배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출

이 절차의 전반적인 목표는 배아 마우스 심장에서 세포 사체 또는 DNA를 주입하는 것입니다. 세포 지방을 조사하거나 유전자 발현을 국소적으로 조작하기 위해 먼저 임신한 쥐의 배아를 해부하고 배아 심장을 노출시킴으로써 이를 수행합니다. 다음으로 DNA 염료 또는 세포를 심장의 표적 관심 영역에 주입합니다.

그런 다음 배아를 배양한 후 심장을 제거하고 배양합니다. 마지막으로, 주입 또는 표지된 세포의 운명은 현미경 검사를 통해 결정됩니다. 궁극적으로, 주입, 표지 또는 유전자 변형 세포의 운명은 컨포칼 현미경 또는 광 및 에피 형광 현미경으로 모니터링되어 심장 발달 중 특정 유전자 및 세포의 기능적 중요성을 밝힙니다.

생쥐의 형질전환(transgenesis)과 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 생체 내에서 실험실에서 세포를 국부적으로 정확하게 주입하거나 유전적으로 변형할 수 있다는 것입니다. 이를 통해 적절한 환경에서 이 세포를 조사할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 저와 실험실의 박사 과정 학생인 Emily aar가 시연할 것입니다.

장비, 시약 및 용액을 준비한 후 텍스트 프로토콜에 따라 먼저 70% 에탄올을 사용하여 흉부를 살균하여 안락사된 임산부에서 E 9.5 및 E 10.5 배아를 채취하고, 복부를 절개하여 복부를 열고 자궁 뿔을 채취한 후 실온 PBS로 이식합니다. PBS를 두 번 더 씻은 후 실리콘으로 채워진 페트리 접시에 옮깁니다. M 16 배지를 사용하면 곤충 핀을 사용하여 자궁 뿔을 실리콘 층에 고정하여 자궁의 혈관화된 쪽이 아래에 오도록 합니다.

그런 다음 가는 집게를 사용하여 자궁 표면을 자르고 표면 아래 1mm에서 낙엽을 덮습니다. decidua의 벽을 펼치고 노른자 자루에서 배아를 부드럽게 꺼냅니다. 주사를 수행하기 위해 세포 주입 전에 섭씨 37도의 M 16, 매체에 보관하십시오.

먼저 Hamilton 주사기를 사용하여 뒤쪽의 유리 피펫에 DNA 또는 세포를 채우고 피펫을 흔들어 기포를 제거합니다. 끝에서 피펫을 마이크로 주입 홀더에 놓고 다음 설정에 따라 주입기를 설정합니다. 다음으로, 배아를 적절하게 건드리지 않고 난황 자루를 통해 실리콘 바닥에 배아를 고정합니다.

그런 다음 심장 부위를 확인하고 이 부위 바로 위에 있는 자루를 엽니다. 세포 주입 중 움직임을 방지하기 위해 배아 주위에 4개의 핀을 추가합니다. 수동으로 설정된 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 피펫 팁을 주사할 심장 부위 바로 위인 심낭 위 45도 각도로 천천히 배치합니다.

피펫을 관심 영역으로 이동하고 주입을 트리거한 다음 가능한 한 빨리 피펫을 꺼냅니다. DNA 또는 세포 주입 후 심장이 제대로 박동하고 있는지 확인하십시오 이 비디오에 설명된 주입 프로토콜을 사용하여 상피에서 중간엽으로의 전이 및 E 9.5 A VC 엑스플랜에 심내피 세포의 내피 중간엽 전이에 필요한 단백질을 하향 조절하는 S-H-R-N-A를 주입했습니다. 대조 배아에는 빈 골격 벡터를 주입하고, 마찬가지로, SOX nine 프로모터의 제어하에 GFP를 발현하는 HUES 세포 유래 내피 전 판막 세포를 E 10.5에서 A VC에 주입한 후 48시간 동안 심장 배양을 이식했습니다.

이 세포는 내인성 심내막 세포와 유사한 페리오스틴(periostin)과 같은 EMT 마커를 획득합니다. 여기에서 입증된 생체 외 접근법은 비교적 쉽지만 최대 48-72시간의 단기 추적 관찰로 제한됩니다. 그러나 텍스트 프로토콜에 설명된 초음파 유도 주사 절차는 기술적으로 더 어려운 접근 방식을 제공하지만 자궁 내 산후 장시간 추적 관찰 옵션이 있습니다.

특정 심장 부위의 세포를 라벨링하기 위한 염료 또는 바이러스 벡터의 자궁 내 주입이 여기에 나와 있습니다. 이 방법을 사용하면 형광 염료 또는 바이러스로 심외막 세포의 특정 표지를 달성할 수 있으며 이 방법을 세포 또는 대체 주사제로 확장할 수 있습니다. 이 절차에 따라 유전자, 분자의 장기적인 영향 또는 발달 후 조직 형태 형성과 같은 긴 목록 판독과 같은 추가 질문에 답하기 위해 bryo culture와 같은 방법을 수행할 수 있습니다.

이 기술은 심장 발달 생물학 및 유전학 분야의 연구자를 위한 길을 열었습니다. 이를 통해 우리는 새로운 유전자의 세계를 탐험할 수 있을 뿐만 아니라 적절한 배아 맥락에서 인간 세포의 운명을 조사할 수 있습니다. 이는 형질전환 마우스 라인을 사용할 수 없는 경우에 매우 유용합니다.