셀 동작의 Nanotopographical 변조를위한 나노 패턴 기판 사용 스티치 기법을 확장

이 절차의 전반적인 목표는 간단하고 저렴하면서도 다재다능한 스티치 기술을 사용하여 작은 나노 패턴 주형에서 넓은 면적의 나노 패턴 기판을 생산하는 것입니다. 이 방법은 국소 접착 단백질의 발현과 같은 세포 및 분자 수준에서 세포 표현형 및 기능의 기질 나노 지형 조절을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 간단하고 비용 효율적이라는 것입니다.

먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 PDMS 프리폴리머에서 실란화된 실리콘 몰드를 준비합니다. 실란화 된 실리콘 몰드를 60mm 페트리 접시에 넣으십시오. PDMS 프리폴리머를 페트리 접시의 실리콘 몰드에 붓습니다.

페트리 접시를 플라스틱 건조제에 넣고 모든 거품이 사라질 때까지 약 10분 동안 가스를 제거합니다. 페트리 접시를 핫 플레이트로 옮기고 PDMS 프리폴리머를 섭씨 70도에서 4시간 동안 경화합니다. 핀셋을 사용하여 실리콘 몰드에서 PDMS 몰드를 조심스럽게 떼어냅니다.

광학 현미경으로 나노그레이팅과 같은 이방성 PDMS 나노 패턴의 방향을 결정하고 마커 펜으로 PDMS 몰드 뒷면에 표시합니다. 흄 후드에서 에탄올로 실리콘 기판을 청소한 다음 압축 공기로 건조시킵니다. 블레이드로 각 PDMS 금형의 패턴화되지 않은 부분을 잘라냅니다.

PDMS 금형은 패턴화되지 않은 영역을 최소화하고 압축기 힘이 가해질 때 나노패턴 변형에 닿지 않도록 가능한 한 가깝게 정렬해야 하지만 주변 금형에 닿지 않아야 합니다. 트리밍된 PDMS 몰드를 나노 패턴이 앞면이 아래로 향하게 하여 실리콘 기판의 미러 면에 놓고 다른 몰드를 주변 몰드에 닿지 않도록 정렬합니다. 경화되지 않은 PDMS가 여러 주형 사이의 틈을 통해 흘러 나노 패턴을 손상시킬 수 있기 때문에 기저층에서 PDMS를 경화하는 것이 중요합니다.

그러나 완전히 경화된 PDMS는 여러 금형을 함께 접착할 수 없습니다. PDMS 접착층을 준비하려면 깨끗한 유리 슬라이드에 탈기된 PDMS 프리폴리머 1g을 주조하여 0.5mm 두께의 층을 형성합니다. PDMS 층을 섭씨 100도의 핫 플레이트에서 3-5분 동안 굽습니다.

바늘을 사용하여 층을 만지고 층이 부분적으로 경화되었지만 완전히 경화되지 않았는지 확인하십시오. 정렬된 PDMS 금형의 뒷면에 PDMS 레이어를 배치하고 이 어셈블리를 빠르게 반전시킨 다음 핫 플레이트로 옮깁니다. PDMS 접착층과 PDMS 금형 뒷면이 잘 접촉하도록 어셈블리 상단의 금속 블록을 사용하여 압축력을 가합니다.

PDMS 접착층을 섭씨 100도에서 1시간 동안 경화시킵니다. 핫 플레이트를 끄고 금속 블록을 제거한 다음 실리콘 기판에서 단일 스티치 PDMS 금형을 벗겨냅니다. 스티칭된 PDMS 몰드를 PS 플레이트에 나노임프린트하려면 PS 플레이트를 3인치 실리콘 웨이퍼의 알루미늄 스페이서 세트에 놓습니다.

핫 플레이트의 PS 플레이트를 섭씨 250도에서 30분 동안 가열합니다. 그런 다음 나노 패턴이 뒤집힌 스티치된 PDMS 몰드를 용융된 PS 플레이트에 놓습니다. 다음으로, 스티치된 PDMS 금형의 유리 슬라이드에 알루미늄 플레이트를 놓습니다.

알루미늄 판에 금속 블록을 사용하여 압축 압력을 가하고 3분 동안 기다립니다. 알루미늄 판에서 금속 블록을 들어 올려 교체하고 압축 압력을 25킬로파스칼로 높입니다. 그런 다음 압력을 50킬로파스칼로 증가시켜 이 단계를 반복합니다.

15분 동안 50킬로파스칼의 일정한 압력에서 핫플레이트의 온도를 섭씨 240도에서 250도 사이로 유지합니다. 핫 플레이트를 끄고 전체 설정을 식히십시오. 온도가 섭씨 50도 이하로 내려간 후 금속 블록을 제거하고 PS 플레이트에서 스티치된 PDMS 금형을 조심스럽게 떼어냅니다.

PS 박막에 PDMS 몰드를 나노임프린트하려면 나노토포그래피가 있는 스티치된 PDMS 몰드를 핫 플레이트에 세팅된 PS 박막에 앞면이 아래로 향하게 놓습니다. PDMS 금형의 유리 슬라이드에 금속 블록을 사용하여 PDMS 금형에 12킬로파스칼의 압축 압력을 가합니다. 핫플레이트의 온도를 섭씨 180도로 높이고 15분 동안 유지합니다.

핫 플레이트를 끄고 전체 설정을 식히십시오. 온도가 섭씨 50도 이하로 떨어진 후 금속 블록을 제거하고 PS 필름에서 스티치된 PDMS 금형을 조심스럽게 떼어냅니다. 속이 빈 강철 아치 펀치를 사용하여 나노 패턴이 적용된 PDMS 기판을 특정 멀티웰 플레이트의 구성에 맞게 디스크로 절단합니다.

그런 다음 핀셋을 사용하여 PDMS 디스크를 다중 웰 플레이트의 웰에 놓습니다. 30분 동안 70% 에탄올을 사용하여 PDMS 기판을 살균합니다. 그 후, 에탄올을 흡인하고 30 분 동안 자외선에 노출시킵니다.

PDMS 기질을 1X 멸균 인산염 완충 식염수로 3회 세척합니다. 다음으로, 실온에서 30분 동안 PDMS 기질을 세포외 기질 단백질로 코팅합니다. PDMS 기판을 멸균 PBS로 각각 5분씩 세 번 헹굽니다.

10%의 소 태아 혈청을 사용하여 Dulbecco의 Modified Eagle Medium에 인간 A549 폐암 세포를 현탁시키고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. PDMS 기질에 2, 평방 센티미터당 000개의 세포의 파종 밀도로 세포를 플레이트화합니다. 5%의 이산화탄소가 함유된 가습 분위기에서 섭씨 37도의 세포를 하루 동안 배양하고 나중에 관찰합니다.

PS 플레이트와 박막에 생성된 나노패턴이 여기에 나와 있습니다. 화살표는 스티칭된 PDMS 금형의 틈새에서 폴리머 상승을 나타냅니다. 이러한 SEM 이미지는 PDMS 작업 기판이 스티치 기술을 적용하여 전자빔 리소그래피로 작성된 나노 패턴에서 충실하게 전달됨을 보여줍니다.

나노격자 및 나노필러에서 성장한 A549 세포의 대표적인 SEM 이미지가 여기에 나와 있습니다. 세포는 나노 격자에서 정렬 된 세포 형태를 보이는 반면, 세포는 나노 기둥에서 무작위로 퍼져 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 여러 개의 작은 나노 패턴 주형을 스티칭하여 넓은 면적의 나노 패턴 기판을 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

톨루엔과 파라포름알데히드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있음을 잊지 말고 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.