Name: 배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-17T16:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 배우세요 배아 마우스 심장에 세포, 염료, DNA를 주사하여 세포 운명을 추적하고 유전자 발현을 조작하는 방법을. 발달 생물학 연구에 필수적인 이 기술은 심장 발달 과정에서 특정 유전자와 세포의 기능을 밝히는 데 활용됩니다.

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저자는 재단 Leducq (승모판)과 직원은 국립가이 연구에 자금을 지원을 위해 라 공들인 (ANR Specistem을 부여)을 부어 인정합니다.

1. 준비 동물 절차 동물 윤리위원회의 승인을 받아야하고 바이러스에 작업에 대한 제도적 지침을 따르 HuESC 및 / 또는 IPSC (해당되는 경우)뿐만 아니라, 마우스 처리, 마우스 배아를 획득, 마우스 수술을 수행. 시간 제한 교배를 들어, 플러그의 날 배아 일 (E) 0.5 / 0.5 일 후 교미 간주됩니다. <ol><li> 미세 주사 바늘 : 전 자궁 미세 주입 들어, 1 또는 10 μm의 내부 팁 직경이 각각 DNA 나 세포를 주입하는 날카로운과 원뿔 곡선 (이차 곡선) 끝 모양을 얻을 수있는 피펫 풀러 / beveller를 사용하여 유리 피펫 (1.2 mm 외부 직경 붕규산 모세관)을 당깁니다. 초음파 매개 주사의 경우, 사용 35분의 50 μm의 외경 / ID의 팁 1.14 mm/0.53 mm의 내부 / 외부 직경 (OD / ID)를 가지고 멸균 바늘을 사용자 정의. </li><li> 실리콘 가득 배양 접시 : 사용 설명서에 설명 된 바와 같이, 실리콘을 준비합니다. 기입~ 1cm의 탄성 중합체 층을 깨끗한 유리 60mm 직경 페트리 접시. 공기 방울을 피하십시오. </li><li> 상품 : 절차를 수행하는 동안 사전에 멸균 모든 수술 도구를 유지합니다. </li><li> DNA 준비 : 하나의 튜브에 3 μg의 DNA 12 ㎕의 옵티-MEM을 추가합니다. 다른 튜브에 3 μL의 리포 펙 타민 2000 년 12 ㎕의 옵티-MEM을 추가합니다. RT에서 5 분 동안 품어 두 솔루션을 섞는다. 즉시 사용합니다. </li><li> 셀 준비 : 10 6 세포 현탁액을 준비 / ML DMEM (둘 베코 이글 중간, 높은 포도당과 50 %의 쥐의 혈청). 최종 세포 현탁액의 50 μl의 8 ~ 10 배아 충분하다. </li><li> 준비 염료 : 25 ㎎ / ㎖ DMSO에 녹색 형광 CDCFDA-SE를 사용합니다. -20 ° C에서 20 μL 씩 분주하고 저장을 준비 멸균 생리 식염수 또는 PBS 사용하기 전에 1:100 / 1:200 희석. </li><li> 바이러스 준비 : ~ 10 10 -10 10 TRA의 역가 상용 제 3 세대 PGK-GFP를 발현하는 렌티 바이러스를 사용단위 / ml의 DMEM을 nsducing. 렌티 바이러스의 준비를 위해, Tiscornia 등 알. (14)는 개인 보호 장비를 착용하고 안전하게 사용과 바이러스 처리를 참조하십시오. </li></ol> 예 생체 내 주입에 대한 E9.5과 E10.5 태아의 2. 컬렉션 <ol><li> 배아 일 9.5 또는 10.5에서 임신 한 쥐를 안락사. </li><li> 70 % 에탄올로, 마우스의 흉부 및 복부를 살균. </li><li> 복부를 열고 PBS의 RT에서 자궁 경적을 검색하고 M16 매체와 실리콘으로 채워진 페트리 접시에 두 PBS 세척 후 전송하는 복부 정중선 절개를합니다. </li><li> 자궁의 혈관 측이 아래쪽이되도록 실리콘 층 곤충 핀 자궁 뿔 핀. </li><li> 표면 아래 1mm에 미세 집게와 자궁의 표면과 탈락의 뚜껑을 잘라. </li><li> 부드럽게 탈락의 벽을 확산하여 난황에서 배아를 검색 할 수 있습니다. </li><li> 37 °에서 배아를 저장; 세포 주입하기 전에 C M16 중간. 주사의 경우, 각 배아는 미리 예열 37 ° C에서 M16 매체로 채워진 실리콘 요리로 전송 </li></ol> 입체 현미경 3. DNA 나 세포 주입 <ol><li> 해밀턴 주사기 뒤쪽에서 유리 피펫을 입력하고 끝에서 거품을 제거하기 위해 피펫을 흔들. </li><li> 미세 주입 홀더에 피펫을 설정; 50 보압 (DNA) 또는 30 (세포) 고전력 증폭기, 300 (세포)에 150 사출 압력 (DNA) 고전력 증폭기를 설정합니다. 0.2 초 (DNA) 또는 0.5 초 (세포)에 주입 시간을 설정합니다. 이러한 설정은 약간 microinjector과 펫의 종류에 따라 다를 수 있습니다. </li><li> 적절한 배아를 건드리지 않고 난황을 통해 실리콘 아래로 배아를 핀. 마음의 영역을보고 그냥이 지역 위의 주머니를 엽니 다. </li><li> 세포 주입하는 동안 움직임을 방지하기 위해 배아 주변에 4 개의 핀을 추가합니다. </li><li> (수동으로 설정) 미세 조작기를 사용하여, slowl다만 (그림 1) 주입하는 마음의 영역 위의 심낭 위 45 °의 각도로 y 위치 피펫 팁. </li><li> 관심 영역에 피펫을 이동하고 주사를 트리거합니다. 가능한 한 빨리 피펫을 가져 가라. 확실히 마음이 제대로 DNA / 세포 주입 후 구타되어 있는지 확인합니다. </li></ol> 4. 배아, 고립 된 마음, 그리고 이식편 문화 <ol><li> 페니실린 / 스트렙토 마이신, 37 ° C에서 미리 예열하고 40 % O 2 산소 보충 25 % M2 매체 75 %의 쥐의 혈청 문화 E9.5의 배아. </li><li> , 25 ㎖ 유리관에 2 ㎖의 배양액을 추가 부드럽게 배아를 추가하고, 튜브에 캡을 나사 결합하기 전에 40 % O 2와 옥시. 회전 또는 (30 회전 / 분)을 흔들어 동안 37 ° C에서 36 시간까지 배양한다. </li><li> 원하는 시점 (예 : 24 시간)에서 첫 번째 드에 의해, 마음을 건드리지 않고, 미세 집게로 조심스럽게 마음을 해부하다배아를 capitating; 마음은 말초 유출 관을 사용하여 잡아 당겨 소비세 쉽다. </li><li> 문화 12 - 웰 플레이트에서 설정 리겔 코팅 인서트 50 % FCS와 DMEM에있는 다른 36 ~ 48 시간 동안 마음입니다. 심장의 문화 (15)의 개선 된 프로토콜에 대한 다이어 &amp; 패터슨 (2013)를 참조하십시오. </li><li> 관심 영역의 이식편을 확인합니다. 예를 들어, 콜라겐 1 형 겔 16에 48 시간의 아트 리오 심실 운하 (AVC)와 문화를 해부하다. </li></ol> 심장 I N 자궁 내 5. 초음파 유도 주사 <ol><li> 초음파 기계 및 microinjector의 설정 : <ol><li> 레일에 40 MHz의 변환기와 미세 주입 설정으로 고해상도 초음파 시스템을 사용합니다. </li><li> 주입 당 69 NL에서 microinjector에 주입 볼륨을 설정합니다. microinjector 프로그래밍을위한 제조 업체의 미세 주입 설명서를 참조하십시오. </li></ol></li><li> microi의 준비njection 설치 및 주입 : <ol><li> microinjector에 유리 마이크로 피펫을 놓습니다. 최대 볼륨까지 흡입에 의해 효율적으로 주입, 첫 번째 코트에게 미네랄 오일과 피펫의 안쪽을 보장합니다. 그 후 바늘 내부에 오일 1 ~ 2 밀리미터를 떠나, 다시 기름을 꺼냅니다. </li><li> 최대 볼륨에 도달 할 때까지 injectate 대기음. 이 끝을 무디게하고 주입을 더욱 어렵게 만들 것으로 바늘 끝으로 모든 표면에 닿지 않도록주의하십시오. </li><li> 주입 동안 배아를 함유 자궁 뿔을 안정, 중앙 컷 소 슬릿을 가진 얇은 실리콘 막에 의해 덮여 중간에 구멍이 변경됨 페트리 접시 (2.5 cm 직경)를 사용하고, 절개 사이트 위에 올려 놓으 . 접시의 가장자리에서 점토의 3-4 덩어리를 배치하여 마우스 처리 테이블에 페트리 접시를 안정. </li></ol></li><li> 주입 절차 : <ol><li> 전에 마취하는 (원하는 배아 단계에서) 임신 한 쥐의 복부를 면도SIA는 머리를 제거합니다. 잔여 머리를 제거하고 70 % 에탄올로 소독 화학 제모 제와 복부를 처리합니다. </li><li> 얼굴에 마스크를 통해 산소 / 이소 플루 란과 임신 마우스를 마취. 절차의 나머지 기간 동안 1.5 % 다음에 초기 마취, 100 % 산소에 3 ~ 5 %의 이소 플루 란을 사용합니다. 마우스가 충분히 부드럽게 발 및 / 또는 꼬리를 집어 마취되어 있는지 확인합니다. </li><li> (37 ° C에서 가열로 설정) 마우스 처리 테이블에 마우스 부정사를 놓고 각막의 탈수를 방지하기 위해 윤활제와 눈을 포함한다. </li><li> 전극에 전극 젤을 적용 및 심박수, 호흡 수, 및 ECG를 모니터링 전극에 발을 테이프. 몸의 온도를 모니터링하기 위해 직장 온도계를 배치합니다. </li><li> 먼저 마우스를 시각화 및 초음파에 의해 배아를 계산하여 임신인지 확인합니다. 복부 초음파 젤을 적용하고 방광 위의 스캔 헤드를 놓습니다. 일관성을 위해, 우선 방광을 시각화방광의 위치에서 시작하여 왼쪽에있는 배아과 오른쪽 자궁 뿔을 계산합니다. 배아 마음이 정상적으로 박동되어 있는지 확인합니다. </li><li> 마우스가 임신 한 경우, 점토와 미래 절개 위의 페트리 접시를 놓습니다. 요리는 직접 접촉되도록 약간 복부에 접시를 누릅니다. </li><li> 접시를 제거하고 다시 복부를 소독. 복부 및 복막을 열고, 약 0.75-1 cm 질보다, 1.5 cm 복부 정중선 절개를합니다. 내부 장기에 손상을 피하십시오. </li><li> 집게로 왼쪽 또는 오른쪽 자궁 경적을 외면 화하다, 부드럽게 요리의 실리콘 멤브레인을 당겨, 다시 점토의 요리를 안정. 방지 광범위이 자궁 혈관과 여성 및 / 또는 배아의 조기 사망의 출혈을 일으킬 수 있기 때문에, 잡아 당기거나 조작. </li><li> 배아 주입 된 적절한 기록 유지를 보장하기 위해 다시 배아를 계산합니다. </li><li> U에 초음파 젤을 적용이미지 terine 뿔 마음과 탈수를 방지하기 위해. </li><li> 이미지 최초의 배아를 주입 할 수 있습니다. 배아 심장의 정상적인 박동을 확인하고 태아의 꼬리 - 두개골과 좌우 방향의 기록을 유지. 필요한 경우, 올바른 방향을 확인하기 위해 약간 자궁 뿔의 위치를​​ 변경. 이 어려운 증명하는 경우, 다음 배아로 이동합니다. </li><li> 약간 (그림 3) 심낭의 외부 배아 위의 45 ° 각도로 바늘의 위치를 미세 주사 바늘로 조심스럽게 자궁에 구멍을. 이 아트 리오 심실 홈 (그림 3)을 향해 가리 키도록 심 외막 세포의 표지를 들어, 이미지 네 개의 챔버보기 마음과 바늘을 위치. 각도를 조정해야하는 경우, 바늘을 빼, 및 재배치. 이 바늘을 깰 수 있으므로, 자궁 안쪽에 바늘의 각도를 조정하지 마십시오. 이러한 사지 또는 태반 등의 조직을 천공하지 마십시오. </li><li> 바늘을 이동심낭 벽에 상냥한,하지만 빠른 움직임으로 찔린. 일반적으로, 거기에 약간의 저항이 될 것입니다,하지만 너무 빨리 바늘을 이동하는 바늘 끝은 심장 자체에 구멍을 발생할 수 있습니다. 팁 아트 리오 심실 홈의 심낭 공간에서 생을 마감한다. 심막 출혈의 경우에, 혈액 세포는 흰 눈 형상 패턴으로 표시 될 것이다. 이 경우, 배아를 주입을 중지하고 다른 배아로 이동. </li><li> injectate을 주입한다. 하트 개발에 대한 악영향을 방지하기 위해 심막 공간으로 극대 700 NL 주입한다. 심낭의 약간의 시간적인 부종에 의해 적절한 주사를 모니터링합니다. </li><li> 주입 후, 밖으로 바늘을 뽑아 injectate 여전히 바늘이 조직의 조각에 의해 막힌되지 않았 음을 확인하기 위해 배출 될 수 있음을 확인. </li><li> 이미지 처리 테이블의 위치를​​ 변경하고 다음 배아를 주입. 방지하기 위해 (한 자궁 경적에) 3-4을 최대로하기 위해 주입 된 배아의 수를 유지대향 자궁 경적 제어 배아를 허용하고, 절차가 배아 발달을 방해하지 않았 음을 보장하기 위해 마취를 확장했다. </li><li> 배아의 원하는 번호를 주입 한 후, 여분의 초음파 젤을 제거하고 부드럽게 적절한 위치에 복부에 다시​​ 자궁 경적을 배치합니다. </li><li> 하나의 복막과 복부 근육 봉합 층, 피부에 대한 봉합의 두 번째 레이어를 사용하여 산모의 복부를 닫습니다. </li><li> 진통제의 첫 번째 복용량으로 마우스를 주입한다. 전에 12 시간 간격으로 마취와 세 개의 추가 주사를 끝으로 0.05 ~ 0.1 ㎎ / ㎏ 프레 놀핀 15 분 중 하나 주사를 사용합니다. </li><li> 마취를 중단하고 프로 시저의 적절한 복구를 위해 마우스를 모니터링 할 수 있습니다. 주택의 후속 원하는 기간에 대한 개별 케이지에 임신 한 마우스. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

위에서 설명한 내 심장 생체 주입 프로토콜은 중간 단계 (E9.5 - E11.5) 마우스 배아에서 최소 48 시간 동안 심근 기능을 보존하도록 설계되어 있습니다. 이러한 주입 방법은 DNA 나 세포의 공간적 대상으로 주입 할 수 있습니다. 그림 1-3에 나와있는 몇 가지 예는 생체와 같은 내막 또는 심 외막 세포의 EMT으로 제한된 심장 지역에서 개최 발달 과정의 생체 분자 메커니즘에 윤곽을위한 개념 증명을 제공합니다. 가장 중요한 것은, 이러한 프로토콜은 적절한 배아 환경, 지금까지 충족되지 않은 문제에서 인간의 배아 세포 또는 huESC 유도체 주입 세포의 이동과 운명을 수행 할 수있는 기회를 제공합니다.에서 포화와 (그림 3의 심 외막 세포 등) 생체 표지 또는 염료 또는 바이러스의 희석을 제한하는 것은 단기뿐만 아니라 장기적 B의 셀 (하위) 인구의 혈통 추적 가능...

이상 10 년 전 인간 배아 줄기 세포 (HuESCs)는 인간 배반포 1에서 파생되었다. 그 후,이 세포는 인간의 발달 생물학의 충족 문제를 해결 연구의 중요한 분야의 대상이되고있다. HuESCs는 또한 재생 의료에의 희망을 제공하고 있습니다. 최근 몇 년 동안, 인간 유도 만능 줄기 세포 (유도 만능)은 유전 질환 2의 모델을 제공하고, 환자 맞춤형 체세포에서 생성 된. 심장 계통 3를 포함한 다양한 세포 계통,으로 배아 또는 유도 만능 줄기 세포의 분화에 대한 시험 관내 프로토콜에 많은 사람들이보고되고있다. 분화 된 세포는 종종 RNA 및 단백질 발현, 면역 염색, 및 / 또는 기능 시험 관내에서의 분석에 의하여 phenotyped된다. 그러나, 다 능성 줄기 세포 유도체들은​​ 완전히 CEL 취득 여부를 테스트하기 위해 적절한 배아 환경에 배치 될 필요L의 자신의 배아 대응의 운명과 그들이 지역 신호에 대한 응답으로 정품 생체 기능을 요점을 되풀이할지 여부. 조직 공학이 유망하지만, 아직 미발달 티슈 4,5 개발되어 생체 내에서 적절한 모든 알려진 알려지지 단서를 제공하지 않는다. 마우스 배아 등의 배아에있는 염료 또는 레트로 바이러스 벡터와 셀 라벨은 심장 개발 6시 세포 계통의 배아 출처에 중요한 정보를 가져왔다. 예를 들어, 고립 된 마음의 체외 배양 한 다음 생체 마우스 태아의 심장 막 공간에 주입 염료는 심 외막 세포와 그 후손 7 레이블로 사용되었다. 그러나, 염료 및 레트로 바이러스 셀 라벨은 대부분 8 더 쉽게 접근 할 수있다 여전히 제대로 개발 기관, 또는 닭의 배아와 초기 마우스 배아에 적용되었습니다. 예외가 전자의 대상으로 쉽게 뇌입니다mbryos 9,10. 이러한 접근 방식은 아직 구타 배아 마우스의 심장에 적용되지 않았습니다. 염료 또는 바이러스에 직접 라벨을 보완하기 위해보다 고급 단계의 마우스 배아와 성인 마우스의 추적 혈통을 수행하는 셀 라벨 접근 방식은 크레 / 훈제 연어 기술을 이용하여 형질 전환 생쥐의 분석과 결합되어 있습니다. 크레 / 훈제 연어 방법 (11)는 그러나 재조합 효소의 발현을 구동하는 데 사용되는 게놈 규제 지역의 시공간 특이성, 그리고 크레 / 훈제 연어 재조합 (12)의 효율성으로 인해 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 그것은 단지 크레 식을 구동하는 데 사용 규제 지역의 활성화 후 전구체에 레이블을 지정할 수 있습니다 더욱이,이 방법은 완벽하게 세포 운명의 세포 이동 구동 인수의 특정 문제를 해결하지 않습니다. 또한 분명한 윤리적 인 문제에 대해 인간 배아에 적용 할 수 없습니다. 이러한 제한을 감안할 때, 우리는 새로운 P 시리즈를 디자인의 대상 지역에서 같은 형광 염료, 바이러스 등 shRNAs와 DNA 기반의 셀 라벨 벡터로 유전자 발현 조절 자, 또는 E9.5 개발 이후 단계에서 마우스 배아에서 세포와 같은 세포 라벨링 에이전트의 다양한 주입하는 rotocols 마음. DNA / 세포 주사는 입체 현미경과 48 시간, 또는 48 ~ 72 시간 동안 고립 된 심장이나 배아 이식편 문화까지 생체 배아 문화와 함께 간단한 미세 주입 장치를 사용합니다. 우리는 또한 자궁에 배아의 마음 초음파 매개 미세 주입 프로토콜을보고합니다.이 기술은 배아 (13)의 개발을 모니터링 할 수 있으며 injectates 및 / 또는 표지 세포의 장기 추적 관찰 할 수 있습니다. 우리는 이러한 접근 방식은 장기의 기능을 보존하고 줄기 세포의 잠재력을 시험 관내 시험보다 더 대표적인 환경을 제공하는 것으로 나타났습니다. 또한, 마이그레이션을 수행 할 수있는 기회를 제공한다자신의 운명을 모니터링하는 세포를 표시 및 / 또는 주입. 궁극적으로, 이것은 지역 티슈 패터닝 및 주요 생물학적 과정의 더 나은 이해를 수득한다.

<table><tbody><tr><td>Setups/하드웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 MHz 변환기</td><td>VisualSonics</td><td>MS550S</td><td></td></tr><tr><td>마이크로인젝터</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로인젝터</td><td>Eppendorf</td><td>5242</td><td></td></tr><tr><td>마이크로매니퓰레이터&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5171</td><td></td></tr> 인큐베이터 레일 <tr><td>시스템</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>로테이터</td><td></td><td></td>를 가압하는 데 필요한 질소 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 인큐베이터 내부 배아와 함께 유리관을 회전시키기 위해 표준 <tr><td>인큐베이터</td><td></td><td></td><td>5% CO2, 37 &#176; C</td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Zeiss</td><td>Discovery. V8</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100</td><td>VisualSonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microinjection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate capillary tubes</td><td>세계 정밀 기기</td><td>KTW-120-6</td><td>1.2-&mu; m 외경</td></tr><tr><td>피펫 풀러</td><td>Sutter</td><td>모델 P87</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection 바늘</td><td>Origio-Humagen</td><td>C060609</td><td>OD/ID 1.14 mm/53 mm, 50/35 &mu; m OD/ID 팁</td></tr><tr><td>해밀턴 주사기&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td></td><td></td><td>10cm 지름</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 막</td><td>Visualsonics</td><td></td><td>4.3 x 4.3 cm</td></tr><tr><td>Play-Doh</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet One</td><td></td><td></td></tr><tr><td>제모제&nbsp;</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eye lubricant</td><td>Optixcare</td><td>31779</td><td></td></tr><tr><td>전극 젤 (Signa)</td><td>Parker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>Sofsilk 5-0</td><td>S1173</td><td></td></tr><tr><td>초음파 젤</td><td>Aquasonic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride)</td><td>Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td>식염수 0.05-0.1 mg / kg</td></tr> <tr><td>< 강> / 강><</td><td></td><td></td><td></td></tr> / <tr><td>실리콘 엘라스토머</td><td>다우 코닝</td><td>실가드 184</td><td></td></tr><tr><td>유리 페트리쉬</td><td>정밀 과학 도구</td><td></td><td>직경 60mm</td></tr><tr><td>곤충 핀</td><td>정밀 과학 도구</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>< 강>미디어 및 배양 시약< / 강> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optimem medium</td><td>Life Technologies</td><td>51985026</td><td></td></tr><tr><td>M2 미디엄</td><td>시그마</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium</td><td>Lonza</td><td>BE12-640F</td><td>고포도당 및 50% 쥐 혈청</td></tr><tr><td>M16 매체</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>쥐 혈청</td><td>Janvier</td><td>ODI 7158</td><td></td></tr><tr><td>Pennicilin/streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-12</td><td></td></tr><tr><td>산소 40%</td>배<td>아 배양 배지에 산소를 공급하는 데 필요한</td> <td>공기 액체</td><td></td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>Fisher</td><td>RVJ35882</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 유형 I</td><td>BD</td><td>354236</td><td>외식 배양 배</td></tr>양 접시 <tr><td></td><td>Dutcher /Orange</td><td>131020</td><td></td></tr><tr><td>Injectates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDCFDA-SE</td><td>Invitrogen/Molecular Probes</td><td>C1165</td><td>25 mg/ml DMSO. -20 &#176;C에 보관하십시오. 사용하기 전에 식염수에 1:100-200을 희석하십시오.</td></tr><tr><td>PGK-GFP 발현 렌티바이러스&nbsp;</td><td></td><td></td><td>~8E9 형질전환 단위/ml DMEM</td></tr><tr><td>리포펙타민 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668019</td><td></td></tr></tbody></table>

배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

체외 프로토콜 배아 또는 다 능성 줄기 세포 - 파생 상품의 운명을 테스트하는 것은 반드시 자신의 생체 내 가능성을 반영하지 않습니다 논쟁의 결과로되었다. 바람직하게는, 이러한 세포는 확정적 표현형을 획득하기 위해 적절한 배아 환경에 배치되어야한다. 또한, 염료 또는 레트로 바이러스 벡터에 세포를 라벨링 한 후 마우스의 연구를 추적 세포의 혈통은 여전히​​ 저조한 개발 기관과 함께 초기 단계의 마우스 배아에 주로 제한 남아있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 E9.5 개발 이후 단계에서 마우스 배아에서 심장의 대상 지역에서 다양한 제를 주입하는 표준 및 초음파 매개 미세 주입 프로토콜을 설계. 배아의 체외 이식편 또는 배아는 다음 배양 또는 추가 자궁 내에 개발하기 위해 왼쪽으로 수 있습니다. 이러한 에이전트는 형광 염료, 바이러스, shRNAs, 또는 세포 유래 전구 세포를 줄기 있습니다. 우리의 접근 방식은 쿵푸의 보존을 허용기관의 nction 마이그레이션 및 표시 및 / 또는 주입 된 세포의 운명을 모니터링하면서. 이러한 기술은 다른 장기로 확장 할 수 있으며, 개발 생물학의 주요 생물학적 문제를 해결하는 것은 매우 도움이 될 것입니다.

상기 주입 프로토콜을 사용하여, 세포를 표지 및 / 또는 마우스 배아 심장에 주입 될 수있다. 개념의 증거로 몇 가지 예는 주입 프로토콜과 생체 AVC 이식편, 고립 된 심장, 또는 전체 배아 문화 (그림 1) 결합 된 표시됩니다. 도 1은 세포 주입 전의 배아의 제조를 나타낸다. 난황 (그림 1A)의 무결성을 유지하면서 E9.5의 배아의 탈락에서 제거됩니다. 난황은 바로 마음 (그림 1B) 위에 열립니다. 피펫은 (도 1C)에 접근하고 세포가 주입된다. 마음은 그것의 모양 (그림 1D)를 유지하고 구타 남아있다. 이러한 전이 (EMT)를 중간 엽하는 상피 세포로 발달 생물학에서 더 구체적인 생물학적 문제를 해결하기 위해 E9.5...

우리는 (E) 9.5 및 이후 단계 배아 일에 마우스 배아 내의 배아 또는 다 능성 세포로부터 유래 된 내인성 및 그래프트 세포의 세포 운명 및 표현형 모두를 모니터하기 위해, 염료를 주입하는 DNA 벡터, 바이러스, 세포를 일련의 방법을 설명 개발.

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

본 절차의 전반적인 목적은 배아 생쥐 심장에 세포, 염료 또는 DNA를 주입하는 것입니다. 세포의 이동을 조사하거나 유전자 발현을 국소적으로 조작하기 위해, 먼저 임신한 생쥐에서 배아를 적출하여 배아 심장을 노출시킵니다. 그다음 심장의 표적 관심 영역에 DNA, 염료 또는 세포를 주입합니다.그 후 배아를 배양한 다음, 심장을 적출하여 배양액에 넣습니다. 마지막으로, 주입되었거나 표지된 세포의 운명을 현미경으로 관찰하여 결정합니다. 궁극적으로, 주입, 표지 또는 유전적으로 변형된 세포의 운명을 공초점 현미경이나 광학 및 에피 형광 현미경으로 모니터링하여 심장 발달 과정 중 특정 유전자와 세포의 기능적 중요성을 밝혀냅니다.마우스 형질전환과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 실험실에서 배양하거나 유전적으로 변형시킨 세포를 생체 내(in vivo)에 국소적으로 정밀하게 주입할 수 있다는 점입니다. 이를 통해 적절한 환경 내에서 해당 세포들을 조사할 수 있습니다. 본 절차의 시연은 저와 실험실의 박사 과정 학생인 Emily aar이 진행하겠습니다.텍스트 프로토콜에 따라 장비, 시약 및 용액을 준비한 후, 안락사시킨 임신 마우스로부터 E 9.5 및 E 10.5 배아를 수집합니다. 먼저 70% ethanol을 사용하여 가슴 부위를 소독하고, 복부 정중앙을 절개하여 복강을 연 뒤 자궁각을 회수하여 상온의 PBS로 옮깁니다. PBS로 두 번 더 세척한 후, 실리콘이 채워진 페트리 접시로 옮깁니다. M 16 배지를 사용하여, 자궁의 혈관 분포 면이 아래로 가도록 곤충 핀으로 자궁각을 실리콘 층에 고정합니다.그런 다음 미세 핀셋을 사용하여 자궁 표면을 절개하고 표면에서 1 mm 아래 지점에서 탈락막을 캡핑합니다. 탈락막 벽을 펼치고 난황낭 내의 배아를 조심스럽게 회수합니다. 세포 주입을 수행하기 전, 배아를 37 °C의 M 16 배지에 보관합니다.먼저, Hamilton 시린지를 사용하여 유리 피펫의 뒷부분부터 DNA 또는 세포를 채우고, 피펫을 흔들어 기포를 제거합니다. 피펫의 팁 부분을 미세주입 홀더에 고정하고, 다음 설정에 따라 주입기를 설정합니다. 그다음, 배아 본체에 닿지 않도록 주의하며 난황낭을 통해 실리콘 바닥에 배아를 고정합니다.그런 다음 심장 부위를 확인하고 해당 부위 바로 위의 주머니를 절개합니다. 세포 주입 중 움직임을 방지하기 위해 배아 주변에 핀 4개를 꽂습니다. 수동으로 설정된 마이크로

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 문서는 배아 피부와 thymus 혈관을 라벨에 대한 방법을 설명합니다.

배아 마우스에 Vasculature을 라벨링하는 방법

마우스 발달 연구는 임신 기간 동안 태아의 어려움에 의해 방해된다. 임신의 후반 단계에서 배아 심장의 장기 문화를 촉진하기 위해, 우리는 절제 마음이 반 고체, 희석 리겔에 배양되는 프로토콜을 개발했다.

소설<em&gt; 생체</em배아 마우스 사랑을&gt; 문화 방법

이 원고는 발달 중인 혈관 구조를 시각화하는 기술을 설명합니다. 여기에서는 자궁 내 심장 내 FITC 표지 토마토 렉틴 미세주입을 마우스 배아에 활용했습니다. 이 기술을 사용하여 배아 신장 전체에 걸쳐 관류된 혈관과 관류되지 않은 혈관을 설명합니다.

마우스 배아의 자궁 내 인트라 심장 토마토 렉틴 주사에서 신장 혈류를 측정하기 위해

선천성 심장 결함으로 이어지는 돌연변이는 발달 중 심장 구조에 대한 생체 내 조사의 이점을 얻지만, 마우스 배아 심장에 대한 고해상도 구조 연구는 기술적으로 어렵습니다. 여기에서는 발달 중인 마우스 심장의 심근세포 특이적 구조를 평가하기 위한 강력한 면역형광 및 이미지 분석 방법을 제시합니다.

배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

우리는 온전한 배아 및 출생 후 심장 내부 깊숙한 곳에서 형광 단백질로 표지된 세포를 체적 측정으로 이미지화하는 프로토콜을 설명합니다. 전체 산 염색과 함께 조직 제거 방법을 사용하면 배아 또는 출생 후 심장 내부의 단일 형광 단백질 표지 세포를 명확하고 정확하게 이미지화할 수 있습니다.

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

여기, 우리는 전체 마운트 면역 형광 검사 및 초기 단계 마우스 배아의 양적 volumetric 분석 이미지 기반에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 질적 및 양적 개발, 심장 구조를 평가 하 고 다른 기관 체계에 광범위 하 게 적응할 수 있을 수 있습니다 제안에 대 한 강력한 접근으로이 방법을 제시.

마우스 배아에서 심장 조상 인구의 양적 전체 마운트 면역 형광 분석

이 방법에서는, 배아 심장 조직 microdissected, 해리, 붙일 레이블 및 호스트 배아 조직으로 이식 수술이 있습니다. 이 개인 또는 조직 수준 발달 조직 아래 소성 hemodynamic 조건 및/또는 변경된 paracrine/juxtacrine 환경 공부를 위한 플랫폼을 제공 합니다.

조류 배아 배아 Cardiomyocytes의 생체 내 주입에 대 한 microinjection 기반 시스템

우리는 프로토콜 검사 실의 특정 MLC-2v-tdTomato 기자 노크에 쥐에서 해 부 마우스 배아에 전체 마운트 epifluorescent 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 심장 개발을 제시. 이 방법을 직접 노동 집약적인 조직화 학적인 방법 없이 마우스 심장 개발 하는 동안 심 실 형성의 각 단계를 시각화 수 있습니다.

전체 산 Epifluorescence를 사용 하 여 마우스 Embryogenesis 동안 심장 챔버의 분석

생쥐의 심근 경색 부위 주변의 초음파 유도 세포 전달은 안전하고 효과적이며 편리한 세포 이식 방법입니다.

심근 경색 마우스에서 초음파 유도 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 이식

우리는 심장 전구 세포의 3D + 시간 이미징을 가능하게 하는 마우스 배아 배양 및 이미징을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 비디오 툴킷은 텍스트 전용 출판물에서 얻기 어려운 성공적인 라이브 이미징에 필요한 핵심 기술을 다룹니다.

생쥐 배아에서 초기 심장 전구체의 생생한 영상

이 프로토콜은 발달 중인 마우스 심장에서 심장 세포의 전기천공법 기반 형질전환(transgenesis)을 위한 상세한 방법론적 프레임워크를 제시합니다. 여기에 제공된 비디오 자산은 이 다재다능한 기술을 쉽게 배울 수 있습니다.

마우스 배아 심장에서 유전자 전달을 위한 효율적인 transgenesis 접근법

배우세요 배아 마우스 심장에 세포, 염료, DNA를 주사하여 세포 운명을 추적하고 유전자 발현을 조작하는 방법을. 발달 생물학 연구에 필수적인 이 기술은 심장 발달 과정에서 특정 유전자와 세포의 기능을 밝히는 데 활용됩니다.

배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출

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