차 사람 골수 및 악성 종양을 연구하는 세 가지 차원 조직 배양 모델

이 절차의 전반적인 목표는 인간 골수의 세포 및 세포 내 미세환경을 면밀하게 재현하는 배양 시스템을 설정하는 것입니다. 첫째, 조직 배양 웰의 표면은 산업용 매트릭스로 코팅됩니다. 그런 다음 골수 단핵 세포 또는 다른 관심 세포를 골수 기질과 혼합합니다.

나중에, 산업용 매트릭스를 제거하고 세포 매트릭스 혼합물을 웰에 첨가합니다. 매트릭스가 젤링되면 성장 배지로 오버레이됩니다. 궁극적으로 세포는 매트릭스에서 직접 시각화하거나 기존 세포 배양 방법과 비교하여 다운스트림 분석을 위해 분리할 수 있습니다.

예를 들어, 표준 조직 배양 방법 또는 공동 배양 모델은 세포가 플라스틱에서 자라는 곳입니다. 3D 배양 방법 사용의 주요 이점은 세포가 생리학적 미시 환경 내에서 성장하므로 조직의 기본 조건 내에서 세포를 연구할 수 있다는 것입니다. 세포가 플레이팅될 48웰 플레이트를 준비합니다.

먼저 65 마이크로 리터의 산업용 코팅 용액을 각각에 첨가하여 용액을 고르게 펴서 우물의 전체 표면을 덮습니다. 이 방법은 다른 표면으로도 확장 가능합니다. 플레이트를 실온에서 최소 30분 동안 배양합니다.

그러는 동안, 50의 세포 현탁액, PBS의 마이크로리터 당 000의 세포를 준비하십시오. 각 웰에 10 마이크로 리터를 추가 할 수 있도록 충분히 준비한 다음 einor 튜브에서 세포 현탁액을 100 마이크로 리터의 재건 된 뼈 기질과 혼합합니다. 잘 부드럽게 섞고 거품이 생기지 않도록 하십시오.

플레이트가 완성되었을 때 매트릭스가 겔화되지 않도록 혼합물을 얼음에 보관하십시오. 인큐베이팅, 흡인을 통해 모든 액체 및 도트 코팅 용액을 제거합니다. 그런 다음 매트릭스가 있는 잘 혼합된 세포 현탁액 100마이크로리터를 각각에 추가합니다.

우물의 전체 표면을 고르게 덮기 위해 피펫을 사용하여 플레이트를 빠르게 기울입니다. 완전히 로드되면 세포가 뭉치므로 웰 채우기 사이에 현탁액을 계속 혼합하십시오. 매트릭스가 응고될 때까지 교반 없이 30-60분 동안 플레이트를 배양합니다.

다음으로, 골수 성장 배지를 섭씨 37도로 설정된 수조에서 예열합니다. 30분 동안 배양한 후 매트릭스가 제대로 설정되었는지 확인합니다. 좋은 매트릭스는 플레이트가 기울어질 때 움직이지 않는 부드러운 젤 같은 층을 형성합니다.

매트릭스가 준비되면 혈청학적 피펫을 사용하여 1밀리리터의 배지를 적어 부드럽게 오버레이합니다. 그런 다음 조립된 재구성된 뼈 기질 배양액을 배지 변경 없이 최대 30일 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 매체 변경이 필요한 경우 한 번에 매체의 절반만 변경합니다.

매트릭스 층을 방해하지 않고 매체를 부드럽게 제거하십시오. 플레이트를 기울이고 피펫을 사용하여 매체를 부드럽게 배수합니다. 나중에 매트릭스를 통해 미디어를 흡인하지 마십시오.

세포를 염색할 때. 솔루션 변경에 이 기술을 사용합니다. 3D 배양의 웰에서 매체를 제거하려면 웰 측면에서 매체를 제거하는 것이 매우 중요합니다.

그렇지 않으면 매트릭스가 교란되고 세포가 손실될 수 있습니다. 동일한 기술을 고수합니다. 멸균 XPBS로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 각각에 반 밀리리터의 얼음 저온 세포 회수 용액을 추가합니다.

세포와 함께 전체 매트릭스 층을 위아래로 격렬하게 피펫팅하여 잘 제거합니다. 각각에 대해 수집품을 마이크로 원심분리기 튜브로 잘 옮기고 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 동일한 웰에 50밀리리터의 회수 용액을 추가로 추가하고 나머지 물질을 모두 수집합니다.

모든 컬렉션을 소용돌이치고 얼음 위에서 한 시간 동안 배양합니다. 한 시간 동안 15분마다 튜브를 소용돌이쳐 매트릭스에서 세포 방출을 촉진합니다. 한 시간 후, 혼합물에 눈에 보이는 매트릭스 덩어리가 있는지 확인하십시오.

아무 것도 없어야 하지만, 있는 경우 혼합물을 더 큰 튜브로 옮기고 2-5ml의 세포 회수 용액을 추가로 추가합니다. 그런 다음 30-60분 동안 세포를 더 배양합니다. 주기적으로 소용돌이치고 매트릭스 덩어리가 없는지 다시 확인합니다.

행렬이 더 이상 덩어리가 아닌 경우. 혼합물을 섭씨 4도에서 5-10분 동안 1000RPM으로 원심분리합니다. 그런 다음 상등액을 제거하고 세포 펠릿을 1 밀리리터의 차가운 XPBS에 재현탁시킵니다.

원심분리를 반복합니다. 상층액을 새 PBS로 교체하고 세척을 반복합니다. 세 번째로.

세 번째 PBS 세척 후 다음 절차를 위해 적절한 용액에서 세포를 회수합니다. 골수 세포를 재건된 뼈 매트릭스에서 30일 동안 성장시키고 200배 배율로 광학 현미경으로 주기적으로 이미지화했습니다. 기질 요소는 5일째에 처음 발견되었지만 14일째에 명확하게 나타났습니다.

배양 기간 동안 세포는 매트릭스를 통해 이동하여 별개의 클러스터로 응집되었습니다. 악성 세포의 덩어리는 RBM에서 자라는 기질 구성 요소의 구성을 평가하기 위해 시간이 지남에 따라 확장되었습니다. RBM과 산업용 코팅 사이의 전이에서 세포의 형태를 평가했습니다.

세포는 피브로넥틴(fibronectin), 액틴(actin) 및 핵(nuclei)에 대해 염색되었습니다. 기질 형태학을 가진 시각화 세포는 높은 수준의 알칼리성 인산가수분해효소 활성을 가진 pres osteoblasts인 것으로 나타났습니다. 그들은 자린에 의해 결정된 바와 같이 칼슘을 광물화할 수 있었고, 지질 방울의 가시적 존재를 가진 붉은 염색 세포는 오일로 양성 염색을 기반으로 한 지방 세포로 확인되었습니다.

때때로 여러 개의 핵을 가진 적혈구는 pres osteoclasts로 인식되었으며 주석산염 저항성 산 인산가수분해효소에 대해 양성이었습니다. 3D 배양에서 세포를 분리한 후 다양한 작업을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 미세환경에서 자란 다양한 세포의 세포 표현형을 연구할 수 있습니다.

유전자와 단백질 발현을 연구할 수 있으며 3D 조건에서 이러한 세포에서 어떤 종류의 분자가 분비되는지도 결정할 수 있습니다.