인간 백혈구 및 혈소판의 분리 및 평가를위한 프로토콜 : 생물 에너지와 산화 버스트

다음 프로토콜에서는 인간 혈액 단핵구, 림프구, 호중구 및 혈소판의 생체 에너지 프로필 및 산화 폭발 반응의 측정을 시연합니다. 이것은 먼저 갓 채취한 혈액에서 담황색 코트와 혈소판이 풍부한 혈장 분획을 수집함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로, 이질적인 백혈구 집단은 밀도 구배에 의해 단핵 및 다핵 세포층으로 분리됩니다.

다음으로, 순수 단핵구 호중구 및 림프구 집단을 최대 분리에 의해 추가로 분리한 다음 세포외 플럭스 또는 XF 분석을 위해 도금합니다. 궁극적으로, 단핵구, 림프구 및 혈소판에서 미토콘드리아 기능의 민감하고 재현 가능한 측정과 단핵구 및 호중구 산소 소비율의 산화 폭발은 XF 기술로 측정할 수 있습니다. 오늘 소개할 기술의 장점은 작은 혈액 샘플로 환자의 혈액에 있는 모든 주요 세포를 준비할 수 있다는 것입니다.

이들은 순수한 불활성화 형태의 혈소판과 백혈구이며 미토콘드리아 기능을 측정합니다. 이를 통해 환자 내부의 다양한 질병과 상태를 실시간으로 반영할 수 있다고 생각합니다. 이 방법은 미토콘드리아 기능에 대한 생활 방식, 식단 및 병리학적 스트레스의 역할과 같은 신진대사와 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 프로토콜은 다양한 백혈구 집단과 혈소판에서 세포 생물 에너지학의 분리 및 측정을 위한 여러 기술을 결합합니다. 프로토콜의 이 단계는 밀도 구배 및 자기 분리를 위해 정밀한 피펫팅이 필요하기 때문에 매우 중요합니다. 또한 분획 중에 세포 집단이 어디에 있는지 알고 있어야 합니다.

24 well extracellular flux analyzer 또는 XF 24에서 말초 혈액 세포의 분리와 세포 생물 에너지학의 분석을 시연할 것입니다. 그러나 이 방법은 절차를 시작하기 최소 2시간 전에 XF 96에서도 수행할 수 있습니다. XF 센서 카트리지 프로브를 XF cran 용액으로 수화합니다.

그런 다음 갓 채취한 전혈을 15분 동안 500배 G와 실온에서 스윙 버킷 로터가 있는 원심분리기에서 회전시킵니다. 전사 피펫을 사용하여 혈장이 적혈구 버피 코트 층 위로 1cm 남을 때까지 혈소판이 풍부한 혈장이 포함된 상층을 제거하고 나중에 처리할 수 있도록 혈장을 실온에 보관합니다. 그런 다음 Buffy coat를 멸균 된 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 백혈구를 24 밀리리터로 희석합니다.

다음으로 기초 RPMI를 사용하여 3 개의 15 밀리리터 원추형 튜브 각각에 3 밀리리터의 저밀도, 불투명 1.077을 추가합니다. 그런 다음 5ml의 좁은 피펫 끝을 각 튜브의 바닥에 놓습니다. 차례로, 천천히 고밀도의 3 밀리리터를 방출, 그의 불투명 한 1.119.

이제 저전력 설정에서 자동 피펫을 사용하여 층을 방해하지 않고 각 그래디언트에 8ml의 희석된 혈액을 조심스럽게 첨가합니다. 모든 그라디언트 레이어의 시각화를 위해 저밀도 그라디언트에 파란색 염료가 추가되었습니다. 별도로 원심분리를 통해 세포를 분리한 후, 다른 세포 띠를 방해하지 않고 멸균 유리 피펫으로 단핵 및 다형성 세포를 수집합니다.

각 튜브의 단핵 및 다형성 세포 집단을 각 세포 유형에 대한 단일 멸균 50ml 원뿔형 튜브에 풀링하고 두 튜브에 4가지 부피의 RPMI를 추가합니다. 스핀다운 후 세포는 펠릿을 1.5ml 튜브로 다시 펠릿으로 옮기고 BSA가 보충된 80마이크로리터의 새로운 RPMI에 재현탁합니다. 그런 다음 anti CD 14 및 anti CD 15 항체로 표시된 20마이크로리터의 마그네틱 비드를 각각 단핵 및 다형성 세포 분획에 추가합니다.

각 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 15분 동안 배양한 다음 각 튜브를 1ml의 R-P-M-I-B-S-A 매체로 세척하고 펠릿을 500마이크로리터의 R-P-M-I-B-S-A에 재현탁합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 개별 R-P-M-I-B-S-A 세척된 LS 컬럼에 적용하고 3ml의 R-P-M-I-B-S-A 배지로 각 컬럼을 3회 세척합니다.세포 현탁액 흐름과 컬럼 세척을 멸균 튜브에 모아 단핵구와 호중구를 분리하고, 최종 세척 후 자기장에서 컬럼을 제거하고, 양성으로 선택된 세포를 5mL의 R-P-M-I-B-S-A 가 있는 멸균 튜브로 용출합니다. 림프구를 분리하기 위해, 세포 컬럼의 플로우 스루 세척 분획을 펠렛화하고, 80 마이크로리터의 R-P-M-I-B-S-A에 세포 펠릿을 재현탁하고, 20 마이크로리터의 CD 61 및 CD 2 35 A 항체에 세포를 섭씨 4도에서 15분 동안 배양합니다.

그런 다음 이전과 같이 최대 분리를 반복하고 림프구를 포함하는 흐름을 수집하여 혈소판, 원심 분리기, 예비 혈소판 풍부 혈장을 분리 한 다음 플라즈마를 제거하고 프로스타글란딘 I 2 밀리리터당 1 마이크로그램이 보충된 5 밀리리터의 멸균 PBS로 세포 펠릿을 한 번 세척하고 혈소판 펠릿을 1 밀리리터의 신선한 PBS 프로스타글란딘 I 2 버퍼에 재현탁하여 분리된 단핵구를 플레이트화하고, 림프구, 호중구, 혈소판. 먼저 세포를 계수하고 XF 분석 배지에서 적절한 부피로 가져와 200마이크로리터 부피에서 웰당 5번째 세포에 2.5배 10의 파종 밀도를 허용합니다. 혈소판용 세포 T로 코팅된 24웰 XF 세포 배양 마이크로플레이트에서 200마이크로리터 부피의 웰당 7개 세포에 2.5배 10회 파종합니다.

세포를 플레이트에 회전시킨 후 XF 배지를 사용하여 최종 웰 부피를 최대 660마이크로리터로 가져오고 XF 분석 전 30분 동안 플레이트를 섭씨 37도에서 배양한 후 배양 부하 중에 75마이크로리터의 분석 시약을 나열된 순서대로 XF 센서 카트리지 주입 포트로 배양합니다. 산화 버스트 측정을 얻어야 하는 경우, 항마이신(antimycin) 후 PMA를 주입할 수 있으며, 다음 주입 포트 로딩은 카트리지를 세포외 플럭스 분석기에 올려 놓고 분석을 시작합니다. 백혈구와 혈소판의 생체 에너지 프로파일은 세포의 실시간 산소 소비량을 비침습적으로 측정하는 seahorse XF 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 측정할 수 있습니다.

각 세포 유형은 표에서 설명한 것처럼 5번의 반복으로 XF 24 마이크로플레이트에 도금됩니다. 분석 중에 측정된 대표적인 기초 및 산화 파열 값과 웰당 평균 단백질 농도는 세포 유형별로 입증되며, 산소 소비율 값은 해당 웰의 총 단백질 함량으로 정규화되고 단백질 마이크로그램당 분당 p moles로 표시됩니다. 그런 다음 기초 산소 소비율은 처음 세 번의 측정에 의해 설정됩니다.

미토콘드리아 A TP 합성효소의 억제제인 올리고 마이신(Oligo mycin)을 XF 배지에 주입하여 TP 합성과 결합된 산소 소비율을 추정하고, 잔류 산소 소비율에서 비미토콘드리아 산소 소비율을 뺀 값이 양성자 누출에 기인할 수 있는 TP와 연결된 것으로 표시된다. uncoupling FCCP를 추가하면 최대 산소 소비율의 측정을 할 수 있으며, 이어서 항마이신 a와 미토콘드리아 호흡 억제제를 주입하여 산소 소비량의 비미토콘드리아 공급원을 측정할 수 있습니다. 예비 용량은 미토콘드리아가 증가된 에너지 수요 하에서 수행할 수 있는 추가 작업량을 측정한 것으로, 단핵구와 호중구의 산화 폭발 용량을 결정하기 위해 최대 호흡 속도와 기저 호흡 속도의 차이로 계산할 수 있습니다.

P-M-A-A-P-K-C 작용제를 주입하고 산소 소비율의 증가는 N-A-D-P-H 산화효소에 의한 산화제 생성과 관련이 있습니다.이 기술을 숙달하면 이 기술은 혈액 채취 후 3시간 이내에 완료할 수 있으며, 제대로 수행되면 분석 자체를 포함하지 않습니다. 이 절차를 시도하는 동안 생물 안전 작업대에서 각 단계를 수행하고 멸균 실온 완충액 및 매체를 사용하여 멸균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 팩스 분석과 같은 다른 프로토콜을 수행하여 세포의 순도, 백혈구의 활성화 상태를 결정하고 백혈구 하위 집단에서 세포 생체 에너지학을 결정할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 이제 혈소판, 림프구, 단핵구 및 호중구를 준비하여 해마에 넣고 이러한 데이터에서 산화 폭발 및 미토콘드리아 기능을 측정하는 방법에 대해 상당히 명확한 아이디어를 얻었을 것입니다. 그런 다음 환자 집단을 분석하고 생체 에너지학이 어떻게 변화하고 있는지 실시간으로 확인할 수 있습니다. 인간 환자 샘플로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

따라서 이 절차를 수행하는 동안 개인 보호 장비를 착용하고 생물 안전 캐비닛을 사용해야 합니다.