단백질과 세포 교도소에 대한 2 차원 문양의 기판 만들기

다음 실험의 전반적인 목표는 단백질 흡수 및 세포 성장 제어를 위한 2차원 패턴의 기질을 개발하는 것입니다. 이는 포토리소그래피를 사용하여 마이크로 컨택트 인쇄용 A-P-D-M-S 스탬프를 생산하는 데 사용되는 패턴 마스터를 제작함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 단백질을 흡수하고 저항하는 영역이 있는 패턴을 생성하기 위해 마이크로 접촉 인쇄를 포함하는 패턴

다음으로 단백질과 세포를 기질에 추가하여 패턴을 시각화하고 연구합니다. 형광 및 얼굴 대비 현미경을 기반으로 이러한 패턴 기질에서 우수한 단백질 및 세포 감금을 보여주는 세포 성장 및 행동 결과를 얻을 수 있습니다. 단백질의 MicroCon 프린팅과 같은 다른 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 글리콜 종단 단층이 패턴의 배경에서 비특이적 단백질 및 세포 흡수에 저항한다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 인쇄된 각 패턴에 대해 적절한 스탬핑 기술을 최적화해야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 패터닝된 마스터 센터, 스핀 코더의 실리콘 웨이퍼의 준비를 시작하기 위해, 그리고 2사이클 스핀 프로그램의 초기 단계에서 웨이퍼를 아세톤으로 헹굽니다. 스핀 프로그램의 두 번째 단계에서 아세톤은 스핀 시작 시 깨끗하고 건조한 웨이퍼를 남기고 증발하고 웨이퍼에 포토레지스트를 적용한 다음 앞에서 설명한 조건을 사용하여 스핀 코팅을 합니다.

균일성이 높은 핫 플레이트를 사용하여 섭씨 110도에서 2분 동안 포토 레지스트 코팅 웨이퍼를 소프트 베이크합니다. 다음 사진 패턴입니다. 포토 레지스트는 마스크 얼라이너 시스템과 적절한 마스크를 사용하여 코팅 된 웨이퍼를 사용합니다.

먼저 마스크 얼라이너의 진공 트럭에 기판을 놓습니다. 그런 다음 마스크를 홀더 트레이에 삽입하고 진공 청소기를 켜서 마스크를 제자리에 고정하여 마스크와 기판 사이의 접촉이 양호한지 확인합니다. 마스크와 만날 때까지 기판을 올립니다.

얼라이너의 광학 장치를 사용하여 접촉이 양호한지 확인하십시오. 마지막으로 램프를 켜서 리소그래피 마스크를 통해 기판을 자외선에 노출시킵니다. 현상액에서 패턴화된 웨이퍼를 1분 45초 동안 부드러운 교반으로 현상합니다.

반도체 등급의 탈이온수로 철저히 헹구고 UV 필터가 있는 현미경을 사용하여 질소 가스 체크 패턴 현상의 흐름으로 건조시킵니다. 10 대 1 중량의 수지 경화제를 준비하여 이 절차를 시작합니다. 시가 180 2의 혼합물.

거품이 보이지 않을 때까지 PDMS 커버 마스터인 진공 건조제 Degas에서 일회용 페트리 접시에 혼합물을 넣은 사진 패턴의 웨이퍼를 덮습니다. 마스터가 접시 바닥에 있는지 확인한 후 스탬프를 섭씨 65도의 오븐에서 1.5시간 동안 경화시킵니다. PDMS 스탬프가 경화되면 마스터에서 스탬프를 잘라내고 적절한 크기로 자릅니다.

먼지와 파편으로부터 보호하기 위해 덮개가 있는 용기 특징면이 위로 향하게 하여 스탬프를 보관하십시오. 금속 증착을 위해 기판을 준비하려면 먼저 원형 유리 커버 슬립을 산소 플라즈마로 10분 동안 처리합니다. 그런 다음 덮개 슬립을 탈이온수로 두 번 헹구고 물로 헹구기 후 헹굼 사이의 질소 가스 흐름으로 건조하고 에탄올로 두 번 헹구고 헹굼 사이에 질소 가스 흐름으로 다시 건조합니다.

다중 포켓 전자빔 증착 시스템을 사용하여 50 옹스트롬 티타늄과 150 옹스트롬 금을 증착합니다. 티타늄 층과 금층의 증착 사이에 증발기를 구부리지 마십시오. PDMS 스탬프를 에탄올로 헹구고 완전히 말리십시오.

질소 가스를 사용하여 완전히 코팅될 때까지 스탬프에 스탬핑 용액을 적게도 도포합니다. 스탬프를 질소 가스로 완전히 말리십시오. HEXA Decane 파일의 마이크로 접촉 인쇄는 PDMS 스탬프의 기능에 따라 다르며 이 절차에서 가장 어려운 측면 중 하나입니다.

성공적인 스탬핑을 위해서는 균일한 압력을 가하는 우수한 기술의 개발이 필요합니다. 스탬핑 중. 기존의 공기 중 마이크로 접촉 인쇄의 경우 스탬프를 금 기판에 부드럽게 누르고 단층이 15초 동안 형성되도록 합니다.

또는 매우 작은 형상과 높은 종횡비로 구성된 패턴의 경우 금 기판을 18.2메가옴의 탈이온수가 들어 있는 페트리 접시에 넣고 기판이 잠기도록 합니다. 그런 다음 스탬프를 금 기판에 부드럽게 누르고 모노 A 층이 15 초 동안 형성되도록합니다. 다음으로, 스탬핑된 기판을 질소 가스로 건조된 에탄올로 두 번 헹굽니다.

헹굴 때마다 기질을 페트리 접시에 넣고 기질을 다시 채우는 용액으로 덮습니다. 증발을 방지하기 위해 매개변수로 접시를 밀봉하십시오. 배경 단층이 12-14시간 동안 어둠 속에서 형성되도록 합니다.

마지막으로, 뒷면 충전 용액에서 패턴이 있는 커버 슬립을 제거하고 각 헹굼 후 질소 가스로 에탄올 건조로 두 번 헹굽니다. 패턴이 있는 커버 슬립에 단백질을 적용하려면 커버 슬립을 작은 페트리 접시 또는 세포 배양 챔버 덮개에 500마이크로리터에서 1밀리리터의 delcos 인산염 완충 식염수로 덮습니다. DPBS는 단백질 배양 중에 기질을 완전히 덮어야 합니다.

균일한 단백질 커버리지를 보장하려면 DPBS에 농축된 단백질 용액을 추가하고 여러 번 피펫팅하여 용액을 혼합합니다. 단백질 혼합물을 기질과 함께 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후 DPBS로 기질을 철저히 헹구어 결합되지 않은 단백질을 제거하고, 기질을 건조시키거나 공기 수분 계면을 통해 가져오지 않도록 주의하십시오.

세 번 헹구고 나면 DPBS를 흡입합니다. 그런 다음 약 500마이크로리터의 완전한 세포 성장 배지를 추가하여 젖은 기질을 유지합니다. 기질을 헹구는 데 사용되는 성장 매체를 교체하십시오.

새로운 배지를 사용하면 이제 기판을 세포로 도금할 준비가 되었습니다. 일반적으로 평방 밀리미터당 30-200개의 셀이 기판에 도금됩니다. 이 이미지는 유리 커버 슬립에 스탬프 특징을 아래를 향하게 배치하여 현미경으로 시각화한 A-P-D-M-S 스탬프를 보여주며, 스케일 바는 100마이크로미터입니다.

적절한 스탬핑은 LOR 6 47 표지된 피브로넥틴과 같은 형광 표지 단백질의 적용으로 시각화할 수 있는 날카롭고 명확한 단백질 패턴을 생성합니다. chk one 세포를 단백질 패턴에 국한시키는 것이 여기에 나와 있습니다. 이 이미지에서 배율 막대는 100마이크로미터입니다.

대안적으로, SU 고정 후 단백질 패턴을 시각화하기 위해 면역조직화학(immunohistochemistry)을 사용할 수 있습니다. 여기서, LOR 3 50 공액 안티 라미네이트 항체를 사용하여 E 18 마우스 해마 뉴런으로 파종된 패턴을 시각화하고, MIT 추적기 red five 80으로 염색된 E 18 마우스 해마 뉴런은 세포 성장이 단백질 패턴에 잘 국한되어 있음을 보여줍니다. 이 기술은 쉽게 마스터할 수 있지만, LOR 6 47 복합 피브로넥틴 흡수에 의해 시각화된 이러한 패턴 기질 준비에서 알 수 있듯이 몇 가지 일반적인 문제가 발생할 수 있습니다.

DPBS에서 농축된 단백질 용액을 충분히 혼합하지 않고 단백질을 적용하면 단백질 패턴이 고르지 않을 수 있습니다. 부적절한 스탬핑은 부분적인 패턴 전송 또는 스탬프 붕괴로 이어질 수 있습니다. 또한 흡수된 단백질을 포함하는 패턴 기판을 공기에 노출시키면 단층이 파괴되어 저항이 감소할 수 있습니다.

백그라운드에서 수중 패터닝은 기존의 마이크로 접촉 인쇄 및 공기로 인쇄하기 어려운 작은 특징을 가진 패턴을 생성할 수 있습니다. 이 두 이미지는 공기 중 동일한 PDMS 스탬프로 인쇄된 동일한 패턴의 다른 영역을 보여주거나 왼쪽 이미지에 표시된 탈이온수 지지선은 패턴의 작은 특징만 성공적으로 인쇄되지 않았음을 보여줍니다. 눈금 막대는 20마이크로미터입니다.일단 마스터하면 이 기술을 제대로 수행하면 18시간에서 24시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 패턴 기판을 제작하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. A-P-D-M-S 스탬프를 생산합니다. 마이크로 접촉 인쇄를 활용하여 패턴 금 기판을 준비하고 단백질과 세포를 사용하여 이 패턴을 시각화합니다.