Name: 패터닝 단백질과 세포의 다목적 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 배우세요 저압 진공을 이용해 미세유체 채널에 세포와 기질을 채우는 다목적 패터닝 방법을. 이 기술은 세포 간 및 세포-단백질 상호작용 연구에 활용됩니다.

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이 연구를위한 자금 조달이 (FHK에) 척수 연구 (NJCSCR)에 뉴저지위원회에 의해 제공되었다 (BLF에) CSCR14IRG005을 부여 NIH는 (CHC에) R15NS087501 및 (ETA까지) FM 커비 재단을 부여합니다.

참고 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 이 프로토콜에서 사용되는 화학 물질 중 일부는 독성 및 발암 성이다. 독성 또는 산 / 염기 재료를 사용하는 경우 모든 적절한 안전 사례 (흄 후드, 글러브 박스) 및 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지, 폐쇄 발가락 신발)를 사용하십시오. 소프트 리소그래피 사용하여 포토 리소그래피를위한 마스터 금형 1. 제작 <ol><li> 컴퓨터 지원 설계 (CAD)의 그리기 도구를 사용하여 마이크로 채널의 레이아웃을 그린다. </li><li> 레이저 마스크 작가를 사용하여 빈 마스크 판에 레이아웃을 인쇄합니다. </li><li> 어떠한 용매는 웨이퍼 상에 남지 않도록 질소 공기 총 이소프로판올 건조한 다음, 아세톤으로 4 인치 실리콘 웨이퍼를 헹군다. </li><li> 5 분 동안 200 ℃에서 핫 플레이트로 소성하여 웨이퍼 탈수. </li><li> 마이크로 채널의 원하는 높이에 대한 설계 네가티브 포토 레지스트를 선택합니다. 에프또는 예를 들어, 50 ㎛의 높이와 미세 채널을 얻었다 네가티브 포토 레지스트 SU-8 (50)를 사용한다. </li><li> 웨이퍼를 실온까지 냉각되도록 한 후, 스핀 코터의 척 상에 웨이퍼를 정렬. </li><li> 웨이퍼의 중심에 네가티브 포토 레지스트 4 ㎖ (웨이퍼 1 ㎖ / 인치 직경)를 분배. </li><li> 스피너를 사용하여 두 단계의 스핀 사이클에 코팅을 웨이퍼 스핀. 첫째, 10 초 100 RPM / S의 가속도와 500 rpm의 확산 사이클을 적용합니다. 그 다음 웨이퍼 상에 포토 레지스트의 50 μm의 코팅을 얻기 위해 30 초 동안 300 rpm으로 / S 2의 가속도와 2,000 rpm의 회전주기를 적용합니다. </li><li> 소프트 베이크와 제조자의 지시에 따라, 핫 플레이트에 두 단계에서 웨이퍼. 포토 레지스트의 50㎛의 코팅 먼저 프리 베이크 6 분 동안 65 ° C에서의 웨이퍼 후 바로 20 분 동안 95 ° C에서 웨이퍼 베이킹 게시 열판 온도 램프 업. </li><li> 웨이퍼를 실온까지 냉각 한 후로드 허용리소그래피 무대에 대 웨이퍼. </li><li> 마스크 얼 라이너를 사용하여 웨이퍼상의 마스크를 맞추고 220 mJ을 총 UV 조사량을 적용 (146)의 1.5 mW의 / ㎠의 강도에서 (제조자의 지시에 따라) UV 광에 웨이퍼를 노출 / cm 2 필요 포토 레지스트의 50 μm의 두께 층. </li><li> 핫 플레이트에 두 단계에서 웨이퍼에 포스트 노출 베이킹을 적용합니다. 포토 레지스트의 50 ㎛의 코팅 먼저 프리 베이크 즉시 1 분, 65 ℃에서 웨이퍼를 5 분 동안 95 ° C에서이를 베이킹 게시 열판 온도 램프 업. </li><li> SU-8 현상액에 웨이퍼를 침지하고, 기능, 웨이퍼에 명백해질 때까지 가볍게 흔들어 웨이퍼의 개발. 50 μm의 두께 포토 레지스트 ~ 6 분의 웨이퍼를 개발한다. </li><li> 이소프로판올 및 에탄올 과잉 현상을 씻어 다음, 질소 공기 총을 가진 웨이퍼를 건조. </li><li> 하드 15 분간 150 ℃에서 핫 플레이트 상에 실리콘 웨이퍼를 굽는다. </li><li> 놓고silanizing 제 25 μL로 데시 케이 터에서 웨이퍼 트리 데카 - 1,1,2,2- tetrahydrooctyl -1- 트리클로로한다. 참고 : silanizing 에이전트가 적절한 개인 보호 장비, 따라서 산 / 염기 흄 후드에서 사용되어야한다, 부식성 (보안경, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지, 신발 - 발가락을 휴관). </li><li> 5 분 동안 진공을 적용하고 진공을 해제하지 않고 30 분 동안 실란의 증기에 웨이퍼를 노출합니다. </li><li> 적절하게 크기의 페트리 접시에 웨이퍼를 전송합니다. </li></ol> 접착 테이프를 사용하여 소프트 리소그래피를위한 마스터 금형 2. 제작 <ol><li> 캐드 드로잉 도구를 사용하여 마이크로 채널의 레이아웃을 그리고 흰 종이에 드로잉을 인쇄 할 수 있습니다. </li><li> 이소프로판올 설계를 수용 한 후 공기 총 슬라이드를 건조시키는 것이 충분히 큰 유리 슬라이드를 청소한다. </li><li> 세정 된 유리 슬라이드에 접착 테이프를 부착합니다. 공기 방울 트랩에주의하지 말라. </li><li> GLA의 측면을 테이프SS는 테이프 쪽이 위로, 설계와 용지에 밀어 넣습니다. </li><li> 참고로 용지 설계를 사용하여 유리 슬라이드에 테이프를 절단하고 유리 슬라이드의 원치 않는 영역에서 테이프를 벗겨 메스를 사용한다. </li><li> 공기 총을 가진 유리 이소프로판올과 슬라이드 한 다음 건조를 씻어. 30 분 동안 65 ° C의 오븐에서 유리 슬라이드 굽는다. </li><li> 부드럽게 기포를 제거하고, 슬라이드를 실온으로 냉각 할 수 있도록 고무 롤러 테이프 롤오버. </li></ol> PDMS의 장치 3. 소프트 리소그래피 제작 <ol><li> 10의 비율로 PDMS 엘라스토머와 경화제를 혼합 1은 (W : w) 격렬하게 혼합 교반하고, 기포가 혼합물에 나타나지 않을 때까지 다음의 진공 챔버 내에 배치하여 상기 혼합물을 탈기. </li><li> 거품이 사라 모든 공기까지 1 ~ 2 mm 두께의 PDMS 층과 탈기를 얻기 위해 배양 접시에 실란 화 된 실리콘 몰드 또는 접착 테이프 금형 위에 혼합물을 붓는다. </li><li> 오븐에서 경화 PDMS2 시간 동안 65 ° C에서. </li><li> 적어도 5mm 떨어진 기능에서 PDMS 층을 잘라 메스를 사용하고 집게를 사용하여 금형 해제 경화 PDMS 벗겨. </li><li> 도 2a 및도 4b에 도시 된 바와 같이 1㎜의 생검 단일 입구 구멍은 바람직하게는 마이크로 채널 네트워크의 끝에서, 마이크로 아무 곳 펀치 펀치. </li><li> 장치에 흡착 된 먼지 입자를 제거하기 위해 접착 테이프로 캐스팅 PDMS를 청소합니다. 멸균 탈 이온수 (DI) 물에 이어 70 % 에탄올의 용액으로 세척하여 PDMS 마이크로 채널 장치 (PDMS 캐스트)을 소독하고, 30 분 동안 UV에 노출. </li><li> 사용할 때까지 멸균 페트리 접시에 멸균 PDMS 장치를 유지합니다. </li></ol> 4. 기판 패터닝 <ol><li> 멸균 유리 커버 슬립이나 배양 접시에 핀셋을 사용하여 캐스팅 멸균 PDMS를 놓고 핀셋의 끝을 사용하여 부드러운 압력을 적용합니다. 참고 : PDMS 캐스트는 GL와 컨 포멀하지만 가역 실을 수 있습니다엉덩이 커버 슬립이나 접착제를 사용하지 않고 마이크로 채널을 형성 배양 접시. </li><li> 완전히 주입구를 덮는 입구에 기질 용액 - (40 μL 20) 방울을 놓는다. 마이크로 채널의 입구에 소듐 테트라 보레이트 완충액 PDL의 20 μL 방울을 배치하여 패턴 폴리 D 라이신 (PDL). </li><li> 10 분 동안 (생물학 실험실에서 진공 집에 상당), 거품의 형태로 채널에서 나오는 공기를 준수 ~ 254 mmHgA의 진공에서 배양 접시를 넣어. </li><li> 진공을 해제하고 마이크로 채널로 유입되는 기질 용액을 관찰합니다. </li><li> 기판 준수에 대한 적절한 조건에서 접시를 품어. 표 1 및 배양 조건 2 (이 기판에 따라 다릅니다)를 참조하십시오. PDL 패터닝를 들어, 37 ° C에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 조심스럽게 멸균 핀셋을 사용하여 PDMS 스탬프를 벗겨 DI 물에 세 번 유리 커버 슬립에 패턴을 씻는다. </li&gt; <li> 접시 또는 유리 커버 슬립을 커버하고 밤새 37 ° C에서 배양을 페트리 접시에 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) 용액을 첨가. 참고 :이 코팅되지 않은 지역이 아닌 특정 부착을 줄일 수 있습니다. </li><li> 1 % BSA 용액, 및 상기 패터닝 된 기판 대기음은 이제 사용할 준비가되어있다. </li></ol> 세포의 5. 간접 패터닝 <ol><li> 무 혈청 배지에서 세포 현탁액을 준비한다. 셀 타입 및 셀 밀도를 표 1에 나열되어있다. </li><li> 패터닝 된 배양 접시에 세포 현탁액을 첨가하고 완전히 세포 현탁액의 패턴 영역 잠수함. </li><li> 세포 패터닝 기판에 부착 할 수 있도록 15 분 동안 인큐베이터 내에서 37 ° C에서 배양 접시를 부화. </li><li> 페트리 접시에서 초과 세포 현탁액을 대기음 부드럽게 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해 10 초 동안 흔들어 섞으면 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)으로 패턴 화 된 세포를 세 번 씻는다. </li><li> ㄱ 추가ppropriate 배양 패터닝 된 세포 배양 배지로하여 CO2 인큐베이터에서 37 ° C에서 상기 패터닝 된 세포를 배양한다. </li></ol> 세포의 6. 직접 패터닝 주 :이 기술은 세포 기질 또는 코팅없이 조직 배양 표면에 패터닝이 기술에서, 단계 5와 달리 단계 5에 기재된 간접 셀 패터닝의 대안이다. <ol><li> DI 물,이어서 70 % 에탄올의 용액으로 세척하여 미세 유체 소자를 소독. </li><li> PDMS로 세포 부착을 방지하기 위해, 1 % BSA 용액에 하룻밤 침지 장치. </li><li> 실온에서 장치를 건조하고 조직 문화 처리 된 배양 접시의 바닥에 부착. </li><li> 무 혈청 배지에서 세포 현탁액을 준비한다. 셀 타입 및 셀 밀도를 표 2에 나와있다. </li><li> 을 채우도록 세포 현탁액 - (8 μL 4) 액 적을 배치마이크로 채널은 입구에 완전히 주입구를 덮는. </li><li> 10 분 동안 진공 상태에서 페트리 접시에 넣고 기포의 형태로 채널에서 나오는 공기를 관찰한다. 진공을 해제하고 마이크로 채널로 유입되는 세포 현탁액을 관찰합니다. </li><li> 배양 조건에 따라 세포 접착 성을 촉진하는 인큐베이터에서 배양 접시를 부화하기 표 2에 언급 된 (셀 패턴의 유형에 의존). PDMS의 장치를 잠수 페트리 접시에 PBS를 추가합니다. </li><li> 껍질 PDMS 조심스럽게 핀셋으로 배양 접시 끄고 PBS와 패턴을 씻는다. 페트리 접시에 세포 배양 배지를 추가하고 배양기에서 세포 배양을 배치합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.

기존의 포토 리소그래피 소프트 리소그래피, 장비, 재료 및 기존의 포토 리소그래피를 사용하는 데 필요한 기술을위한 금형 제작을위한 잘 확립 된 기술이지만 대부분의 실험실에 쉽게 사용할 수 없습니다. 이 자원에 대한 접근없이 실험실을 위해, 우리는 마이크로 유체 장치를위한 비교적 단순한 기능 주형을 만드는 방법으로 접착 테이프 제조를 제시 하였다. 이 방법은 어떤 기관이 작성하고 쉽게 사용할 수있는 도구와 연구 목적을위한 미세 유체 장치를 이용 할 수 있습니다. 접착 테이프 방식은 저비용 데스크탑 비닐 커터 (31)로 개선 될 수있다. 화상 비닐 커터 재현성, 해상도뿐만 아니라 레이아웃 복잡도를 증가시킬 수있다. 이러한 옵션, 기존의 포토 리소그래피, 바탕 화면 절단기, 또는 접착 테이프 제조의 각 신중 충분하다 어떤 방법을 고려해야합니다 서로 다른 기능과 제한 사항 및 연구자를그들의 필요합니다. 경화 PDMS에, 디메틸 실록산의 긴 ...

조직 공학 및 바이오 센서에서는 μm의 규모 단백질 및 세포의 공간 조직을 제어하는 능력은, 마지막 네 수십 1, 2, 3 위로 갈수록 중요 해지고있다. 단백질 및 세포의 정확한 공간적 조직 연구자들은 세포 증식을 유도하고, 바이오 센서 4, 5, 6, 7, 8의 제조에 생체 분자를 고정하기 위해, 세포의 유사하거나 또는 상이한 유형을 포함하는 셀과 기판 사이의 상호 작용을 조사 할 수있다 9. 패터닝 단백질의 현재의 방법은 포토 패터닝 및 마이크로 콘택트 인쇄를 포함한다. 포토 패터닝은 ultr에 노출시 가교 감광 재료를 사용바이올렛 (UV) 빛. (UV 광 투과를 방지하는 어두운 영역과 투명 영역으로 구성된) 포토 마스크에 관한 UV 빛은 생체 물질 또는 셀 (10), (11)의 후속 연결을 위해 사용할 수있는 특정 지역에 가교 결합시킨다. 이 방식은 매우 정확하고 배양 표면의 지형을 정밀하게 제어 할 수 있지만, 이는 UV 방사 (12)에 의해 패터닝 될 수 UV 성 생체 제한된다. 마이크로 콘택트 인쇄는 특정 단백질 13, 14 패턴의 또 다른 인기있는 방법입니다. 이 방법에서, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 스탬프 선택된 생체 분자 기판의 용액에 침지되기 전에 표면 개질 다양한 시약으로 처리한다. 그 다음 부드럽게 따라서 배양 표면에 생체 분자를 &quot;스탬프&quot;유리 커버 슬립 또는 다른 표면 상에 가압된다. 호Wever에게는 스탬핑은 PDMS 15 스탬프 표면에 생체 분자의 습윤성뿐만 아니라 전송 될 수있는 물질의 종류로 제한된다. 세포를 직접 패터닝은 더 어려울 수 및 특정 세포 부착 분자 (16) (17)와 스위칭 기판 공판 기반 방법 또는 패터닝과 같은 복잡한 방법에 의존 할 수있다. 이러한 방법으로 인해 호환 세포 접착 기재의 부족 패턴 셀 능력에 제한이 프로세스의 호환성이 중요한 생물학적 세포 및 제약 패터닝 재생의 불일치 및 절차의 복잡도와 함께 작동한다. 예를 들면, 전환 가능한 기질 맞춤 기판 &lt;공정 17에서 사용 된 UV 광 및 열 노출시 열화없이 특정 세포 유형에 대한 그들의 부착 전환 모든 세포 유형을 위해 설계 될 필요<html> SUP 클래스 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 18, 19, 20. 스텐실 기반의 패터닝 방법은 패턴 셀 능력에 다목적; 그러나, 게다가 16, 21에 해당하는 두께로 PDMS 스텐실을 제조하는 것이 곤란하다. 1) 미세 유체 채널의 제조에 용이하고 다양한 세포와 ​​기질 2) 적합성 : PDMS 미세 유체 채널로 세포를 직접 주입은 몇 가지 장점 등이있다. 그러나, 기포를 감소시키는 플라즈마 세정 또는 다른 방법을 사용하지 않고 PDMS의 소수성에 주입 공정 중에 기포 포착의 보급 문제는 어려운 일관 유리 또는 플라스틱 표면 (21)상의 패턴 화 된 세포를 생성 할 수있다. 이 작품은, 모세관 마이크로 몰딩 (22), (23)에 확장아가씨 = &quot;외부 참조&quot;&gt; 24, 25, 26는 마이크로 채널에 단백질 및 세포 현탁액을 주입하는 방법을보고한다. 여기에 사용 된 방법은 기판의 패터닝 및 특정 세포 유형의 직간접 패터닝을 나타낸다. 이 기술은 PDMS의 높은 소수성을 극복 PDMS (27)의 가스 투과성을 이용하여 하나의 기판 또는 세포 주입시 기포의 존재를 제거한다. 이 논문은 여러 가지 기판과 세포 유형과 기술을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 문서에서는 또한 기존의 포토 리소그래피뿐만 아니라 자원에서 유용 간단하고 저렴한 비용으로 접착 테이프 방법 제한 설정 28, 29를 사용하여 소프트 리소그래피를위한 금형의 제작을 강조한다.

<table><tbody><tr><td>CorelDRAW X4 CAD 도면 도구</td><td>Corel Corporation, Canada</td><td>X4 버전 14.0.0.701</td><td>미세 유체 장치의 레이아웃을 그리는 데 사용되는 CAD 도구</td></tr><tr><td>레이저 프린터 HP</td><td>Hewlett Packard, CA</td><td>1739629</td><td>접착 테이프 기법을 위한 미세 유체 장치의 레이아웃을 인쇄하는 데 사용</td></tr><tr><td>Bel-Art Dessicator</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>08-594-16B</td><td>PDMS 혼합물</td></tr><tr><td>을 탈기하는 데 사용됩니다.접착 스카치 테이프</td><td>3M 제품, MN</td><td>테이프 600</td><td>접착 테이프 Master</td></tr><tr><td>PDMS Sylgard 184</td><td>Dow Corning, MI</td><td>1064291</td><td>주조 폴리머</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>08-772-23</td> PDMS 스테인레스 스틸 메스 블레이드가있는 <td>주조를 위해 금형을 유지하는 데 사용</td></tr><tr><td>(# 11)</td> <td>Feather Safety Razor Co. Ltd. Japan</td><td>2976 # 11</td><td>PDMS를 절단하는 데 사용</td></tr><tr><td>핀셋</td><td>Ted Pella, CA</td><td>5627-07</td><td>유리 슬라이드를 벗기는 동안 PDMS 캐스트를 처리하는 데 사용</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>12-546-2</td> 기판 유리 슬라이드<td>를 패턴화하는 표면으로 사용</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>12-544-4</td> 기판 고무 롤러 Dick Blick Art Materials, IL 40104-1004<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>를 패턴화하는 표면으로 사용기포를 가두지 않고 유리에 접착 테이프를 부착하는 데 사용</td></tr><tr><td>레이저 마스크 라이터</td><td>Heidelberg Instruments, 독일</td><td>DWL66fs</td><td>포토리소그래피 제조 공정에 사용되는 석영 마스크 제작에 사용</td></tr><tr><td>EVG Mask Aligner(포토리소그래피 UV 노출 도구)</td><td>EV Group, Germany</td><td>EVG 620T(B)</td><td>포토레지스트를 자외선에 노출시키는 데 사용</td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>Headway Headway Research Inc, TX</td><td>PWM32-PS-CB15PL</td><td>실리콘 웨이퍼의 포토레지스트를 스핀 코팅하는 데 사용</td></tr><tr><td>포토레지스트 SU-8 50</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y131269</td><td>금형 제작에 사용되는 네거티브 포토레지스트</td></tr><tr><td>SU-8 Devloper</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y020100</td><td>포토레지스트 개발자</td></tr><tr><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane</td><td>UCT Specialties, PA</td><td>T2492-KG</td><td>PDMS 접착을 피하기 위한 코팅 금형</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>190764</td><td>세척 용매</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>24102</td><td>살균 용매</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine hydrobromide(PDL)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P0899-10MG</td><td>PDL 용액은 사붕산나트륨 완충액</td></tr><tr><td>라미닌</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>L2020</td><td>에서 0.1mg/mL로 만들어집니다.라미닌은 10 &micro로 분주되었습니다. L 분취 및 20 &micro로 희석; g/&마이크로; L 사용 전 PBS</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>BP1605100</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>C2C12 Myoblast cell lline</td><td>ATCC, VA</td><td>CRL-1722</td><td>C2C12 패터닝</td></tr><tr><td>PC12 세포주</td><td>ATCC, VA</td><td>CRL-1721</td><td>PC12 패터닝</td></tr><tr><td>콜라겐 유형 1, 쥐 꼬리</td><td>BD Biosciences</td><td>40236</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, MA</td><td>11965-084</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>말 혈청, 열 비활성화</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>26050-070</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>팔로이딘-테트라메틸로다민 B 이소티오시아네이트(TRITC)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P1951</td><td>세포 라벨링</td></tr><tr><td>Calcein-AM live dead cell Assay kit</td><td>Invitrogen, MA</td><td>L-3224</td><td>세포 생존력 분석</td></tr><tr><td>생검 홀 펀치</td><td>Ted Pella, CA</td><td>15110-10</td><td>PDMS에 천공된 구멍</td></tr></tbody></table>

패터닝 단백질과 세포의 다목적 방법

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

기질 및 세포 패터닝 기술은 세포 생물학에서 세포 간 및 세포 간 및 세포 간 상호 작용을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 기존의 패터닝 기술은 단순한 모양, 작은 영역 및 선택한 바이오 재료에서만 잘 작동합니다. 이 기사에서는 음압을 사용하여 세포 현탁액과 기질 용액을 복잡하고 긴 폐쇄형(막다른 골목) 폴리디메틸실록산(PDMS) 마이크로 채널로 분배하는 방법을 설명합니다. 이 방법을 통해 연구원들은 피브로넥틴, 콜라겐, 항체(Sal-1), 폴리-D-라이신(PDL) 및 라미닌을 포함한 여러 기질을 패턴화할 수 있습니다. 기질의 패터닝을 통해 다양한 세포를 간접적으로 패터닝할 수 있습니다. 우리는 C2C12 근아세포, PC12 신경 세포주, 배아 쥐 피질 뉴런 및 양서류 망막 뉴런을 테스트했습니다. 또한, 우리는 이 기술이 세포 현탁액에 저진공을 간단히 적용하여 미세유체 채널에서 섬유아세포를 직접 패턴화할 수 있음을 보여줍니다. 저진공은 세포 생존율 분석에서 나타난 바와 같이 세포 생존율을 크게 감소시키지 않습니다. 다른 세포 및 기질 유형에 대한 방법의 적용에 대한 수정이 논의됩니다. 이 기술을 통해 연구원들은 이국적인 재료나 장비 없이 세포와 단백질을 특정 패턴으로 패턴화할 수 있으며 진공이 있는 모든 실험실에서 수행할 수 있습니다.

이 방법은 단백질 및 마스터 주형이 이루어지면 거의 모든 생물 실험실에서 10 μm의 가능한 장비 한 작은 치수 데드 엔드 미세 유체 채널을 사용하여 세포의 간접 패터닝의 패터닝을 허용한다. 이 기술은 기존의 소프트 리소그래피, 또는 접착 테이프의 제작 (도 1) (28) (29)로 작성된 PDMS 미세 유체 채널을 사용하여 생성 된 PDMS 미세 유체 채널을 이용할 수있다. 우리는 이전에 광 수용체 4 (30)의 축삭지도의 평가를위한 신경 세포의 간접 패턴이 절차의 사용을 증명하고, 지금은 다양한 기원의 몇 가지 추가 세포 유형에 사용을 증명하고있다. 폴리 - D - 라이신 (PDL)에 패턴 배아 쥐의 대뇌 피질의 뉴런과 라미닌 ...

이 보고서는 저압 진공을 사용하여 생물학 연구를 위한 세포와 기질로 미세유체 채널을 채우는 간단하고 수행하기 쉬운 기술을 설명합니다.

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

본 절차의 전반적인 목표는 대부분의 생물학 실험실에서 사용할 수 있는 간단한 벤치탑 도구를 사용하여 세포 또는 기질을 복잡한 긴 폐쇄형 미세유체 채널에 배치함으로써 패턴화하는 것입니다. 이 방법은 세포 간 상호작용 및 세포-단백질 상호작용에 관한 생물학 분야의 핵심 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수행하기 쉽고 대부분의 생물학 실험실에서 쉽게 구할 수 있는 도구들만 필요하다는 점입니다.일반적으로 이 방법이 처음인 연구자는 연구자가 선택한 세포 및 기질에 맞춰 배양 조건을 최적화해야 하므로 어려움을 겪을 수 있습니다. PDMS 스탬프와 용액을 적절한 위치에 배치하는 것이 실험의 재현성을 크게 향상시키기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 먼저 CAD 제도 도구를 사용하여 마이크로채널의 레이아웃을 설계하는 것으로 시작하십시오.그 다음, 도면을 흰 종이에 출력합니다. 이어서, 디자인을 수용할 수 있을 만큼 충분히 큰 유리 슬라이드를 이소프로판올로 세척합니다. 그런 다음 에어건으로 슬라이드를 건조합니다.기포가 생기지 않도록 주의하며 세척된 유리 슬라이드에 접착 테이프를 부착합니다. 그다음, 테이프 면이 위를 향하도록 하여 유리 슬라이드의 측면을 디자인이 그려진 종이 위에 테이프로 고정합니다. 종이 디자인을 참조하여 메스로 유리 슬라이드 위의 테이프를 절단합니다.절단 후, 유리 슬라이드의 불필요한 영역에서 테이프를 떼어냅니다. 다음으로, 잔류 접착제를 제거하기 위해 유리 슬라이드를 isopropanol로 헹굽니다. 그런 다음 에어건을 사용하여 표면을 건조시킵니다.패턴 형성 및 세척이 완료되면, 유리 슬라이드를 오븐에서 65 °C로 30분 동안 굽습니다. 그 다음, 고무 롤러로 테이프 위를 부드럽게 밀어 기포를 제거하고, 페트리 접시에서 슬라이드를 실온까지 식힙니다. PDMS 엘라스토머 10부와 경화제 1부를 혼합한 후, 혼합물을 세게 젓는 것으로 시작합니다.그런 다음, 혼합물을 진공 챔버에 넣고 기포가 남지 않을 때까지 탈기합니다. 접착 테이프 몰드 위에 혼합물을 2mm 두께로 붓고, 모든 기포가 사라질 때까지 몰드를 탈기합니다. 냉각이 완료되면, 메스를 사용하여 패턴 구조물로부터 최소 5mm 떨어진 지점에서 PDMS 층을 절단합니다.그런 다음, 핀셋을 사용하여 경화된 PDMS를 몰드에서 떼어냅니다. 1mm 생검 펀치(biopsy punch)를 사용하여, 가급적 미세유로 네트워크의 끝부분에 단일 입구 구멍을 뚫습니다. 그 후, 접착 테이프로 PDMS 캐스트를 세척하여 장치에서 먼지 입자를 제거합니다.70% ethanol 용액으로 헹군 후 멸균된 탈이온수로 씻어내어 PDMS 미세유체 채널 장치를 멸균하고, 30분 동안 UV 광선에 노출시킵니다. 핀셋을 사용하여 멸균된 PDMS 캐스트를 멸균된 유리 커버슬립 위에 올리고, 핀셋 끝을 이용해 가볍게 압력을 가합니다. 다음으로, 소듐 테트라보레이트 완충액에 녹인 poly d lysine 한 방울을 미세유체 채널의 입구에 떨어뜨립니다.페트리 접시를 10분 동안 진공 상태에 둡니다. 이 과정 동안 채널에서 기포 형태로 공기가 나오는 것을 관찰합니다. 진공을 해제하고 기질 용액이 미세 채널로 흘러 들어가는 것을 관찰합니다. 접시를 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다.그 후, 멸균 핀셋을 사용하여 PDMS 스탬프를 조심스럽게 떼어내고, 탈이온수로 패턴을 세 번 세척합니다. 비특이적 부착을 줄이기 위해 유리 커버슬립에 1% BSA 용액을 첨가하고, 샘플을 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, BSA 용액을 흡입하여 제거합니다.세포의 간접 패턴 형성을 시작하려면, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 무혈청 배양 배지에서 세포 현탁액을 준비하십시오. 패턴화된 페트리 접시에 세포 현탁액을 첨가하여 패턴 영역이 세포 현탁액에 완전히 잠기도록 합니다. 그다음, 세포가 패턴화된 기질에 부착될 수 있도록 페트리 접시를 배양기에서 37 °C로 15분 동안 배양하십시오.배양 후, 페트리 접시에서 과량의 세포 현탁액을 흡입하여 제거하고, 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해 10초 동안 부드럽게 흔들면서 패턴화된 세포를 PBS로 3회 세척합니다. 그런 다음, 패턴화된 세포 배양물에 적절한 배양액을 첨가하고, 이산화탄소 버퍼 인큐베이터의 37 °C에서 패턴화된 세포를 배양합니다. 세포의 직접 패턴화를 위해서는, 먼저 70% ethanol 용액과 탈이온수로 헹구어 미세유체 장치를 멸균합니다.그런 다음, PDMS에 세포가 비특이적으로 부착되는 것을 방지하기 위해 장치를 1% BSA 용액에 하룻밤 동안 담가 둡니다. 장치를 상온에서 건조시킨 후, 조직 배양 처리된 페트리 접시 바닥에 부착합니다. 마이크로채널을 채우기에 충분한 양인 4~8 µL의 세포 현탁액을 주입구에 올려 구멍을 완전히 덮습니다.그런 다음, 페트리 접시를 진공 챔버에 넣고 10분 동안 유지합니다. 진공 상태를 해제하고 세포 현탁액이 마이크로채널로 흘러 들어가는 것을 관찰합니다. 페트리 접시를 이산화탄소 버퍼 인큐베이터에서 37 °C로 최대 1시간 동안 배양합니다.그 다음, 배양기에서 디쉬를 꺼내고 핀셋을 사용하여 디쉬에서 PDMS를 조심스럽게 떼어냅니다. PBS로 패턴을 세척한 후, 페트리 디쉬에 세포 배양 배지를 추가합니다. 작업이 완료되면 세포를 다시 배양기에 넣습니다.여기에는 poly d lysine 및 laminin 표면 위에서 패턴화된 쥐 배아 피질 뉴런이 나타나 있습니다. 세포의 위치를 통해 패턴화된 영역에 전반적으로 부착되었으며, PDL 및 laminin 스트라이프를 따라 성장했음을 알 수 있습니다. 더 높은 배율로 표시된 이미지는 C2C12 근아세포입니다.이 세포 유형 또한 패턴화된 영역에 부착하며 다핵 근관으로 융합되는 모습을 보입니다. 이 기술은 직접적인 세포 패턴화에도 응용되었으며, 여기서는 섬유아세포를 통해 보여줍니다. 이러한 직접 세포 패턴화 방법은 세포 생존에 부정적인 영향을 미치지 않습니다.이 절차 이후에 단백질 국소화 또는 세포-기질 상호작용과 관련된 추가적인 질문에 답하기 위해 형광 현미경과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 인레이 전체를 덮을 수 있도록 세포 방울이나 기질 용액을 적절하게 배치하는 것이 성공의 핵심임을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 이후, 이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 망막 생물학에서 광수용체 축삭 유도를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.이 영상을 시청하신 후, 음압을 이용한 가스 투과성 PDMS 미세유체 장치로 세포와 기질을 패턴화하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 기판에 원하는 장소에서 세포를 삽입하기위한 간단한 방법을 보여줍니다. 이 방법은 패턴을 기판에 전지 가득 microwells를 포함하는 실리콘 칩을 틀지하여 세포를. 이 방법은 세포 사이의 diffusible 및 juxtacrine 신호를 조절하는 새로운 방법을 제공합니다.

바이오 플립 칩을 사용하여 배아 줄기 세포의 Patterning

Microcontact 인쇄는 소재 표면에 패턴 단백질 및 다른 분자로 광범위하게 사용됩니다. 우리는 유리에 fibronectin의 패턴을 스탬핑,이 과정의 기본 단계를 보여줍니다.

세포 생물학을위한 단백질의 Microcontact 인쇄

수성 2 단계 시스템은 세포 동시에 패턴 여러 사람들에게 사용되었습니다. 세포 패터닝을위한이 빠르고 쉬운 방법은 dextran과 폴리에틸렌 글리콜 및 두 개의 폴리머 솔루션 사이에 존재 계면 장력의 수성 솔루션의 위상 분리의 장점을 걸립니다.

수성 2 단계 시스템을 사용하여 셀 공동 문화 패턴

이 프로토콜은 그런가 2 세포 패터닝 미세 호환 방법을 설명합니다. 미리 정의 된 파릴 렌-C 디자인은 포토 리소그래피의 SiO2 웨이퍼에 인쇄되어 있습니다. 혈청 (또는 다른 정품 인증 솔루션)와 함께 배양 한 다음 세포에 특이 적으로 부착 (과의 적합성에 따라 성장) 그런가 2 지역으로 격퇴하는 동안 기본 파릴 렌-C.

포토 리소그래피 정의 파릴 렌-C에 대한 세포 패터닝 : 그런가<sub&gt; 2</sub&gt; 기판

이 방법에서는, 우리 photopolymerization를 사용 하 고 제공 하는 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) hydrogels의 표면에 단백질 또는 펩 티 드 패턴을 만들 수 클릭 화학 기법 움직일 생리 신호 vitro에 세포질 응답의 연구에 대 한 .

생리 활성 단백질 또는 펩 티 드 히드로 광화학을 사용 하 여 생물 학적 응용에 대 한에 패턴화

여기에 제시된 방법은 포유류 문화 내에서 공간 조직을 드러내기 위하여 양적 화상 진찰과 함께 마이크로 패터닝을 이용합니다. 이 기술은 표준 세포 생물학 실험실에서 확립하기 쉽고 시험관 내에서 패터닝을 연구할 수있는 견인 시스템을 제공합니다.

마이크로패턴과 정량적 이미징을 사용하여 포유류 세포의 응급 공간 조직 매핑

우리의 전반적인 목표는 세포가 지시된 축색 성장으로 이끌어 내는 세포외 단서를 어떻게 감지하는지 이해하는 것입니다. 여기에서는 축세포 자성장 및 경로 찾기를 제어하는 특정 이벤트를 연구하기 위해 세포 외 매트릭스 구성 요소의 정의된 마이크로 패턴을 생성하는 데 사용되는 단백질의 빛 유발 분자 흡착의 방법론을 설명합니다.

세포외 매트릭스 단백질에 대한 세포 반응을 연구하기 위해 마이크로 패터닝을 위한 PRIMO 시스템을 사용하여 단백질의 빛 유발 분자 흡착

여기서 우리는 DNA 프로그래밍 된 접착력을 사용하여 단일 세포 해상도에서 마이크로 패턴 세포에 대한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 벤치탑 포토리소그래피 플랫폼을 사용하여 유리 슬라이드에 DNA 올리고뉴클레오티드 패턴을 만든 다음 상업적으로 사용할 수 있는 보완적인 올리고뉴클레오티드로 세포막을 라벨로 표시합니다. 올리고스의 혼성화는 프로그램된 세포 접착을초래한다.

DNA를 사용하여 세포의 간단하고, 적당한, 모듈식 패터닝

여기에 제시된 프로토콜은 포유류 세포 내의 세포골격 구조를 연구하기 위하여 세포 모양을 표준화하는 micro패턴의 자동화된 제조를 가능하게 합니다. 이 사용자 친화적 인 기술은 시판되는 이미징 시스템으로 설정할 수 있으며 표준 세포 생물학 실험실에 접근 할 수없는 특수 장비를 필요로하지 않습니다.

적외선 레이저 보조 마이크로패터닝을 통한 세포 지오메트리 제어

우리는 소프트 하이드로젤 상의 세포외 매트릭스 단백질의 도트 어레이의 단일 감산 패터닝 단계를 사용한 마이크로접촉 프린팅을 기반으로 세포 견인력을 측정하는 표준 방법에 대한 개선을 설명합니다. 이 방법은 세포 군집 모양을 제어하는 데 필수적인 섬 패턴을보다 간단하고 일관되게 제작할 수 있습니다.

마이크로패턴 견인 현미경을 위한 패턴 생성

전통적으로, 세포 배양은 생체 내에서 세포의 자연 환경을 잘 모방하지 못하는 평면 기질에서 수행됩니다. 여기서 우리는 생리적으로 관련된 곡선 기하학과 미세 패턴화 된 세포 외 단백질을 가진 세포 배양 기질을 생산하는 방법을 설명하여 이러한 세포 외 단서의 세포 감지에 대한 체계적인 조사를 가능하게합니다.

삼차원 세포 배양 기질의 UV-광패터닝에 의한 다큐 세포 미세환경 생성

배우세요 저압 진공을 이용해 미세유체 채널에 세포와 기질을 채우는 다목적 패터닝 방법을. 이 기술은 세포 간 및 세포-단백질 상호작용 연구에 활용됩니다.

패터닝 단백질과 세포의 다목적 방법

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