5 mg/kg을 투여합니다. ti sapphire 레이저를 켜고 현미경의 전원을 올립니다.

본 실험에 사용된 시스템은 이광자 레이저, OPO 시스템 및 듀얼 갈륨 비소 증폭 PMT를 갖추고 있습니다. 동물을 유도 챔버에 넣고 마취를 유도합니다. 유도 챔버에서 동물을 꺼내어 현미경 아래의 가스 마취 마스크에 놓습니다.

산소 유량을 0.3 L/min으로, 이소플루레인 농도를 1.52%로 낮춥니다. MT 나사 또는 다른 맞춤형 시스템을 사용하여 동물을 맞춤형 현미경 프레임에 고정합니다. 두개창의 수평을 맞춥니다. 참고로, 현미경 제조사의 머리 고정 시스템을 사용할 수도 있으나, 특정 맞춤형 프레임을 사용하면 결과가 더 좋고, 머리 안정성이 향상되며, 만성 실험 중 여러 세션에 걸쳐 일관된 위치 잡기가 가능합니다.

광시야 현미경 설정을 사용하여 저배율 대물렌즈로 후대상피질(retrosplenial cortex)의 한쪽 측면에 시야를 맞춘 후 커버슬립 표면에 초점을 잡습니다. 분화 형태의 아크릴 웰에 물 한 방울을 떨어뜨립니다. 그 후 장작동 거리 수침 대물렌즈로 교체합니다.

물 표면의 메니스커스가 표본과 대물렌즈를 연결할 때까지 대물렌즈를 두개골 창(cranial window) 쪽으로 이동시킵니다. 이광자(two-photon) 설정으로 전환하고 가장 낮은 배율을 사용하여 표본의 상단부터 하단까지 스캔하기 시작합니다. 경막(dura mater)이 교차하는 지점은 비특이적 신호가 강하게 발생하는 글로어(glare) 현상으로 나타납니다.

전체 동적 범위를 커버할 수 있도록 형광 세포의 신호 강도에 따라 GFP 및 mCherry 두 채널 모두에서 현미경 획득 설정을 조정합니다. 수지상 돌기 나무가 다른 세포들과 분리된 적절한 뉴런을 찾은 후, 최저 배율과 5 µm의 Z 거리로 설정된 GFP 필터만을 사용하여 초기 스캔을 수행합니다. 스캔 스택의 최대 투영 영상을 얻고, 이를 색상 반전 처리하여 주석 작성용으로 출력합니다.

원하는 형태학적 세부 사항을 촬영할 수 있는 값으로 줌을 설정합니다. 최대 투영법(maximum projection)을 가이드로 사용하여 GFP 및 mCherry 채널에서 전체 수지상 돌기 구조를 촬영합니다. 본 프로토콜을 통해 후대상피질(retrosplenial cortex) 내의 시냅스 전 및 후 구조를 반복적으로 관찰할 수 있습니다.

이 접근 방식은 수지상 돌기, 시냅스 가시 또는 시냅스 전 뉴런의 형태학적 변화와 상관관계가 있을 것으로 예상되는 행동 조작을 포함하는 만성 실험에 활용될 수 있습니다. 이미징 세션은 어떤 빈도로든 수행할 수 있으나, 동물의 적절한 회복을 돕고 마취 효과를 최소화하기 위해 24시간 간격을 두는 것이 권장됩니다. 이 기술을 적절하게 적용하면 수개월에 걸쳐 여러 번의 이미징 세션을 수행할 수 있습니다.