패터닝 단백질과 세포의 다목적 방법

이 절차의 전반적인 목표는 대부분의 생물학 실험실에서 사용할 수 있는 간단한 벤치탑 도구를 사용하여 복잡하고 길고 폐쇄된 마이크로 채널로 세포 또는 기질을 분배하여 세포 또는 기질을 패턴화하는 것입니다. 이 방법은 세포 간 및 세포 간 상호 작용에 관한 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 수행하기 쉽고 대부분의 생물학 실험실에서 쉽게 사용할 수 있는 도구만 필요하다는 것입니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 연구자가 선택한 세포와 기질에 대한 배양 조건을 최적화해야 하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. PDMS 스탬프와 용액을 적절하게 배치하면 실험의 재현성이 크게 향상되므로 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. CAD 드로잉 도구를 사용하여 마이크로채널의 레이아웃을 그리는 것으로 시작합니다.

그런 다음 흰 종이에 그림을 인쇄합니다. 다음으로, 이소프로판올을 사용하여 디자인을 수용할 수 있을 만큼 충분히 큰 유리 슬라이드를 청소합니다. 그런 다음 에어건으로 슬라이드를 말리십시오.

청소한 유리 슬라이드에 접착 테이프를 부착하고 기포가 갇히지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 유리 슬라이드의 측면을 디자인이 있는 종이에 테이프로 붙여서 테이프 면이 위를 향하도록 합니다. 메스를 사용하여 종이 디자인을 참조로 사용하여 유리 슬라이드의 테이프를 자릅니다.

절단이 완료되면 유리 슬라이드의 원치 않는 부분에서 테이프를 떼어냅니다. 다음으로, 유리 슬라이드를 이소프로판올로 헹구어 잔여 접착제를 제거합니다. 그런 다음 에어건을 사용하여 표면을 말리십시오.

패턴을 만들고 청소한 후 유리 슬라이드를 섭씨 65도의 오븐에서 30분 동안 굽습니다. 그런 다음 고무 롤러로 테이프를 부드럽게 굴려 기포를 제거하고 슬라이드를 페트리 접시에서 실온으로 식힙니다. PDMS 엘라스토머 10부와 경화제 1부를 혼합하는 것으로 시작하고 혼합물을 세게 저어줍니다.

그런 다음 혼합물을 진공 챔버에 넣어 기포가 남지 않을 때까지 혼합물의 가스를 제거합니다. 접착 테이프 몰드에 2mm 두께의 혼합물 층을 붓고 모든 기포가 사라질 때까지 몰드의 가스를 제거합니다. 냉각되면 메스를 사용하여 PDMS 층을 피처에서 최소 5mm 떨어진 곳으로 자릅니다.

그런 다음 핀셋을 사용하여 경화된 PDMS를 금형에서 떼어냅니다. 1mm 생검 펀치로 단일 입구 구멍을 펀칭하며, 가급적이면 마이크로 채널 네트워크의 끝에 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 접착 테이프로 PDMS 캐스트를 청소하여 장치에서 먼지 입자를 제거합니다.

PDMS 마이크로채널 장치를 70% 에탄올 용액으로 헹군 다음 멸균 탈이온수로 헹구고 30분 동안 자외선에 노출시켜 멸균합니다. 핀셋을 사용하여 멸균 PDMS 캐스트를 멸균 유리 커버 슬립에 놓고 핀셋 끝을 사용하여 부드러운 압력을 가합니다. 다음으로, 마이크로 채널의 입구에 사붕산 나트륨 완충액에 폴리 d 라이신 한 방울을 놓습니다.

페트리 접시를 진공 상태에서 10분 동안 놓습니다. 이 시간 동안 채널에서 거품 형태로 나오는 공기를 관찰하십시오. 진공을 해제하고 마이크로 채널로 유입되는 기판 용액을 관찰하고 접시를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 멸균 핀셋을 사용하여 PDMS 스탬프를 조심스럽게 떼어내고 탈이온수로 패턴을 세 번 씻습니다. 유리 커버 슬립에 1%BSA 용액을 첨가하여 비특이적 접착력을 줄이고 섭씨 37도에서 밤새 샘플을 배양합니다. 다음 날, BSA 용액을 흡인합니다.

세포의 간접 패터닝을 시작하려면, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 무혈청 배양 배지에서 세포 현탁액을 준비합니다. 패턴이 있는 페트리 접시에 세포 현탁액을 추가하여 패턴화된 영역을 세포 현탁액에 완전히 담그십시오. 그런 다음 페트리 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에서 15분 동안 배양하여 세포가 패턴화된 기질에 부착될 수 있도록 합니다.

배양 후 페트리 접시에서 여분의 세포 현탁액을 흡인하고 패턴화된 세포를 PBS로 3회 세척하면서 10초 동안 부드럽게 흔들어 부착되지 않은 세포를 제거합니다. 그런 다음 패턴화된 세포 배양에 적절한 배양 배지를 추가하고 패턴화된 세포를 이산화탄소 완충 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양합니다. 세포의 직접 패터닝을 위해서는 먼저 70% 에탄올 용액으로 헹구고 탈이온수를 사용하여 미세유체 장치를 살균합니다.

그런 다음 PDMS에 대한 비특이적 세포 부착을 방지하기 위해 장치를 1% BSA 용액에 밤새 담그십시오. 장치를 실온에서 건조시킨 후 조직 배양 처리된 페트리 접시 바닥에 부착합니다. 구멍을 완전히 덮는 입구에 마이크로 채널을 채울 수 있을 만큼 충분한 4-8마이크로리터의 셀 현탁액을 놓습니다.

그런 다음 페트리 접시를 진공 챔버에 10분 동안 넣습니다. 진공을 해제하고 마이크로 채널로 흐르는 세포 현탁액을 관찰합니다. 페트리 접시를 섭씨 37도의 이산화탄소 완충 인큐베이터에서 최대 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 인큐베이터에서 접시를 꺼내고 핀셋을 사용하여 접시에서 PDMS를 조심스럽게 떼어냅니다. PBS로 패턴을 세척한 다음 페트리 접시에 세포 배양 배지를 추가합니다. 완료되면 세포를 다시 인큐베이터에 넣습니다.

여기에 표시된 것은 poly d, lysine 및 laminin 표면에 패턴화된 배아 쥐 피질 뉴런입니다. 세포의 위치는 패턴화된 영역에 대한 일반적인 부착과 PDL 및 라미닌 줄무늬를 따라 성장을 보여줍니다. 여기에 더 높은 배율로 표시된 것은 C2C12 근아세포입니다.

이 세포 유형은 또한 패턴화된 영역에 부착되어 다핵 근관으로의 융합을 보여줍니다. 이 기술은 섬유아세포와 함께 여기에 표시된 직접 세포 패터닝에도 적용되었습니다. 이 직접 세포 패터닝법은 세포 생존에 부정적인 영향을 미치지 않습니다.

이 절차에 따라 단백질 국소화 또는 세포-기질 상호 작용과 관련된 추가 질문에 답하기 위해 형광 현미경 검사와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 전체 인레이를 덮을 수 있도록 세포 방울 또는 기질 용액을 적절하게 배치하는 것이 성공에 중요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이 기술은 신경 과학 분야의 연구자들이 망막 생물학에서 광수용체 축삭 유도를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 음압을 사용하여 가스 투과성 PDMS 미세유체 장치로 세포와 기질을 패터닝하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.