3.6: 예쁜 꼬마 선충 유지

Caenorhabditis elegans의 올바른 관리와 유지는 성공적인 실험을 위해 필수적입니다.

그들은 매우 적은 공간을 필요로 하고, 집값이 저렴하고, 생산력이 높고, 조작하기 쉽습니다. 그러나 그것들을 보관하기 쉽다고 해서 과학이 엉뚱하다는 것을 의미하지는 않습니다. 사실, 시드니 브레너(Sydney Brenner)는 예쁜꼬마선충을 "과학에 대한 자연의 선물"이라고 불렀으며, 1974년에 처음 소개된 이래 이 벌레는 여러 노벨상 수상 실험에 등장했습니다.

이 비디오에서는 실험실에서 예쁜꼬마선충을 유지하기 위한 기본 방법(사육 및 먹이, 취급, 지렁이의 냉동 및 해동)을 시연합니다.

야생에서 예쁜꼬마선충은 토양에서 발견되며 부패하는 식물 물질을 먹습니다. 실험실에서는 선충을 가능한 한 행복하게 유지하는 것이 중요하므로 매우 구체적인 방법을 사용하여 선충을 수용하고 먹이를 줍니다.

C. 예쁜꼬마선충은 16, 20 또는 25세에 자랄 수 있습니까? C는 실험의 요구 사항에 따라 고체 또는 액체 매체에서 성장할 수 있습니다. 두 경우 모두 전 세계 모든 기생충 실험실에서 선충 배양에 특별히 사용되는 표준화된 대장균 균주인 OP50을 먹입니다.

25세에 자랄 때 ? C, C. 예쁜꼬마선충은 16°C에서 자랄 때보다 2.1배 더 빨리 생애 주기를 마칩니다. 수명 주기가 빠르다는 것은 기생충이 더 빨리 성숙하고 더 많은 알을 낳고 더 많은 음식을 섭취한다는 것을 의미합니다. 지렁이가 굶주리거나 너무 붐비게 되면 다우어 단계(dauer stage)라고 하는 유충 단계로 들어갑니다. 다우어 유충은 스트레스에 강하고 노화하지 않습니다.

고체 배지에서 유지될 때, 예쁜꼬마선충은 선충 성장 배지 또는 NGM 배지로 준비된 한천 플레이트에서 성장합니다. 플레이트를 만들기 전날, 액체 LB 배지에 OP50 E. coli 단일 콜로니를 접종합니다. 37세에 미디어를 배양하라 ? 밤새 C를 흔들어 줍니다.

고체 매체를 만들려면 삼각 플라스크에서 이러한 성분을 적절한 양으로 탈이온수와 결합하십시오.

최소 15분 동안 고압증기멸균한 후 한천을 55도로 식히십시오. C 수조에서. 미디어가 55로 냉각되면? C 맨손으로 유리 용기를 편안하게 잡을 수 있어야 합니다. 적절한 무균 기술을 사용하여 이때 약물이나 항생제와 같은 첨가제를 첨가할 수 있습니다. 섞기 위해 소용돌이치십시오. 그런 다음 NGM이 2/3 가득 찰 때까지 페트리 플레이트에 용융된 NGM을 피펫으로 만듭니다. 새로 만든 접시를 벤치에서 밤새 말리십시오.

다음날 아침 OP50을 3500 x g에서 10분 동안 펠렛으로 만든 다음 LB 배지에 박테리아를 10X 농도로 재현탁합니다. 이제 각 접시에 중앙 잔디밭을 피펫으로 만듭니다. 피펫 팁을 NGM 표면에 만지지 말고 배양물이 판벽에 닿지 않도록 주의하십시오. 접시를 벤치에서 밤새 말리십시오. 건조되면 플레이트를 자외선에 노출시켜 살균하십시오. 이제 벌레를 배양할 때 사용할 준비가 되었습니다.

C. 예쁜꼬마선충은 웜 픽(worm pick)이라는 도구를 사용하여 개별적으로 조작됩니다. 픽은 일반적으로 30게이지 90% 백금과 10% 이리듐 와이어로 만들어지지만 일부 연구자들은 약간 다른 금속 구성을 선호할 수 있습니다. 픽을 만들려면 파스퇴르 피펫의 끝을 원하는 길이로 부수는 것으로 시작하십시오.

약 3-4cm의 와이어를 자르고 피펫 끝 부분에 0.5cm를 넣습니다. Bunsen 버너를 통해 유리에 와이어를 밀봉합니다. 유리에서 튀어나온 와이어의 길이는 약 3cm에서 3.5cm이지만 개인의 취향에 따라 달라질 수 있습니다.

단단한 가장자리를 사용하여 와이어 끝을 평평하게 만듭니다. 그런 다음 평평한 부분을 위로 구부려 국자를 만듭니다. 마지막으로 곡괭이의 가장자리를 사포로 닦아 벌레나 한천이 손상되지 않도록 합니다.

웜을 따려면 화염에 픽의 와이어를 살균하십시오. 그런 다음 NGM 플레이트의 두껍고 끈적한 OP50 E. coli로 팁을 코팅합니다. 한천 표면에 구멍을 내거나 흉터를 내지 않도록 주의하십시오.

해부 내시경을 통해 보면서 벌레가 곡괭이에 달라붙을 때까지 납작하고 끈적끈적한 곡괭이에 벌레를 가볍게 떠냅니다.

웜이 곡괭이에 들어가면 팁을 새 플레이트의 새 표면에 가볍게 잡고 박테리아 잔디밭을 가로질러 밀어 즉시 옮깁니다. 지렁이는 곡괭이에서 기어 나와야 합니다. 지렁이가 곡괭이에 너무 오래 머물러서는 안 되며 그렇지 않으면 건조해질 수 있습니다.

예쁜꼬마선충(C. elegans)이 연구에서 인기 있는 모델인 이유 중 하나는 배양물을 부작용 없이 장기간 보관할 수 있기 때문입니다.

먼저 0.5ml M9 버퍼를 사용하여 갓 굶주린 유충을 씻고 부드럽게 휘젓어 모든 유충과 성충을 풀어준 다음 마이크로 원심분리기 또는 냉동 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 M9 Buffer에 동일한 양의 30% 글리세롤을 첨가합니다. 마지막으로 바이알을 단열 상자에 포장하고 -80°C에서 보관합니다.

기생충을 회수하려면 -80 냉동고에서 튜브를 제거하고 내용물이 완전히 녹을 때까지 실온에서 해동합니다. OP50 잔디밭이 있는 새 NGM 플레이트에 액체를 피펫으로 넣고 20°C에서 배양합니다. 2-3일 후, 10-15마리의 동물을 새 접시에 옮겨 넣고 한 세대 동안 번식할 수 있도록 합니다. 자손을 수집하고 올바른 표현형에 대한 점수를 매깁니다.

이제 우리는 예쁜꼬마선충이 실험실에서 어떻게 유지되는지 보았으므로 실험을 위해 먹이, 수용 및 취급 조건이 어떻게 수정되는지 살펴보겠습니다.

RNA 간섭에 대한 노벨상 수상의 발견으로 연구자들은 예쁜꼬마선충의 기능을 결정하기 위해 예쁜꼬마선충 유전자를 침묵시킬 수 있었다.

우리는 먼저 벌레가 먹을 표적 유전자 dsRNA를 발현하는 E. coli가 있는 플레이트를 준비함으로써 C. elegans에서 RNAi를 유도할 수 있습니다.

그런 다음 4번째 유충 단계 기생충을 RNAi 플레이트로 옮겨 알을 낳을 수 있습니다. 원하는 발달 단계에서 자손을 수집하고 표현형에 대해 점수를 매깁니다. 우리는 게놈의 약 절반을 기생충과 공유하기 때문에 얻은 많은 통찰력은 인간의 질병에 적용할 수 있습니다.

빠른 수명 주기 때문에 C. elegans는 노화 모델로 특히 적합합니다.

첫째, 성체 자웅동체가 NGM 플레이트에 알을 낳을 수 있도록 함으로써 C. elegans의 시간 동기화된 개체군이 생성됩니다. 벌레는 6-8 시간 동안 알을 낳은 다음 제거됩니다.

기생충이 원하는 단계에 이르면 박테리아 오염을 방지하기 위해 암피실린을 함유하고 번식을 방지하기 위해 FUDR을 포함하는 새로운 NGM 플레이트로 옮겨집니다.

이 시점부터 모든 기생충이 죽을 때까지 2-3일마다 성충이 관찰됩니다. 죽은 벌레가 플레이트에서 제거되고 살아있는 벌레와 죽은 벌레의 수가 기록됩니다.

유전적 또는 환경적 모욕의 맥락에서 수명을 분석하면 노화 과정에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

레이저를 사용하면 신경 세포가 어떻게 재생되는지 연구하기 위해 살아있는 예쁜꼬마선충에서 축삭 절개술 또는 개별 축삭 절단을 수행할 수 있습니다.

그러나 벌레는 결코 가만히 있지 않기 때문에 마이크로비즈 용액의 10% 아가로스 패드에 놓습니다. 커버 슬립이 상단에 배치됩니다. 마이크로비드는 패드-커버슬립 상호작용의 마찰 계수를 증가시켜 웜을 제자리에 효과적으로 동결시킵니다.

이제 슬라이드가 축삭 절개술을 수행할 준비가 되었습니다. 뉴런이 시야에 들어오고 현미경의 중심에 놓입니다. 그런 다음 풋 페달을 사용하여 레이저를 발사합니다. 최적의 레이저 출력은 인접한 구조에 해를 끼치지 않고 뉴런을 절단합니다. 동물당 가능한 한 많은 축삭을 절단합니다.

그런 다음 아가로스 패드를 슬라이드에서 조심스럽게 제거하고 20°C에서 파종된 NGM 플레이트에서 웜이 회복되도록 합니다.축삭 절개술 후 8-48시간 사이에 뉴런은 재생을 위해 점수를 매길 수 있도록 준비할 수 있습니다. 절단의 원위 부분에서 뉴런은 그루터기를 형성합니다. 그러나 근위부에서 뉴런은 재생되어 길쭉한 신경돌기를 형성합니다.

당신은 방금 JoVE가 기본적인 Ceanorhabditis elegans 유지 보수를 수행하는 것을 보았습니다. 이 비디오에서는 예쁜꼬마선충의 사육 및 먹이 공급, 취급, 선충의 냉동 및 회복에 대해 검토했습니다.

우리는 또한 예쁜꼬마선충을 강력한 연구 도구로 만드는 몇 가지 응용 프로그램을 간략하게 살펴보았습니다. 예쁜꼬마선충은 여러 면에서 포유류와 다르지만, 유사한 유전적 구성, 유지 관리 용이성 및 간단한 조작으로 인해 포유류의 생물학과 질병을 이해하는 데 중요한 모델이 됩니다. 시청해 주셔서 감사합니다!