말림 분석 : CNS 식세포와 신경 세포 사이의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜

이 절차의 전반적인 목표는 미세아교세포에 의한 시냅스전 입력의 삼킴을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이것은 먼저 형광 전방 등급 추적자를 눈에 주입하여 측면 genant nucleus에서 망막 신경절 세포 시냅스 전 입력을 표시함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 뇌를 해부하고, 고정하고, 평형을 이루는 것이다.

다음으로, 뇌를 절단합니다. 마지막 단계는 이미징 및 분석을 위해 커버 립에 뇌 섹션을 장착하는 것입니다. 궁극적으로, 컨포칼 현미경은 미세아교세포에 의한 시냅스전 입력의 삼킴을 평가하는 데 사용됩니다.

이 방법은 식세포 토양이 시냅스 회로 가소성 및 리모델링에 어떻게 기여하는지와 같은 신경 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 건강한 뇌의 시냅스 회로 리모델링에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 신경계 질환 중 시냅스 회로 리모델링과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 기술자인 크리스 헬러(Chris Heller)와 스티븐스 연구소(Stevens Laboratory)의 대학원생인 에밀리 레이먼(Emily Laman)이 시연을 할 예정이다.

플렉시글라스 유도 챔버에서 4%ISO 불소가 함유된 마우스를 마취하여 이 절차를 시작합니다. 1-3분 후 꼬리를 꼬집어 적절한 수준의 마취가 이루어졌는지 확인합니다. 그런 다음 실체 현미경 아래에 마우스를 옆으로 눕히고 위로 3-4%ISO 불소를 전달하는 노즈 콘을 놓습니다.

공막을 드러내려면 작은 용수철 가위를 사용하여 눈꺼풀을 열고 피부를 뒤로 당깁니다. 신생아의 경우, 때때로 눈가에 또 다른 수직 절개가 필요합니다. 눈꺼풀의 모서리를 자를 때는 혈관이 있으므로 주의하세요.

멸균 30.5 게이지 바늘을 사용하여 공막이 시작되는 눈 옆의 작은 구멍을 뚫습니다. 경사가 눈에 들어갈 수 있을 만큼만 바늘을 삽입하여 렌즈가 손상되지 않도록 주의하십시오. 유리체가 구멍에서 흘러나오도록 하고 멸균 절단 및 팁이 있는 어플리케이터를 사용하여 액체를 흡수합니다.

유리체가 구멍에서 흘러나오는 것을 멈추면 전방 등급 추적이 사전 로드된 Hamilton 주사기에 부착된 뭉툭한 바늘을 천천히 삽입합니다. 구멍에 염료를 넣고 천천히 눈에 염료를 주입합니다. 일반적으로 Alexa 5 94, 6 47 또는 4 88에 접합된 콜레라 독소 베타 소단위는 전방 등급에 사용됩니다.

늦은 추적 R GC 입력 바늘을 구멍에 몇 초 동안 그대로 두었다가 천천히 제거합니다. 솜 끝이 있는 어플리케이터를 사용하여 과도한 액체를 흡수하고 염료가 누출되는 것을 방지하십시오. 그런 다음 소량의 항생제 연고를 눈에 바릅니다.

수술로 눈을 연 경우. 주사 후 눈꺼풀을 부드럽게 재배치합니다. 마취에서 회복되기 시작할 때까지 마우스를 열 아래 그대로 두십시오.amp 또는 열 패드 위에 두십시오.

마우스를 깨끗한 가정용 케이지로 되돌리고 서식지로 되돌리기 전에 완전히 깨어 있는지 모니터링하십시오. 주사 후 약 24시간 후에 마우스를 희생하고 뇌를 해부합니다. 다음날 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 4%PFA로 채워진 팔콘 튜브에 뇌를 고정합니다.

먼저 뇌와 PFA를 빈 유청 보트에 부어 PBS에서 뇌를 세 번 헹구고 주걱을 사용하여 뇌를 PBS로 채워진 다른 유청 보트로 옮깁니다. PBS에서 뇌를 두 번 더 씻은 후 30% 자당 용액으로 채워진 Falcon 튜브로 옮깁니다. 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 섭씨 4도의 자당에 그대로 두십시오.

그런 다음 면도날로 필요하지 않은 뇌 부분을 제거한다. 드라이아이스 위의 알루미늄 호일 조각에 뇌를 얼립니다. 그 동안 마이크로톰 단계를 동결하고 24웰 플레이트의 각 웰에 0.1몰 PP 반 밀리리터를 채워 동결 단계에 얼어붙은 뇌를 장착합니다.

스테이지에 소량의 OCT를 적용합니다. OCT가 얼기 시작하면 뇌를 그 안에 눕힙니다. 절단할 뇌의 한 쪽이 위를 향해야 합니다.

다음으로, 아주 곱게 으깬 드라이 아이스로 뇌와 OCT를 덮습니다. 드라이아이스를 뇌에 약 30초 동안 그대로 둔다. 그런 다음 큰 페인트 브러시를 사용하여 드라이 아이스를 제거합니다.

40미크론 두께로 슬라이스를 절단하기 시작합니다. 그런 다음 작고 촉촉한 페인트 브러시를 사용하여 블레이드에서 관심 영역이 포함된 섹션을 제거하고 0.1몰 pb를 포함하는 24웰 플레이트로 옮깁니다. 절편이 수집되면 형광 해부 현미경으로 전방 등급 라벨링을 시각화하고 관심 영역이 포함된 절편을 선택하여 슬라이드에 절편을 장착합니다.

먼저 0.1몰 PB의 작은 풀을 하전 현미경에 적용합니다. 다음으로 밀어 조직 섹션을 pb 풀로 옮깁니다. 그런 다음 붓을 사용하여 조직의 방향을 잡고 펼칩니다.

Kim 와이프를 사용하여 XSPB를 wickerly하고 섹션이 wicked되지 않도록 주의하십시오. 공기 중에서 완전히 건조시키십시오. 그런 다음 각 섹션에 장착 매체를 작게 떨어뜨리고 끝 부분에 커버 슬립을 장착합니다.

매니큐어로 슬라이드의 가장자리를 밀봉하십시오. 이미징 세션이 표시될 때까지 슬라이드를 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 다음은 전방 등급 추적 전략의 개략도입니다.

좌안 및 우안 망막 신경절 세포 입력은 각각 CTB 6 47 및 CTB 5 94로 추적됩니다. 입력의 미세아교세포 매개 삼킴은 이후에 평가됩니다. 다음은 왼쪽 및 오른쪽 눈 입력의 교차 추적에 따른 출생 후 5일째 마우스 DLGN의 대표적인 저배율 이미지입니다.

이것은 왼쪽 및 오른쪽 눈 입력의 경계 영역에서 샘플링된 미세아교세포입니다. 미세아교세포 부피 외부의 모든 CTB 형광을 빼서 삼켜진 망막 신경절 세포 입력과 미세아교세포의 표면 렌더링을 드러냅니다. RGC 입력이 여기에 표시됩니다.

다음은 P 5, P 9 및 P 30 마우스에서 렌더링 된 대표적인 표면입니다. DLGN 망막 절막 절막 절개 입력의 삼킴은 이전 연령에 비해 DLGN에서 최대 가지치기 동안 크게 증가합니다. 보체 수용체 3이 결핍된 마우스의 미세아교세포는 야생형 깔짚 짝에 비해 훨씬 적은 망막 신경절 세포 입력을 흡수합니다.

이 기술은 제대로 수행되면 72시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 레이블 뉴런을 intergrade하고 microglia synapse interactions를 평가하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.