셀 동작의 Nanotopographical 변조를위한 나노 패턴 기판 사용 스티치 기법을 확장

이 절차의 전반적인 목표는 단순하고 저렴하면서도 다재다능한 스티치(stitch) 기술을 사용하여 작은 나노패턴 몰드로부터 넓은 면적의 나노패턴 기판을 제작하는 것입니다. 이 방법은 초점 접착 단백질의 발현과 같이 세포 및 분자 수준에서 기판의 나노토포그래피 변조가 세포 표현형과 기능에 미치는 영향을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단순하고 비용 효율적이라는 점입니다.

먼저, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 실란화된 실리콘 몰드를 PDMS 프리폴리머로 준비합니다. 실란화된 실리콘 몰드를 60 millimeter 페트리 접시에 넣습니다. 페트리 접시에 있는 실리콘 몰드 위에 PDMS 프리폴리머를 붓습니다.

페트리 접시를 플라스틱 데시케이터에 넣고 모든 기포가 사라질 때까지 약 10분 동안 탈기합니다. 페트리 접시를 핫플레이트로 옮겨 PDMS prepolymer를 70 °C에서 4시간 동안 경화시킵니다. 핀셋을 사용하여 실리콘 몰드에서 PDMS 몰드를 조심스럽게 떼어냅니다.

광학 현미경 하에서 나노그레이팅과 같은 이방성 PDMS 나노패턴의 방향을 결정하고, 마커 펜을 사용하여 PDMS 몰드의 뒷면에 표시합니다. 흄 후드 내에서 에탄올로 실리콘 기판을 세척한 후, 압축 공기로 건조합니다. 칼날을 사용하여 각 PDMS 몰드의 패턴이 없는 영역을 잘라냅니다.

비패턴 영역을 최소화하고 압축기 힘이 가해질 때 나노패턴 변형으로 인한 접촉을 방지하기 위해, PDMS 몰드는 주변 몰드에 닿지 않으면서 최대한 가깝게 정렬해야 합니다. 나노패턴 면이 아래로 향하도록 트리밍된 PDMS 몰드를 실리콘 기판의 미러 면 위에 놓고, 다른 몰드들을 주변 몰드에 닿지 않게 밀착하여 정렬하십시오. 경화되지 않은 PDMS가 여러 몰드 사이의 틈으로 흘러 들어가 나노패턴을 손상시킬 수 있으므로, 기저층에서 PDMS를 경화시키는 것이 매우 중요합니다.

하지만 완전히 경화된 PDMS는 여러 개의 몰드를 서로 접착할 수 없습니다. PDMS 접착층을 준비하려면, 탈기된 PDMS 프리폴리머 1 g을 깨끗한 유리 슬라이드 위에 캐스팅하여 0.5 mm 두께의 층을 형성합니다. 이 PDMS 층을 핫플레이트에서 100 °C로 3~5분 동안 가열합니다.

바늘을 사용하여 층을 터치해 층이 완전히 경화되지 않고 부분적으로만 경화되었는지 확인합니다. PDMS 층을 정렬된 PDMS 몰드의 뒷면에 놓고, 이 조립체를 빠르게 뒤집어 핫플레이트로 옮깁니다. 조립체 위에 금속 블록을 올려 압축력을 가함으로써 PDMS 접착층과 PDMS 몰드의 뒷면이 잘 접촉되도록 합니다.

PDMS 접착층을 100 °C에서 1시간 동안 경화시킵니다. 핫플레이트 전원을 끄고 금속 블록을 제거한 후, 실리콘 기판에서 단일 스티칭된 PDMS 몰드를 떼어냅니다. 스티칭된 PDMS 몰드를 PS 플레이트에 나노임프린팅하기 위해, 3인치 실리콘 웨이퍼 위에 설치된 알루미늄 스페이서에 PS 플레이트를 배치합니다.

핫플레이트에서 PS 플레이트를 250 °C로 30분 동안 가열합니다. 그 다음, 나노패턴 면이 아래로 향하게 하여 스티칭된 PDMS 몰드를 용융된 PS 플레이트 위에 놓습니다. 이어서, 스티칭된 PDMS 몰드의 유리 슬라이드 위에 알루미늄 플레이트를 올립니다.

알루미늄 플레이트 위에 금속 블록을 사용하여 압축 압력을 가하고 3분 동안 기다립니다. 알루미늄 플레이트에서 금속 블록을 들어 올려 제거한 후, 압축 압력을 25 kilopascals로 높입니다. 그런 다음, 압력을 50 kilopascals로 높여 이 단계를 반복합니다.

핫플레이트의 온도를 240에서 250 °C 사이로 유지하며 50 kPa의 일정한 압력을 15분 동안 가합니다. 핫플레이트 전원을 끄고 전체 장치를 냉각시킵니다. 온도가 50 °C 미만으로 내려가면 금속 블록을 제거하고, PS 플레이트에서 스티치형 PDMS 몰드를 조심스럽게 떼어냅니다.

PS 박막 위에 PDMS 몰드를 나노임프린트 하려면, 핫플레이트 위에 놓인 PS 박막 위에 나노토포그래피 면이 아래로 향하도록 스티칭된 PDMS 몰드를 배치합니다. PDMS 몰드의 유리 슬라이드 위에 금속 블록을 사용하여 PDMS 몰드에 12 kilopascals의 압축 압력을 가합니다. 핫플레이트의 온도를 180 °C까지 높이고, 이 상태를 15분 동안 유지합니다.

핫플레이트를 끄고 전체 장치를 식힙니다. 온도가 50 °C 아래로 떨어지면 금속 블록을 제거하고, PS 필름에서 스티칭된 PDMS 몰드를 조심스럽게 떼어냅니다. 중공강 아치 펀치(hollow steel arch punch)를 사용하여 나노 패턴이 형성된 PDMS 기판을 특정 멀티웰 플레이트의 구성에 맞게 디스크 형태로 절단합니다.

그런 다음, 핀셋을 사용하여 PDMS 디스크를 멀티웰 플레이트의 웰에 배치합니다. 70% ethanol을 사용하여 30분 동안 PDMS 기판을 멸균합니다. 그 후, ethanol을 흡입하여 제거하고, 이어서 30분 동안 UV 조사를 실시합니다.

PDMS 기판을 1X 멸균 인산염 완충 식염수로 3회 세척합니다. 다음으로, 실온에서 30분 동안 PDMS 기판을 세포외 기질 단백질로 코팅합니다. 멸균 PBS로 PDMS 기판을 각각 5분씩 3회 헹굽니다.

10% fetal bovine serum이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium에 인간 A549 폐암 세포를 부유시키고, 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다. PDMS 기판 위에 제곱센티미터당 2, 000 cells의 파종 밀도로 세포를 분주합니다. 5% carbon dioxide가 포함된 습윤 분위기의 37 degrees Celsius에서 세포를 하루 동안 배양한 후, 세포를 관찰합니다.

PS 플레이트와 박막 위에 생성된 나노패턴이 여기에 제시되어 있습니다. 화살표는 스티칭된 PDMS 몰드의 틈새에 형성된 폴리머 돌출부를 나타냅니다. 이러한 SEM 이미지는 스티칭 기술을 적용함으로써 전자빔 리소그래피로 작성된 나노패턴으로부터 PDMS 작업 기판이 충실하게 전사되었음을 보여줍니다.

나노그레이팅(nanogratings) 및 나노필라(nanopillars) 위에서 배양된 A549 세포의 대표적인 SEM 이미지가 여기에 제시되어 있습니다. 세포들은 나노그레이팅 위에서 정렬된 세포 형태를 보이는 반면, 나노필라 위에서는 무작위로 퍼져 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 여러 개의 작은 정의된 나노패턴 몰드를 스티칭하여 넓은 면적의 나노패턴 기판을 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

toluene 및 paraformaldehyde를 사용하는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 절차를 수행하는 동안 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용해야 함을 잊지 마십시오.