Name: 차 사람 골수 및 악성 종양을 연구하는 세 가지 차원 조직 배양 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 배우세요 인간 골수 미세환경을 모방하는 3차원 조직 배양 모델을 활용한 세포 배양 기법. 이 방법은 원발성 인간 골수 세포의 직접 시각화 및 분리 분석을 가능하게 하여 생리학적 관련성 높은 연구를 지원합니다.

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이 작품은 건강, 국립 암 연구소 (1R21CA141039), BD Biosciences는 연구 그랜트 수상, 암 퍼듀 대학 센터 미국 암 학회 (American Cancer Society) 기관 연구비 (IRG # 58-006-53)의 국립 연구소에서 교부금에 의해 투자되었다 연구 및 건강 연구 및 앨버타 암위원회 연구 이니셔티브 프로그램의 캐나다 연구소. MP는 건강의 국립 연구소, 국립 암 연구소, 암 예방 인턴쉽 프로그램에 의해 지원되었다 (R25CA128770, PI : D. Teegarden) 종양학의 과학 센터와 퍼듀 대학에서 발견 학습 연구 센터에 의해 관리.

1. 사전 준비 <ol><li> 4 ° C에서 멸균 혈청 피펫과 피펫 팁을 유지 문제 해결 : 실온 (RT)에서 리겔 젤, 차가운 피펫 및 팁을 사용하여이 문화를 설치하는 동안 겔에서 리겔을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 4 ° C에서 하룻밤 리겔의 병을 해동. </li></ol> 2. 시약의 준비 <ol><li> 피브로넥틴 스톡 용액의 제조 : 100 ml의 증류수에 100 mg의 인간 피브로넥틴 용해하여 피브로넥틴의 1 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을 확인. 최대 6 개월 동안 4 ° C에서 피브로넥틴이 용해되면, 살균 필터, 나누어지는 및 저장. 문제 해결 : 피브로넥틴 빠르게 용해 37 ℃에서 수조 세트에 몇 분을위한 솔루션을 품어하지 않는 경우 </li><li> 10X PBS의 준비 : 80 g 나트륨 염화물의 NaCl 14.4 g 나 2 HPO 4, 2g의의 KCl 2.4 g의 KH 2 PO를 녹이고 <suB&gt; 증류수 1 L에 4. 7.4, 살균 필터에 pH를 설정하고 최대 6 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 중화 버퍼 (20)의 제조 : 1 M HEPES 및 10X PBS의 주식 솔루션을 사용하여 2 배 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에 100 mM의 HEPES를 포함하는 솔루션을합니다. 7.0 용액의 pH를 조정한다. 2 ~ 3 개월 4 ° C에 보관하십시오. </li><li> 쥐의 꼬리 콜라겐 타입의 2 ㎎ / ㎖ 용액의 조제는 I : 중화 버퍼 (단계 2.3)에 2 ㎎ / ㎖ 콜라겐 I 솔루션을합니다. 낮은 속도로 솔루션을 흔든다 아래로 pipetting에 의해 부드럽게 섞는다. 콜라겐이 매우 점성이기 때문에, 피펫 팅하면서 기포의 발생을 피한다. 그것은 신선한마다 콜라겐 I 솔루션을 준비하는 것이 좋습니다. 사용할 때까지 얼음에 솔루션을 보관하십시오. </li><li> 내막 코팅 (분쇄)의 제조 : 1X &amp;에, 2 ㎎ / ㎖ 콜라겐 I 주식 (2.1 및 2.4 단계) 77 ㎍ / ㎖의 최종 농도 29 ㎍ / ㎖로 1 ㎎ / ㎖ 피브로넥틴 주식을 각각 혼합# 160; 멸균 PBS. 혼합 최대 1 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 복원 된 뼈 매트릭스 (RBM)의 제조 : <ol><li> 얼음에 Precool 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브. 항상 얼음에 모든 매트릭스 솔루션을 유지합니다. </li><li> 4 부 리겔 (리겔 농도가 로트마다 다르지만, 변화는 무시할 것으로 밝혀졌다), 1 ㎎ / ㎖ 피브로넥틴 2.5 부 첫 번째 피펫 리겔로 얼음에 2 ㎎ / ㎖ 콜라겐 I에 1 부를 혼합 튜브 차가운 피펫 팁을 사용하고 리겔은 4 ° C 이상의 온도에서 응고 시작, 그래서 리겔을 피펫 팅하는 동안 빠르게 작동합니다 피브로넥틴과 콜라겐 I.를 추가합니다. 거품을 도입하지 않도록, 아래로 피펫 팅에 의해 매우 부드럽게 행렬을 섞는다. RBM을 혼합하면서 얼음에 튜브를 유지합니다. </li></ol></li><li> 골수 증식 배지 (BMGM)의 준비 : 6.2 × 10 -4 M 염화칼슘, 10 -6 M 나트륨 숙시 네이트, 10-6 M의 하이드로 코티손, 20 %의 인간 혈장을 (포함 BMGM 500 mL로RPMI-1640) 정상 또는 건강한 기증자 또는 환자로부터 수집 된 악성, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신. 염화칼슘, 나트륨 숙시 네이트, 및 하이드로 코티손 보충제는 1,000 X 주식 솔루션으로&gt; 6 개월 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. 세포주를 성장하는 경우, 소 태아 혈청 (FBS)은 인간 혈장에 대해 치환 될 수있다. </li><li> 10 % 중성 포르말린 (NBF)의 제조 : 10 % V / V에서 PBS를 1 배인 37 % 포름 알데히드 원액 추가 잘 혼합하고 빛으로부터 보호 2 ~ 3 주간 상온에서 보관. </li><li> 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)의 제조 : BSA의 적당량을 달아 1X PBS에 녹여. 4 ° C에서 보관 1 주일 이내에 사용한다. BSA 솔루션은 더 이상 기간 동안 냉장 보관하면 오염 얻을하는 경향이있다. 대안 적으로, BSA 용액은 장기간 저장에 분취하고 -20 ℃에서 냉동 될 수있다. 동결 - 해동 사이클을 피하십시오. </li><li> 세포 복구 솔루션 (CRS)의 제조 : 5 mM의 EDTA, 1 mM의 나트륨 바나 데이트 (나를 &lt;확인1X PBS 서브&gt; 3 VO 4), 1.5 mM의 불화 나트륨 (NaF로) 솔루션을 제공합니다. 최대 6 개월까지 4 ° C에서 살균 필터 및 저장. </li></ol> 3. 비 악성 및 악성 인간 BM 세포의 내장 3-D 문화 <ol><li> 제조업체의 지시에 따라 플라크 피콜 구배 원심 분리에 의해 차 BM 단핵 세포를 정제 하였다. 선택 단계 : 세포가 배양 기간 동안 세포 증식을 수행하는 제조 업체의 지침에 따라 0.25 μM의 카르복시 디 아세테이트, 숙신 에스테르 (CFSE)으로 표시 할 수 있습니다. 문제 해결 : 세포가 CFSE 염색 후에 죽는다면, 농도가 세포의 종류에 따라 달라집니다로 CFSE의 양을 적정, 0.25 μM는 기본 BM 단핵 세포에 적합합니다. </li><li> 48 잘 조직 문화 처리 플레이트의 각 웰에 분쇄 솔루션 65 μl를 추가합니다. 웰의 전체 표면을 덮도록 균일 용액 깔아&gt; 30 부화RT에서 분. </li><li> 48 - 웰 플레이트의 웰 당 1X PBS 10 μL에서 0.5 × 10 6 세포의 밀도로 세포 현탁액을 준비합니다. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 잘 당 RBM 행렬의 100 μL와 세포 현탁액을 섞는다. 부드럽게 위아래로 pipetting하여 세포와 RBM 행렬을 혼합, 거품을 도입하지 마십시오. 행렬의 겔화를 방지하기 위해 얼음에 셀 / 매트릭스 혼합물을 유지한다. 주 : RBM 시스템은 완전히 확장이다 사용 플레이트의 표면적에 기초하여 모든 시약 (매트릭스 및 매체)의 양을 조정 비 48 - 웰 포맷으로 시스템을 설정. 이에 따라 도금 될 셀의 수를 확장. </li><li> 나머지 렌드를 기음과 우물의 중심에 셀 / 매트릭스 혼합물을 추가합니다. 빠르게 균등 웰의 전체 표면을 덮도록 셀 / 매트릭스 혼합물을 확산. 37 ° C에서 30 ~ 60 분 동안 접시를 놓고, 5 % CO 2 조직 문화 인큐베이터 행렬이 응고 할 수 있습니다. 흔들거나 표시하지 마십시오배양 중에 플레이트를 TURB. 문제 해결 : RBM 세포의 치우침을 방지 도금하기 전에 잘 혼합한다. 매 5 번째 잘 튜브 바닥에 침전 세포를 피하기 위해 도금 후 섞는다. 일단 도금 셀은 매트릭스에 표면 장력에 의한 웰의 바닥에 가라 앉지 않는다. 문제 해결 : RBM 세포의 치우침을 방지 도금하기 전에 잘 혼합한다. 매 5 번째 잘 튜브 바닥에 침전 세포를 피하기 위해 도금 후 섞는다. 일단 도금 셀은 매트릭스에 표면 장력에 의한 웰의 바닥에 가라 앉지 않는다. </li><li> 물을 욕조에 Prewarm BMGM는 37 ° C로 설정 </li><li> 30 분 후, 매트릭스가 제대로 설정했는지 확인하십시오, 그것은 플레이트가 기울어 때 움직이지 않는 층 같은 부드러운 젤을 형성 할 것이다. 따뜻한 BMGM 1 ㎖의 세포 / 매트릭스 층을 오버레이. 아주 부드럽게 매트릭스 피펫 매체 찢어을 방지하기 위해 사용 (드롭에 의해 드롭 분배)혈청 피펫. 37 ° C, 원하는 기간 동안 5 % CO 2 조직 문화 인큐베이터와 문화에 조립 된 RBM 문화를 놓습니다. 주 : 세포 생존율은 배지를 변경하지 않고 적어도 30 일 동안 유지된다; 매체 변경이 필요한 경우에만마다 배지의 50 %를 변경. 중요한 단계 : 그것은 차가운 온도가 이미 설정 행렬을 방해 하듯이 매체는 추운없는 것이 중요합니다. 그것은 부드러운 매트릭스 층을 깰 수에서 행렬의 맨 위에있는 매체를 분출하지 않도록주의하십시오. 문제 해결 : RBM 시스템에서 세포 생존 능력이 낮 으면, 셀 밀도가 BM 흡인로부터 일차 단핵 세포 이외의 세포를 사용할 때 실험적으로 결정되어야 할 수도있다. 세포 라인으로 작업 할 때 불후의 세포 라인은 기본 세포보다 빠르게 증식로, 세포 수 10 배 감소. </li></ol> 4. &#39;에서 매트릭스&#39;영상 <ol><li><strong&gt; 광학 현미경 <ol><li> 이미지 시야를 사용하여 직접 RBM에서 배양 된 세포, 미분 간섭 대비 (DIC), 공 초점 또는 매트릭스 약 1mm 두께로 원거리 촬상을 허용 다른 이미징 기법. 위쪽에서 아래쪽으로 이미지의 전체 문화를 현미경의 많은에서 사용할 수있는 Z-스택 기능을 사용합니다. </li></ol></li><li> 면역 형광 염색 팁 : 아래의 면역 염색 프로토콜은 염색 / 세탁 솔루션을 흡입 방지를 위해, 대신 접시를 기울 피펫을 사용하여 솔루션을 제거합니다. <ol><li> 피펫을 사용하여 BMGM를 제거하고 RT 1X PBS 100 μL / 세척 / 잘으로 2 배 씻는다. 충분한 PBS는 우물의 전체 표면을 커버하는 데 사용되었는지 확인합니다. </li><li> 실온에서 15 분 동안 10 % NBF의 (48 - 웰 플레이트) 100 μL / 웰을 추가하여 행렬의 세포를 수정. NBF를 제거하고 RT 1X PBS 100 μL / 세척 / 잘로 두 번 세포를 씻으십시오. 주의: 그것은 행렬을 녹일 수 있으므로 감기 NBF를 사용하지 마십시오. </li><li> , PBS를 제거 밤새 항체의 비특이적 결합을 차단하기 위해 실온에서 4 ° C에서 1 시간 동안 1 % BSA를 추가합니다. </li><li> 필요한 희석에 1 % BSA의 기본 항체 솔루션을 준비합니다. 희석은 제조업체에 문의하거나 최적의 항체 농도를 결정하는 적정, 각 항체에 따라 다를 것입니다. 차 항체 용액 100 μL / 잘을 추가하고 제조업체의 지침에 따라 배양한다. 중요한 단계 : 형광 또는 형광 염료에 접합 된 항체를 포함한 모든 배양은 어둠 속에서 수행해야합니다. </li><li> 차 항체 솔루션을 제거하고 5 분 1X PBS로 3 회 세척한다. </li><li> 간접 면역 형광 염색의 경우, 실온에서 1 시간 동안 형광 프로브에 복합 이차 항체와 함께 배양한다. 제조업체에서 권장하는 농도의 1 % BSA의 항체를 희석. </li><li> 차를 제거ntibody 솔루션 및 5 분 1X PBS로 3 회 세척한다. 문제 해결 : 높은 배경을 방지하기 위해 촬영하는 동안, 형광 결합 된 이차 항체를 적정하고 적절한 신호를 제공하는 낮은 농도를 사용합니다. 하이 백은 여전히​​ 문제가있는 경우, 세척 단계의 수 및 지속 기간을 증가 시키거나 직접 접합 된 일차 항체를 사용하고, 단계 4.2.6 이동. </li><li> 핵은 제조업체에서 권장하는 희석에, &#39;-1,6 - diamidino -2 - 페닐 인돌 (DAPI) 핵 염색 액을 4를 추가 얼룩, 그리고 실온에서 7-10 분 동안 부화. </li><li> 핵 염색 액을 제거하고 5 분 1X PBS로 2 배 씻는다. </li><li> 마지막 세척에서 PBS를 제거하고 형광을 유지하기 위해 샘플에 장착 매체의 드롭 (레귤러 세트)를 추가합니다. 형광 공 초점 현미경에 적합한 여기 / 방출 설정을 사용하여 이미지. 참고 : 이미지는 염색의 2 일 범위 내에서 실시 할 필요가매트릭스 및 RBM 무결성 및 형광 신호의 손실의 손실의 저하를 방지 할 수 있습니다. 바로 이미지를 만들지 않는 경우, 스테인드 샘플 영상까지, 빛으로부터 보호, 4 ° C에 보관해야합니다. </li></ol></li></ol> 5. RBM에서 세포의 분리 <ol><li> 매트릭스 층을 방해하지 않고 부드럽게 매체를 제거합니다. 대기음하지 마십시오. </li><li> 세척 세포는 멸균 1X PBS로 2 배. 대기음하지 마십시오. </li><li> 또한 각 얼음처럼 차가운 CRS의 0.5 ML을 추가하고 적극적으로 아래로 피펫 팅에 의해, 세포와 함께 전체 매트릭스 층을 제거. 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 세포, 매트릭스, 그리고 CRS를 수집합니다. 얼음에 놓습니다. </li><li> 같은도에 추가로 0.5 ㎖ CRS를 추가하고 나머지 모든 자료를 수집합니다. 같은 microcentrifuge 관에 전송합니다. </li><li> 소용돌이 세포, 매트릭스, 그리고 CRS의 혼합물은 1 시간 동안 얼음에 품어. 소용돌이 세포는 매 15 분 행렬에서 방출을 촉진한다. </li><li> 1 시간, 눈에 보이는 덩어리 후 혼합물을 확인매트릭스의 존재해야한다. 문제 해결 : 행렬의 대단히 짧은 시간은 1 시간 후 계속 표시하는 경우, 더 큰 튜브에 세포를 전송 / 매트릭스 / CRS 혼합물, CRS의 추가 2-5 ML을 추가하고, 추가로 30 ~ 60 분 동안 품어. </li><li> 4 ℃에서 5 ~ 10 분 동안 1,000 rpm에서 CRS에 원심 분리기 세포 뜨는을 제거하고 차가운 1X PBS 1 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 5 ~ 10 분 동안 1,000 rpm으로 원심 분리기 및 뜨는을 제거합니다. PBS 세척을 한 번 더 반복합니다. </li><li> 두 번째 PBS 세척 매트릭스 고립 된 세포에서 세포의 회복, 세포 계측법 생체 이식 등 흐름, 이러한 DNA / RNA / 단백질 분리와 같은 다운 스트림 애플리케이션에 사용할 수 있습니다 완료됩니다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

RBM 모델은 BM의 세포 조성물을 30 일까지 생체를 유지하는 포괄적 인 시스템을 제공합니다. 자신의 기능이 밀접하게 생체 내에서 발견 된 BM 구조를 흉내에 따라 RBM 자기 충 성장 BM 세포. 더욱이,이 다발성 골수종 클론 (8)의 팽창을 허용 우선 시스템이다. BM 세포의 강력한 성장과 문화의 전반적인 성공을 보장하기위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1)&gt; 70 %의 생존 능력과 적혈구의 대부분은 무료로 BM 세포의 건강한 인구를 얻기 위해, 2) 보장하기 위해 그 매트릭스 성분은 잘 혼합하고 세포를 매트릭스 전체에 균일하게 분포하며, 3) 성장 매체가 시스템에 추가 될 때 행렬을 손상하지 알아서 해당된다. 악성 세포의 증식을 강력 보장하기 위해, 성장 배지는 세포 배양중인 환자의 진단 매칭 사람 혈장이 보충되어야한다. O발견 하였다 RBM 시스템의 NE 한정 BM의 기질 구획없이 CD34 + 조혈 줄기 세포, CD20 + B 세포 및 CD138 + ...

조직 배양은 본래 유기체에 각종 처리를 비교할 때 전신 변동성을 최소화하기 위해 제어 된 환경에서 세포 행동을 연구하기 위해 개발되었다. 이 방법은 먼저 1900 년대 초 1,2 년에 설립 된 조직 절편이 유리 접시에 생체 전 배양 기술을 언급했다. 1900 년대 중반의 시스템은 오히려 손상 조직의 조각보다 분산 된 세포가 성장하기에 적합하고, 용어 &#39;조직 문화&#39;와 &#39;세포 배양&#39;는 3 동의어가되었다. 이러한 종래의 세포 배양 시스템에서 셀은 다양한 성장 인자로 보충 된 성장 배지와 겹쳐 조직 배양 플라스틱의 표면에 성장된다. 자기편 세포 배양, 세포 부착 및 세포 현탁액에 전파되는 조직 배양 플라스틱 및 비 접착 성 문화에 확산 : 문화의 두 가지 유형의 다양한 세포의 접착 능력을 기준으로 등장했습니다. 셀의 초기부터문화, 다 불멸 세포주는 헬라 4, 제 인간의 암 세포주로 생성되었다. 이들 세포주는 세포 배양 물에서 무기한 증식하는 능력이 있고, 대부분의 생존을 유지하기 위해 특별한 처리를 필요로하지 않는다. 원래의 세포 배양 방법의 환원 주의적 접근 방식은 세포 생존과 증식을 유지하기 위해 필요한 경우에만 최소한의 구성 요소를 포함하여 가능한 한 많은 시스템을 단순화하도록 설계되었습니다. 그러나 단순화 된 세포 배양 방식은 유한 한 수명을 가진 생체 가장 기본 인간의 세포 유형을 지원하기 위해 실패합니다. 따라서, 새로운 문화 시스템은 따라서 세포 외식 생리 조건에서 성장할 수 있도록 최대한 조직의 미세 환경에 근접하도록 설계되고있다. 종래 / 환원 세포 배양 방법, 3 차원 (3-D)과는 대조적으로 배양 시스템은 이제 다양한 효율적 문화 바람직한 방법이되고있다인간의 세포 선 및 일차 전지는 이후에 지원 미세 환경의 맥락에서, 건강과 질병에 관련된 메커니즘을 연구합니다. 이러한 3-D 시스템은 일반적으로 관심의 세포 유형을 연구하는 조직의 미세 환경을 요점을 되풀이하기 위해, 성장 인자 보충 복원 행렬 및 / 또는 매체를 사용하여 설정된다. 이러한 3 차원 (3-D) 배양 모델의 첫번째는 유선 개발을 연구하기 위해 개발되었다. 유방 상피 세포가 리겔에 포함 된 기본 조건, 콜라겐 IV와 세포 외 기질 (ECM)의 라미닌이 풍부한 소스와 세포를 제공하고, 성장 매체와 겹쳐합니다. 이러한 조건 하에서, 유선 상피 세포가 유방 꽈리 닮은 클러스터를 형성하고, lactogenic 호르몬 자극시, 선포 세포는 이러한 꽈리 같은 구조의 중공 lumena으로, 감기 및 다른 우유 단백질을 분비. 카제인 분비도 프로락틴 5 첨가 한 후 표준 문화에서 관찰되지 않았다, 상기 세포의 형태 학적 표현형에 미세 환경을 보존하는 역할을 강조. 세포가 자신의 생리 미시의 문맥 촬영 정상적인 세포 기능의 손실의 또 다른 데모지지 미세하지 않고, 각질 세포가 층상 표피 (6)를 형성하는 데 실패하는 데모입니다. 다른 3-D 모델의 수는 기본 세포의 생체 전파 7,8를 할 수 있도록 만들어졌다. 세포 행동의 미세 환경의 중요한 역할은 우아하게 매트릭스 때 콜라겐 배양 유방 상피 세포가 리겔에 형성 올바르게 편광 선포 세포에 비해, &quot;내부 아웃&quot;선포 세포를 형성 연구에서 입증되었다. 라미닌 생산 근 상피 세포가 콜라겐 I 배양 9에 추가 된 경우에 적절한 형태의이 손실은 복귀했다. 또한, 올바른 미시는 정확한 필요합니다유전자형 표현. 접시에 성장, 세포 - 세포 접착 분자 CEACAM1로 형질 MCF7 유방암 세포는 형질 감염되지 않은 CEACAM 음성 세포와 완전히 동일하게 동작. 그러나, 비 악성 유방 상피 세포 (10)에 설립되었습니다로 CEACAM1로 형질 MCF7 세포는, 중공 lumena와 정상 표현형과 양식을 선포 세포로 복귀하면서 ECM, 야생형 MCF7 양식 종양 같은 구조와 접촉, 리겔에 배양 하였다. 마찬가지로, β1-인테그린 유방암 세포를 차단하면 표준 배양 조건에서 동작을 변경할 수 있지만, 3-D 문화에서 수행 된 동일한 실험은 β1-인테그린을 차단하는 것은 정상적인 표현형 (11)에 악성 세포를 되돌 설명하지 않습니다. 따라서, 미시 조직은 세포 생존을 유지하기 위해 요구되지 않고, 또한 적절한 세포 기능을 유지하기 위해. 셀의 동작은 생리적 조건 하에서 연구 될 수있는 시스템을 제공하는 것 외에도의는, 3-D 문화는 새로운 치료제 8,12,13의 전임상 시험을위한 견고하고 신뢰할 수있는 매체를 작동합니다. 3-D에서 세포를 배양하면 세포 - 세포 및 세포 - ECM 부착의 기여가 평가 될 수있는 환경 매개 약제 내성 (14)의 조건에서 조사 화합물의 검사를 할 수 있습니다. 또한, 새로운 화합물의 오프 대상 독성은 다양한 조직의 여러 세포 구획을 통합하여 확인 될 수 있습니다. 이러한 화면은 더 빠르게 수행하고 비용 효율적인 생체 8 비교 연구보다 될 수있다. 여기에서 우리는 정상 및 악성 골수 (BM) 세포가 밀접하게 인간의 BM의 미세 환경을 흉내 낸 시스템에서 체외 증식 복원 골수 (RBM)의 3-D 모델의 설정을 제시한다. BM 기질의 다양한 구성 요소와 함께 2-D의 문화, 액체 또는 부착 공 배양에 인간의 기본 BM 세포를 성장 이전 시도, 3-D, 반 고체 한천 문화로 인해 조직의 미세 15-18의 구성 요소와 세포를 공급하는 그들의 무능력에 제한된 성공을 만났다. 이러한 시스템에서 기본 BM 세포는별로 가능성이 있고 생체을 증식하는 데 실패했습니다. 인간 BM 전구 세포는 BM 간질 세포와 공 배양 타원체에서 재배되는 다른 시스템은 조혈 줄기 세포 생존 및 증식이 적어도 96 시간 지속 된 19 3-D 시스템이다. 조혈 전구 생물학의 이해에 매우 유용하지만, 그러나,이 시스템은 충실히 그 유용성을 제한, 따라서 ECM 구성 요소의 부재로 인해 BM의 미세 환경을 요점을 되풀이하지 않습니다. 여기에 설명 RBM 모델은 인간의 BM 셀룰러 및 세포 외 구획은 시험 관내에서 재구성되는 포괄적 인 시스템을 제공한다. 우리는 RBM의 문화가, 정상적인 인간의 BM 세포의 체외 성장을 지원할 수있는 쇼로 우리각종 혈액 질환을 가진 환자에서 분리 된 세포와 같은거야.

<table><tbody><tr><td>유세포 분석용 CellTrace CFSE 증식 키트</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>인간 혈장에서 추출한 피브로넥틴</td><td>Millipore</td><td>NG1884448</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Lifesciences</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 기저막 매트릭스</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>쥐꼬리 콜라겐 유형 I</td><td>BD Millipore의 Biosciences</td><td>354249</td><td>Collagen I은 이 프로토콜을 사용하여 적절하게 폴리머화되지 않습니다</td></tr><tr><td>VECTASHIELD 형광용 마운팅 배지(일반 세트)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX 정제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4648</td><td>TRAP 염색용</td></tr><tr><td>SigmaFast BCIP/NBT 정제 Sigma-Aldrich</td><td></td><td>B5655</td><td>알칼리성 인산가수분해효소 염색용</td></tr><tr><td>Zeiss 컨포칼 LSM 510 현미경&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 510 소프트웨어</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>컨포칼 분석을 위한 이미지 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200M 도립 현미경&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph 소프트웨어</td><td>분자 장치</td><td></td><td>Axiovert 200M FAC용 이미지 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>소스 유세포 분석기&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Pro 소프트웨어&nbsp;</td><td>유세포 분석 데이터 분석을 위한</td> <td>BD Biosciences</td><td></td> 소프트웨어</tr></tbody></table>

차 사람 골수 및 악성 종양을 연구하는 세 가지 차원 조직 배양 모델

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

조직 문화는 정상적인 발달에서 질병, 세포 기능의 여러 측면을 연구하는 귀중한 도구이다. 종래의 세포 배양 방법은 조직 배양 접시의 고체 기질에 부착하는 액체 매질에 현탁 성장하거나 세포의 능력에 의존한다. 다수의 불멸의 세포 라인은 기본 세포가 생체 성장해야 할 경우에는이 방법이 자주 실패, 생성과 같은 방법을 사용하여 재배하고 있습니다. 이러한 실패는 조직 배양 플라스틱은 세포 성장을위한 표면으로서 사용되는 표준 시스템에서 미세 조직의 적합한 세포 외 기질 성분의 부재에 기인 한 내용. 세포 외 기질은 조직의 미세 환경의 핵심 구성 요소이며 그 존재는 세포 편광, 생존, 증식 등의 생리 기능의 유지 보수를 위해 매우 중요합니다. 여기에서 우리는 3 차원 조직 배양 방법 차 골수 CEL을 제시LS는 인간의 뼈 (RBM 시스템)의 미세 환경을 요점을 되풀이 공식화 세포 외 기질 (extracellular matrix)에서 재배된다. 세포 외 기질에 포함 된 세포 따라서 기본 조직의 세포 구성을 유지하면서 세포의 생존과 증식이 최대 30 일 동안 지속 할 수있는 종합적인 시스템을 제공, 인간 혈장 보충 매체를 통해 영양소와 함께 제공됩니다. RBM 시스템을 사용하여 우리는 성공적으로 정상 기증자와 환자 아밀로이드증, 각종 혈액 학적 악성 종양에서 차 골수 세포를 성장. RBM 시스템은 새로운 치료제의 전임상 효능의 세포 행동 및 평가의 직접,있는 매트릭스 실시간으로 시각화 할 수 있습니다. 또한, 세포로부터 단리 RBM이어서 생체 내 이식, 세포 분류, 유동 세포 계측법, 핵산 및 단백질 분석에 사용될 수있다. 종합적 RBM 방법은 일차 뼈 MARRO의 성장을위한 신뢰성있는 시스템을 제공한다생리 학적 조건에서 W 셀.

일차 골수 세포는 표준 조직 배양 조건 하에서 증식하는 데 실패하기 때문에, RBM 시스템 밀접 문화 제공 시스템, 골 미세 환경을 모방하고 생체 BM 세포를 확장하기 위해 만들어졌다. BM 세포 외 기질, 피브로넥틴, 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 라미닌 (21)의 주요 구성 요소는 3-D 문화에 구조 발판을 제공하기 위해 RBM의 행렬로 통합되었다. Endosteum, 콜라겐 I과 fibronectin의 풍부한 뼈와 BM 사이의 인터페이스는,이 단백질을 가진 조직 배양 접시의 표면을 코팅하여 재구성 하였다. BM 내에 여러 셀룰러 구획 간의 누화는 조직의 전체적인 항상성 유지에 기여한다. 세포 구성 요소의 어느 것도 생략하지 않습니다 보장하기 위해, RBM 문화는 인간의 BM 바늘 대기음 생검에서 미분 획 단핵 세포를 사용하여 설정 하였다. 시스템이 호르몬, 성장 인자, 함께 제공되어 있는지 확인하려면순환 환경에서 본 D 사이토 카인은, 배양액 인간 혈장은 비 악성 BM 세포 RBM에 배치 ...

표준 배양 방법에 세포 생리 학적 환경 꺼내하고 접시의 플라스틱 표면에 성장합니다. 일차 인간 골수 세포의 거동을 연구하기 위해, 우리는 세포가 조직의 미세 환경을 네이티브 recapitulating 조건에서 재배되는 3-D 배양 시스템을 만들었다.

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 인간 골수의 세포 및 세포 내 미세환경을 밀접하게 재현하는 배양 시스템을 구축하는 것입니다. 먼저, 조직 배양 웰의 표면을 산업용 매트릭스로 코팅합니다. 그 다음, 골수 단핵구 또는 관심 있는 다른 세포들을 골수 매트릭스와 혼합합니다.이후, 산업용 매트릭스를 제거하고 세포 매트릭스 혼합물을 웰에 추가합니다. 매트릭스가 젤 형태로 굳으면, 그 위에 성장 배지를 덮습니다. 최종적으로, 세포를 매트릭스 내에서 직접 시각화하거나, 기존의 세포 배양 방법과 비교하여 후속 분석을 위해 분리할 수 있습니다.예를 들어, 표준 조직 배양법이나 세포를 플라스틱 위에서 배양하는 공동 배양 모델이 있습니다. 3D 배양법을 사용하는 주요 이점은 세포가 생리학적 미세 환경 내에서 성장하므로 조직의 천연 상태 조건에서 세포를 연구할 수 있다는 점입니다. 세포를 분주할 48웰 플레이트를 준비하십시오.먼저 각 웰에 65 µL의 산업용 코팅 용액을 넣은 다음, 용액을 고르게 펴서 웰의 전체 표면을 덮어줍니다. 이 방법은 다른 표면에도 확장하여 적용할 수 있습니다. 플레이트를 실온에서 최소 30분 동안 배양합니다.그동안 PBS로 1 µL당 50,000 cells의 세포 현탁액을 준비합니다. 각 웰에 10 µL씩 첨가할 수 있는 충분한 양을 준비한 다음, 에펜도르프 튜브에서 세포 현탁액을 웰당 100 µL의 재구성된 골 기질과 혼합합니다. 부드럽게 섞어 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.플레이트 처리가 완료되었을 때 매트릭스가 겔화되지 않도록 혼합물을 얼음 위에 보관하십시오. 배양 중, 흡입(aspiration)을 통해 모든 액체와 코팅 용액을 제거하십시오. 그런 다음, 매트릭스와 함께 잘 혼합된 세포 현탁액 100 µL를 각 웰에 첨가하십시오.피펫을 사용하여 플레이트를 빠르게 기울여 웰의 전체 표면이 고르게 덮이도록 합니다. 세포가 완전히 로딩되면 뭉칠 수 있으므로, 웰을 채우는 동안 현탁액을 계속 섞어줍니다. 매트릭스가 응고될 때까지 플레이트를 흔들지 말고 30분에서 60분 동안 배양합니다.다음으로, 37°C로 설정된 워터배스에서 골수 성장 배지를 예열하십시오. 30분 동안 배양한 후, 매트릭스가 적절하게 형성되었는지 확인하십시오. 잘 형성된 매트릭스는 플레이트를 기울였을 때 움직이지 않는 부드러운 젤 형태의 층을 이룹니다.매트릭스가 준비되면, 세롤로지컬 피펫을 사용하여 배지 1mL를 천천히 한 방울씩 얹어줍니다. 그 다음, 조립된 재구성 골 매트릭스 배양물을 인큐베이터로 옮겨 배지 교체 없이 최대 30일 동안 배양합니다. 배지 교체가 필요한 경우에는 한 번에 배지의 절반만 교체하십시오.매트릭스 층이 손상되지 않도록 배지를 조심스럽게 제거합니다. 플레이트를 기울이고 피펫을 사용하여 배지를 천천히 따라냅니다. 매트릭스 층 위에서 배지를 흡입하여 제거하지 마십시오.세포를 염색할 때, 용액을 교체하기 위해 이 기술을 사용하십시오. 3D 배양 웰에서 배지를 제거할 때는 웰의 측면을 통해 제거하는 것이 매우 중요합니다.그렇지 않으면 매트릭스가 손상되어 세포가 소실될 수 있습니다. 동일한 기술을 유지하십시오. 멸균된 1X PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 그다음 각 웰에 얼음처럼 차가운 세포 회복 용액 0.5 mL를 첨가합니다.강하게 파이펫팅하여 세포와 함께 매트릭스 층 전체를 제거합니다. 각각의 수집물을 마이크로 원심분리 튜브로 옮겨 얼음 위에 둡니다. 그런 다음 동일한 웰에 회복 용액 0.5 mL를 추가로 넣고 남은 모든 물질을 수집합니다.모든 수집물을 볼텍싱하고, 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다. 이 1시간 동안 15분마다 튜브를 볼텍싱하여 매트릭스로부터 세포가 잘 방출되도록 합니다. 1시간 후, 혼합물에 육안으로 보이는 매트릭스 덩어리가 있는지 확인합니다.응집체가 없어야 하지만, 만약 발견된다면 혼합물을 더 큰 튜브로 옮기고 세포 회복 용액을 2~5 mL 더 추가하십시오. 그런 다음 세포를 30~60분 동안 추가로 배양하십시오. 주기적으로 볼텍싱하며 매트릭스 응집체가 사라졌는지 다시 확인하십시오.매트릭스의 뭉침 현상이 사라지면, 혼합물을 4°C에서 1000 RPM으로 5~10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 1 mL의 차가운 1X PBS에 재부유시킵니다.원심분리를 반복합니다. 상층액을 신선한 PBS로 교체하고 세척 과정을 반복합니다. 이 과정을 세 번째까지 수행합니다.세 번째 PBS 세척 후, 다음 절차에 적합한 용액으로 세포를 회수합니다. 골수 세포를 재구성된 골 매트릭스에서 30일 동안 배양하고, 광학 현미경으로 200배 배율에서 주기적으로 이미징하였습니다. 기질 요소는 5일 차에 처음 검출되었으며, 14일 차에는 명확하게 관찰되었습니다.배양 기간 동안 세포는 매트릭스를 통해 이동하여 뚜렷한 클러스터를 형성하며 응집되었습니다. RBM에서 과성장하는 기질 성분의 구성을 평가하기 위해 악성 세포 덩어리를 시간이 경과함에 따라 확장시켰습니다. RBM과 산업용 코팅 사이의 전이 영역에서 세포의 형태를 평가하였습니다.세포를 피브로넥틴, 액틴 및 핵으로 염색하였습니다. 기질 형태를 가진 가시화된 세포들은 알칼리성 인산분해효소 활성이 높은 전골세포인 것으로 나타났습니다. 이들은 자린 레드 염색으로 확인된 바와 같이 칼슘을 무기질화할 수 있었습니다. 지질 방울이 관찰되는 세포들은 오일 레드 염색 양성 반응을 근거로 지방세포로 식별되었습니다.가끔 다핵 형태를 띠는 적색 세포들을 전파골세포(pres osteoclasts)로 인식하였으며, 이들은 tartrate resistant acid phosphatase에 대해 양성 반응을 보였습니다. 3D 배양에서 세포를 분리한 후에는 다양한 분석을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 미세환경에서 성장한 다양한 세포들의 세포 표현형을 연구할 수 있습니다.유전자 및 단백질 발현을 연구할 수 있으며, 3D 조건에서 이러한 세포들에 의해 어떤 종류의 분자들이 분비되는지까지 결정할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

조혈을위한 3D 문화 시스템은 인간 코드 혈액과 leukemic 골수 세포를 사용하여 설명합니다. 방법은 세포외 기질 단백질로 코팅 다공성 합성 폴리 우레탄 발판의​​ 사용을 기반으로합니다. 이 발판은 세포의 광범위한 수용하는 적응이다.

정상과 비정상적인 인간 조혈의 전직 생체내 흉내

테스트 시스템으로 인간의 3D 종양 조직을 만들 수있는 방법이 설명되어 있습니다. 이러한 기술은 decellularized 생물 혈관을 비계 (BioVaSc), 인간의 기본 세포와 흐름 생물 반응기의 동적 조건에서뿐만 아니라 정적에서 배양 할 수있는 종양 세포 라인을 기반으로합니다.

인간의 3 차원의 조직 공학<em&gt; 시험관</em&gt; 종양 테스트 시스템

프로토콜 인간 뼈 조직 이식편 모델 시스템에서 유방암 세포의 이동, 증식 및 집락 공부 설명된다.

배양 인간의 대퇴골 조직 외식하는 방법은 전이성 틈새의 유방암 세포 집락을 연구하기 위해

인간 다발성 골수종 (MM) 세포는 간엽 세포의 생존과 증식을위한 세포 외 매트릭스 성분의지지 미세 환경을 필요로한다. 우리는 종양의 성장, 침윤 및 혈관 신생에 항암제의 효과를 연구하기 위해 접목 인간 골수종 및 중간 엽 세포와 생체 내 닭 배아 모델을 설립했다.

닭에서 인간의 다발성 골수종 이종 이식 모델의 설립은 종양의 성장, 침략과 혈관 신생을 공부하기

생쥐에서 다른 인간화 된 골수 틈새를 만들고 살아있는 방법이 제시됩니다. human mesenchymal cells에 의해 만들어지는지지 적 틈새를 기반으로, 인간 내피 세포의 첨가는 인간 혈관의 형성을 유도하는 반면, rhBMP-2의 첨가는 인간 - 마우스 키메라 성숙한 뼈 조직의 형성을 유도한다.

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

이 프로토콜 생체 외에서 인간 전 임상 모델의 주변 혈액 monocytes 배양 암 세포 osteoclast 상호 작용을 모방 하기 위해 유 방 암 세포 라인에서 osteoclastogenesis의 개발을 설명 합니다. 모델 뼈 전이 형성의 우리의 이해를 심화 하 고 향상 치료 옵션 사용 될 수 있습니다.

말 초 혈액 Monocytes 유 방 암 세포 라인 공동 경작에서 Osteoclastogenesis의 인간의 전 임상 모델의 개발

뼈 이식의 ex vivo 문화 뼈 생리학 및 뼈 리모델링 및 뼈 질환에서 약물의 잠재적인 평가의 연구에 대 한 귀중 한 도구가 될 수 있습니다. 제시된 프로토콜은 신생아 마우스 두개골에서 분리 된 calvarias의 준비 및 문화뿐만 아니라 그 응용 프로그램을 설명합니다.

Calvaria 공동 배양 및 조직 학을 사용하여 뼈 리모델링 및 종양 - 뼈 미세 환경 재현

다리 (OS)의 뼈 기질 (괜 찮) 모델은 잘 설립 하 고 그림 여기. 그것은 기본 종양 성장에서 생체 외에서 흉내 낸 및 OS의 조직학 및 cytogenic이 공부에 대 한 이상적인 모델을 제공 하는 적당 한 발판으로 사용할 수 있습니다.

다리에 대 한 3 차원 뼈 세포 외 매트릭스 모델

여기에서는 인간 골수의 생체 내 구조의 복잡성을 반영하는 구현하기 쉽고 표준화된 미세생리학적 시스템을 설명하여 광범위한 정상 및 병리학적 사건을 미세하게 연구할 수 있는 관련 모델을 제공합니다.

생리학적 또는 종양적 맥락에서 상주 세포 간의 역학 및 상호 작용을 조사하기 위한 인간 골수 3D 모델

골수 혈관 틈새의 시험관 내 모델은 중간엽 및 내피 세포를 프리캐스트 3D PEG 하이드로겔에 파종하여 설정됩니다. 틈새의 내피 네트워크, ECM 성분 및 ALP 활성은 사용된 성장 인자에 따라 다릅니다. 이 플랫폼은 진행된 암 모델에 사용할 수 있습니다.

이미징 마이크로플레이트에서 프리캐스트 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 하이드로겔을 사용하여 혈관화된 골수 틈새의 간단한 설정

이 프로토콜은 메타크릴화 젤라틴(GelMA) 하이드로겔에 박힌 인간 골세포를 이용해 탈세포화된 세포외기질을 보충하여 3D 골 구조물을 제작하는 과정을 설명합니다. 이 방법은 저비용, 확장 가능, 기본 실험실 장비와 호환되어 근골격계 질환 과정을 연구할 수 있는 번역 플랫폼을 제공합니다.

인간 골격계와 탈세포화된 세포외기질을 이용한 근골격계 질환 모델링을 위한 3D 골배양 플랫폼

배우세요 인간 골수 미세환경을 모방하는 3차원 조직 배양 모델을 활용한 세포 배양 기법. 이 방법은 원발성 인간 골수 세포의 직접 시각화 및 분리 분석을 가능하게 하여 생리학적 관련성 높은 연구를 지원합니다.

차 사람 골수 및 악성 종양을 연구하는 세 가지 차원 조직 배양 모델

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