수성 2 단계 시스템을 사용하여 셀 공동 문화 패턴

이 절차의 전반적인 목표는 완전히 수성 환경에서 세포를 직접 패턴화하는 것입니다. 이는 먼저 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스트린과 같은 긴 사슬 중합체를 세포 배양 배지를 포함하는 별도의 튜브에 용해시킴으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 하나 또는 두 폴리머 용액에서 원하는 파종 밀도로 세포를 트립, 아니화, 수확 및 재현탁

다음으로, 고분자 용액을 세포 배양 접시에 분배합니다. 두 중합체의 비호환성은 두 개의 완전히 수성 액체의 공간적 패터닝을 허용합니다. 셀은 다양한 패턴을 생성하기 위해 고분자 용액 또는 두 고분자 용액 모두에 포함될 수 있습니다.

마지막 단계는 세포가 4시간 이상 접착되도록 허용된 후 폴리머 용액을 제거하고 배양 배지로 대체하는 것입니다. 궁극적으로 명시야 또는 형광 현미경을 사용하여 세포 패터닝을 확인할 수 있습니다. 마이크로 접촉 인쇄와 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포가 마이크로 파이프 패턴과 같은 간단한 도구를 사용하여 완전히 수성 환경에서 패턴화된다는 것입니다.

이 방법은 조직 공학에 세포 이동을 평가하고 세포 간 주각비 및 자가분비 신호 전달을 조사하는 데 사용할 수 있으며, 절차는 학부생인 Abraham과 Takayama 연구실의 대학원생인 Joshua White가 될 것입니다. 먼저 두 개의 서로 다른 폴리머를 실험에 사용할 특정 매체에 용해시킵니다. 이 예에서 PEG라고도 하는 폴리에틸렌 글리콜과 Dextrin이라고도 하는 Dextrin의 분자량은 각각 35킬로달톤과 500킬로달톤입니다.

여기에 표시된 차트와 유사하게 각각 PEG 및 dex 농도가 다른 15ml 원뿔형 튜브에 16개의 2ml 샘플을 준비합니다. 이를 위해 차트에 따라 적절한 양의 PEG와 dex의 무게를 측정하고 두 폴리머가 완전히 용해될 때까지 부드럽게 흔들어 배지에 혼합합니다. 이것은 폴리머가 완전히 용해된 후 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.

솔루션은 흐려야 합니다. 1000Gs에서 5분 동안 샘플을 원심분리하여 상 분리를 확인합니다. 더 조밀한 바닥 단계는 dex가 풍부할 것입니다.

상단 단계는 페그가 풍부할 것입니다. 다음으로, 튜브에 0.1ml의 배지를 천천히 추가하고 20초 동안 샘플을 와류로 가열합니다. 그런 다음 샘플을 다시 원심분리하여 상 분리를 확인합니다.

추가 부피의 배지를 추가한 후 용액이 명확해지면 이 단계를 반복하여 용액이 투명해지고 더 이상 상 분리되지 않을 때까지 샘플을 혼합하고 원심분리합니다. 이는 해당 특정 혼합물에 대한 임계점 임계값에 도달했음을 나타냅니다. 이 시점에서 각 튜브의 최종 중량을 기록합니다.

마지막으로, 면 분리 지점에서 두 폴리머의 중량당 중량 퍼센트를 결정합니다. Bin 노드 곡선을 플로팅하여 Y축에 percent weight per weight peg를 배치하고 X축에 percent weight ped를 배치합니다. 이 곡선은 이 매체에서 PEG와 dex의 얼굴 분리에 대한 임계값 농도입니다.

세포의 배제 패터닝을 시작하려면 bin nodal threshold에 의해 결정된 임계값의 두 배에서 PEG 및 dex의 별도 용액을 준비합니다. 이러한 실험을 위해 10% FBS 및 1% 항생제와 함께 DMEM에 중량 PEG당 5% 중량 및 중량 덱당 12.8% 중량을 추가합니다. 튜브는 완전히 용해되도록 로커에 놓습니다.

다음으로, 본 실험을 위한 배제 패터닝에 사용할 세포를 수확하고, 80% confluence의 hela 세포는 3분 동안 0.5% tripsin을 사용하여 트립화됩니다. 한 번 가을걷이, hemo cytometer를 사용하여 세포의 수를 세십시오 그 후에 펠릿 및 375에 세포를 resuspend하십시오, 5%%나무못이 추가된 매체에 있는 밀리리터 당 000의 세포. 이 농도는 배양될 때 다음 날 합류하게 될 샘플을 생성합니다.

다음으로, 마이크로 피펫터를 사용하여 12.8% 데크 용액의 0.5마이크로리터 방울을 배제 패터닝을 위해 건조한 96웰 플레이트에 분배합니다. Dex 방울은 나중에 사용할 수 있도록 멸균 조건에서 건조할 수 있습니다. 그런 다음 200 마이크로 리터의 PEG 헬라 세포 현탁액을 천천히 우물에 분배합니다.

D 액적을 덮으려면 주변 영역을 채우기 전에 먼저 D 액적을 PEG 용액으로 덮는 것이 중요하며, 이렇게 하면 우물 전체에 액적이 퍼질 때 액적을 방해하는 것을 방지할 수 있습니다. 모든 웰이 조심스럽게 패턴화되고 파종되면 세포 배양 플레이트를 가습 인큐베이터에 넣습니다. 취급하는 동안 접시가 기울어지지 않았는지 확인하고 세포가 12시간 동안 접착된 후 패턴이 손상되지 않도록 평평한 인큐베이터 선반에 놓으십시오.

PEG 용액을 제거하고 200마이크로리터의 배양 배지로 세 번 세척하여 잔류 폴리머를 제거합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 신선한 배양 배지를 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 배양을 주기적으로 모니터링하여 세포 증식 및 배제 구역으로의 이동을 관찰하여 섬 패터닝을 시작합니다.

세포 배양 배지에서 중량 PEG당 5% 중량 및 중량 데크당 12.8% 중량의 용액을 준비합니다. 또한 Island patterning에 사용할 hela 세포를 수확하고 다시 hemo cytometer를 사용하여 사용 가능한 총 세포 수를 결정합니다. 다음 펠릿과 소생.

배지에서 밀리리터당 500만 개의 세포로 세포를 회전시킵니다. 12.8%dex를 계속하면 세포가 heela 세포만큼 잘 부착되지 않으면 24시간 내에 합류에 도달하기 위해 더 높은 농도의 세포가 필요할 수 있습니다. 다음으로, 200마이크로리터의 PEG 용액을 96웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅합니다.

그런 다음 PEG 용액이 들어 있는 각 웰에 0.5마이크로리터의 데크 세포 현탁액 방울을 천천히 추가합니다. 물방울은 바닥으로 가라앉아 배양 표면에 닿습니다. 그런 다음 플레이트를 조심스럽게 인큐베이터에 옮기고 12시간 후에 패턴을 방해할 수 있는 접시가 어느 지점에서도 기울어지지 않도록 주의하십시오.

PEG 용액을 제거하고 200마이크로리터의 배양 배지로 3회 세척합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 신선한 배양 배지를 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 배양을 주기적으로 모니터링하여 세포의 증식과 섬에서 바깥쪽으로 이동하는 것을 관찰합니다.

10% FPS 및 1% 항생제를 사용하여 DMEM에서 중량 PEG당 5% 중량 및 중량 데크당 12.8% 중량의 용액을 준비하여 공동 배양 패터닝을 시작하여 배제 및 아일랜드 패터닝에 사용되는 두 세포 유형을 성장시켜 거의 합류점에 가깝게 만듭니다. 동시에 여기에서는 Hep G two C3 a 간세포 섬을 사용하고 NIH 3 T 3 섬유아세포를 둘러싸고 있습니다. 그런 다음 두 가지 세포 유형을 수확하고 혈류 세포 분석기를 사용하여 별도로 계산합니다.

이 두 가지 세포 유형은 명시야 현미경 펠릿, 섬 패터닝을 위한 Hep G two C3 A 간세포를 사용하여 쉽게 구별할 수 있으며 12.8%의 데크에서 소비합니다. 그런 다음 섬유아세포를 펠렛으로 만들어 배제, 패터닝, 리서스를 5%peg에 현탁시킵니다. 다음으로, 0.5마이크로리터의 D 세포 현탁액 방울을 건조한 96웰 플레이트에 분배하고 200마이크로리터의 페그 세포 현탁액으로 덱스 방울을 부드럽게 덮습니다.

그런 다음 12시간 후에 플레이트를 인큐베이터로 옮깁니다. 매체를 제거하고 200마이크로리터의 배양 배지로 세 번 헹굽니다. 그런 다음 200마이크로리터의 신선한 배양 배지를 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다.

마지막으로, 공동 배양 모니터링 알부민 염색 강도를 사용하여 섬유아세포 공동 배양의 유익한 효과를 평가할 수 있습니다. 다양한 수성 2상 시스템을 형성하는 데 필요한 고분자 농도는 여기에서 bin nodal 곡선 위의 농도에서 bin nodal curves로 설명됩니다. 시스템은 빈 노드 곡선 아래에 두 단계를 형성합니다.

이에 대한 해결책은 최소 2회 이상의 투명한 단상 2상 시스템입니다. 이항 곡선에서 발견된 농도는 이 비디오에 설명된 수성 2상 시스템에서 사용하기에 충분합니다. 그들의 사용의 첫 번째 예는 작은 영역에 세포가 없는 상태로 둘 수 있는 제외 패턴입니다.

아일랜드 패터닝은 작은 영역에 셀이 앉을 수 있는 배제 패터닝과 정반대의 것을 만듭니다. 이 두 절차의 조합은 여기에 표시된 것처럼 세포 섬을 다른 세포 유형으로 둘러쌀 수 있는 고유한 공동 배양을 형성하는 데 활용될 수 있습니다. 배제 패터닝을 사용하여 도금된 헬라 세포는 증식하고 이동하여 공극을 채웁니다.

시간이 지남에 따라. 공극의 크기를 모니터링하여 다양한 조건에서 세포 이동 및 성장에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 반면에 아일랜드 패턴화는 세포 성장을 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

섬과 배제 패턴의 조합은 잘 정의된 공동 문화 영역을 생성합니다. 여기에 보이는 것은 섬유아세포 세포로 둘러싸인 간세포섬입니다. 이 군체는 문화에서 적어도 4일 동안 조직을 유지하는 것으로 밝혀졌습니다.

이 시스템을 사용하면 동일한 플레이트에서 여러 세포 섬을 성장시킬 수 있습니다. 섬으로 단독으로 성장할 때, 간세포는 섬유아세포와 공동 배양에서 성장할 때보다 알부민을 약간 적게 생성했습니다. 이 절차를 시도하는 동안 임계 농도의 두 배로 폴리머 농도를 사용하여 2상 용액을 형성하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 수성 2상 시스템을 공식화하고 이를 사용하여 셀을 패턴화하고 형상을 정의하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.