에서 신경 혈관 리모델링의 분석 Entorhino - 해마 Organotypic 슬라이스 문화

허혈성 뇌 손상의 여러 측면을 재생할 수 있습니다 entorhino - 해마의 Organotypic 슬라이스 문화에 대한 프로토콜은 제공됩니다. 신경 세포의 변화에​​ 더하여 neurovasculature의 변화를 연구함으로써,이 프로토콜은 손상 후 신경 조직 플라스틱 변화를 연구하는 다양한 도구입니다.

이 절차의 전반적인 목적은 허혈성 뇌 손상의 조직 배양 모델에서 뉴런과 혈관의 변화를 동시에 연구하는 것입니다. 이것은 먼저 코뿔소 해마 절편 배양을 설정하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 배양물을 저산소 상태에 노출시켜 허혈성 뇌 손상을 모방하는 것입니다.

마지막 단계는 신경 세포의 생존과 혈관 변화를 분석하고 연관시키는 것입니다. 궁극적으로, 유기 해마 절편 배양을 기반으로 한 시험관 내 접근 방식은 허혈 상태에서 뉴런과 혈관 구조 사이의 복잡한 상호 작용을 보여주는 데 사용됩니다. 이 기술의 주요 장점은 저산소 챌린지 후 슬라이스 배양 모델 시스템에서 신경 세포의 생존과 혈관의 변화를 동시에 연구할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 신경 허혈 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있으며, 예를 들어 뉴런과 혈관 구조 간의 복잡한 상호 작용 및 허혈 상태를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 시작하려면 산후 날 양식 마우스 팝에서 코뿔소 해마 유기형 슬라이스 배양을 준비하십시오. 두개골을 제거한 후 대뇌 반구의 코달 말단과 중뇌 사이의 균열을 확인합니다.

중뇌로 가는 뇌 주부 부분을 조심스럽게 제거하고 MEM이 보충된 얼음처럼 차가운 제제 매체에 넣습니다. 실체 현미경으로 해부를 계속하여 뇌를 얼음처럼 차가운 준비 매체에 담그십시오. 피질 반구에 남아 있는 수막을 제거합니다.

다음으로, 반구의 내측 코달 표면에서 해마를 확인하고, 뇌의 나머지 부분과 인접한 진입 RH 피질과 함께 분리합니다. 조직을 조직 다지기로 옮기고 해마의 중격 측두축에 가로로 400미크론 두께의 조각을 자릅니다. 세포 배양 삽입물에 슬라이스를 놓고 가습된 분위기에서 1ml의 배양 배지와 함께 6개의 웰 플레이트에 배양합니다.

다음날 매체를 변경하고 최대 일주일 동안 격일로 매체를 변경합니다.다음으로 OGD 매체를 준비합니다. 2 6의 각 웰에 1 밀리리터의 OGD 매체를 추가합니다. 웰 조직 배양 플레이트는 저산소증 챔버에서 1시간 동안 OGG 배지를 질소와 함께 관류하고 밤새 밀봉 및 보관하기 전에 섭씨 37도의 인큐베이터에서 혐기성 스트립을 저산소 지표로 사용합니다.

스트립의 색상이 분홍색에서 흰색으로 변할 때 매체에 산소가 없는 것으로 간주합니다. 준비가 되면 프로피듐 요오드화물 또는 PI 염색으로 건강한 세포를 선택합니다. 배양 배지에 30분 동안 파이를 밀리리터당 2마이크로그램의 농도로 첨가합니다.

형광 광학 장치만 장착된 도립 현미경으로 살아있는 배양을 볼 수 있습니다. 여기에 표시된 것처럼 라벨링된 세포가 거의 없는 슬라이스는 여기에 표시된 것처럼 라벨링된 세포가 많은 추가 연구를 위해 선택해야 합니다. OGD 유도에 사용해서는 안 됩니다.

OGD 매체로 슬라이스를 옮기고 저산소증 챔버에서 15분 동안 유지하고 인서트 측면에 남아 있는 모든 유체가 스위치 배양에서 멀리 흡인되도록 합니다. 일반 배지에서 OGD 배지로, 그리고 OGD 후 다시 OGD 배지로 교체하고 OGD 배지를 산소가 함유된 무혈청 배지로 교체하고 배양액이 3, 24 또는 48시간 동안 회복되도록 합니다. 무혈청 배지에서 세포 사멸 측정을 위해 고정하기 전에 pi를 다시 추가합니다.

연구에 약물 치료가 필요한 경우 OGD 중 또는 슬라이스가 무혈청으로 옮겨진 직후에 시작하십시오. PI 염색을 위한 매체. 면역조직화학과 함께 배양물을 고정하기 30분 전에 PI 용액을 첨가합니다.

밤새 세포를 고정한 후 PFA 용액을 제거하고 슬라이스를 3-4회 세척합니다. PBS를 사용하여 배양 삽입물에서 슬라이스를 조심스럽게 분리하고 차단 버퍼로 채워진 96웰 플레이트의 웰로 옮겨 차단 절차를 시작합니다. 슬라이스를 블로킹 버퍼에 2시간 동안 보관하고 실온에서 오비탈 셰이커에 의한 지속적인 교반 하에 보관합니다.

선택한 1차 항체를 첨가한 후, 배양 기간 후에도 지속적인 교반으로 섭씨 4도에서 48시간 동안 배양합니다. 0.5% Triton X 103을 4회 PBS로 세척합니다. 다음으로, 커버 슬립이 있는 유리 슬라이드에 염색 섹션을 장착하기 전에 2차 항체 전반에 걸쳐 표준 절차를 따릅니다.

epi 형광 장비가 있는 표준 현미경 또는 컨포칼 현미경으로 염색된 조각을 볼 수 있습니다. 일부 이미지의 경우 형광 대비를 반전시켜 라미닌으로 염색된 슬라이스를 사용하여 밝은 배경에 어둡게 염색된 혈관을 생성합니다. 10배 배율의 기록된 이미지를 6 x 6 그리드와 중첩하여 ca 1, ca 3, dg 및 dc 영역에 3개의 그리드를 오버레이합니다.

그리고 그리드의 선을 가로지르는 선박을 세어 통계적 관련성이 좋은 결과를 얻습니다. 새끼 쥐당 3개의 슬라이스가 있는 3개의 마우스 퍼프의 데이터를 포함하여 각각 3개의 독립적인 실험에서 측정을 수행합니다. 대조군 배양과 치료제를 비교하면 저산소증이 해마의 한 부위에서 신경 세포의 사멸과 혈관 소실을 유발한다는 사실이 밝혀졌습니다.

이 예시에서, PI 염색은 빨간색으로 표시되고 저산소증 치료 후 3시간 후에 녹색의 라미닌 염색과 병합되며, PI 염색은 보이지 않으며 혈관 변화는 뚜렷하지 않습니다. 24시간 후 PI 염색이 나타나고 혈관 손실도 분명합니다. PI 염색과 혈관 손실은 모두 48시간 후에 더 분명해집니다.

OGD만으로도 신경 세포 손실과 혈관 손실을 모두 유발합니다. 캘리포니아에서 TTX 또는 CN QX를 한 번 적용하면 PI 염색에서 볼 수 있듯이 신경 세포 손실과 혈관 소실을 모두 예방할 수 있으며, 30분 동안 100마이크로몰 A MPA를 사용한 라미닌 염색 치료로 밝혀진 혈관 손실은 해마의 대부분의 영역에서 광범위한 신경 세포 손실을 유발했지만 혈관 손실은 CA 1 영역에 국한되어 있었습니다. 혈관의 정량화는 CA one 영역의 선택적 손실을 확인합니다.

이 절차에 따라 효과적인 신경 보호제를 식별하고 혈관 리모델링의 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 약물 치료 또는 유전자 변형을 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 배양과 같은 해마 개입을 설정하는 방법과 OGD를 유도한 다음 신경 세포 생존과 혈관 변화를 모두 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.