Name: 말림 분석 : CNS 식세포와 신경 세포 사이의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-08T23:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 학습하세요 중추신경계 미세아교세포가 시냅스 구성요소를 포식하는 과정을 정량화하는 방법을. 형광 추적자 주입과 공초점 현미경을 활용하여 신경회로 가소성 연구에 활용할 수 있습니다.

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,,, NRSA (DPS F32-NS-066698) 작업은 스미스 가족 재단 (BS), 다나 재단 (BS), 존 머크 학자 프로그램 (BS), NINDS (BS RO1-NS-07100801)에서 교부금에 의해 지원되었다 낸시 루리 마크 재단 (DPS), NIH (P30-HD-18655; MRDDRC 이미징 코어).

RGC 시냅스 입력의 1. 선행 성 라벨 주 : 동물의 사용과 관련된 모든 실험은 모든 NIH의 지침에 따라 검토하고 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 감독되었다. <ol><li> 필드와 악기를 소독. </li><li> 플렉시 유도 챔버에서 4 부피 %의 이소 플루 란 (이 부피 %의 이소 플루 란 신생아 - 성인 마우스 작동)와 마우스를 마취. 오버 마취 방지하기 위해 밀접하게 쥐를 관찰합니다. 주의 : 진공 배기 가스 배출과 흡입을 피할 것. </li><li> 1-3 분 후, (이전 마우스는 적은 시간이 필요합니다) 마취의 적절한 수준이 꼬리를 곤란하게 (아무 반응이 관찰 될 수 없습니다)와 호흡 속도 (속도가 느리고 꾸준한해야한다) 관찰에 의해 달성되어 있는지 확인합니다. </li><li> 주둥이에 3-4 부피 % 이소 플루 란 (isoflurane)을 제공하는 측면과 장소 코 콘 스테레오 현미경으로 마우스를 놓습니다 (신생아 &lt;생후 10 (P10) ~ 4 부피 %;&gt; P10 ~ 3 부피 %). </li><li> 공막을 노출합니다. 신생아의 주입 전에 아이 오프닝에, 눈꺼풀을 열고 공막을 노출 피부를 뒤로 당겨 작은 봄 가위를 사용합니다. 나이가 쥐의 경우, 공막을 노출하는 눈 주위의 피부를 뒤로 당겨 손가락을 사용합니다. 주의 : 신생아에서, 때로는 눈의 구석에 또 다른 수직 절단이 필요합니다. 절단하는 경우, 과도 출혈하는 혈관이 있기 때문에 눈꺼풀의 모서리를 절단 할 때주의하십시오. </li><li> 공막이 시작되는 줄에서 눈의 측면에 작은 구멍을 천공 멸균 30.5 G 바늘을 사용합니다. 다만 충분히 경사가 눈에가는 것을 바늘을 삽입하여 렌즈가 손상되지 않도록주의하십시오. </li><li> 유리체는 구멍의 흐름과 액체를 흡수하기 위해 멸균 면봉을 사용할 수 있습니다. </li><li> 유리체는 구멍에서 흐르는 중지되면, 선행 성 추적 염료로 사전로드 해밀턴 주사기에 부착 된 무딘 엔드 바늘을 삽입구멍에. 주의 : 천천히 눈의 다른면을 천공이나 렌즈의 손상을 방지하기 위해 바늘을 삽입합니다. </li><li> 천천히 눈에 염료를 주입. 일반적으로, 알렉사 594, 647, 또는 488 (CTB-594, CTB-647, 또는 CTB-488, 5-6 ㎍ / μL)에 접합 된 서브 유닛 β 콜레라 독소 anterogradely 추적 RGC 입력하는 데 사용됩니다. 신생아 (≤의 P10)의 경우 1 ~ 2 μL는 충분하며, 마우스의 경우&gt; P10 ~ 3 μL 충분하다. 참고 : 알렉사 염료 리소좀 저하에 특히 저항 </li><li> 몇 초 동안 구멍에 바늘을두고 천천히 제거합니다. </li><li> 과잉 유동성을 흡수하고 밖으로 누출 염료를 방지하기 위해 면봉을 사용합니다. </li><li> 눈에 항생제 연고의 작은 금액을 적용합니다. 눈이 수술 열린 경우 모두 살짝 눈꺼풀의 위치를​​ 변경. </li><li> 두 눈을 주입하는 경우, 다른 눈에 절차를 반복합니다. </li><li> 이 anesth에서 회복하기 시작 때까지 다음과 같은 주사 (들), 열 램프 아래 또는 열 패드에 마우스를 남겨ESIA. </li><li> 깨끗한 집 케이지에 마우스를 반환하고 식민지로 돌아 가기 전에 잠에서 깨어 있는지 확인하기 위해 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol> 2. 이미징 조직 준비 이 조직 준비 프로토콜은 식세포가 형광 마커 (예, 미세 아교 세포에 대한 CX3CR1-EGFP)으로 표시되는 기자 마우스에 사용됩니다. 기자 라인을 사용할 수없는 경우, 조사 (토론 참조) 조직 섹션을 immunostain 수 있습니다. <ol><li> ~ 24 시간 주사 후 마우스를 희생하고 두뇌를 해부하다. </li><li> 밤새 4 ℃에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 채워진 팔콘 튜브에 뇌를 해결 하락 주의 : PFA는 독성이다. 흄 후드 또는 하강 기류 테이블에 사용 및 개인 보호 장비를 착용하여 흡입 및 피부 노출을 피하십시오. 주의 사항 : 고정은 (≥ 4 시간) 단축 될 수 있습니다. 대신 드롭 고정 또한, 4 % PFA 관류 사용 2-24 시간 드롭 수정 올 수 있습니다. 그러나 perfuse의 비교고정 신생아와 성인의 두뇌를 드롭 D는 이미지 품질이나 정량에 차이를 보이지 않았다. </li><li> 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에서 뇌의 3 배를 씻어. <ol><li> 빈 무게 배에 뇌와 PFA를 붓는다. </li><li> 다른 두뇌를​​ 전송하기 위해 주걱을 사용하여 PBS로 가득 보트의 무게. </li><li> 두 번 더 PBS에 세척 뇌 (전송 뇌의 두 개 더로는 PBS로 가득 보트의 무게). </li></ol></li><li> 30 % 자당 용액으로 채워진 팔콘 튜브에 머리를 전송합니다. 뇌가 튜브 (48 시간)의 바닥에 침몰 할 때까지 4 ° C에서 자당의 두뇌를 남겨주세요. </li><li> 뇌가 싱크되면 절편의 두뇌를 준비합니다. 다음 단계는 냉동 스테이지 슬라이딩 마이크로톰을 사용하여 40 ㎛의 부동 부분의 제조 (저온 유지 장치도 사용될 수있다)이다. <ol><li> (dLGN를 들어, 뇌의 주동이의와 꼬리 부분을 제거) 필요하지 않은 뇌의 일부를 제거하기 위해 면도날을 사용합니다. </li><li> 브래지어를 고정드라이 아이스에 알루미늄 호일에있는. 이 시간 동안, 마이크로톰 스테이지를 고정하고 0.5 ㎖의 0.1 M 인산 완충액 (PB)를 24 - 웰 플레이트의 각 웰을 채운다. </li></ol></li><li> 냉동 무대에서 (이 불투명 나타납니다) 냉동 뇌를 탑재합니다. <ol><li> 무대에 최적의 절단 온도 화합물 (10 월)의 작은 금액을 적용합니다. </li><li> OCT를 동결하기 시작하면, OCT의 두뇌를 놓는다. 절단됩니다 뇌의 끝은 (꼬리 쪽을 얼굴 dLGN 위해, 예를 들어)을 위로 향하게해야합니다. </li><li> 매우 미세하게 분쇄 된 드라이 아이스와 뇌와 OCT를 포함한다. </li><li> ~ 30 초 동안 뇌 / on 10 월 드라이 아이스를 남겨주세요. </li><li> 드라이 아이스를 제거하는 큰 페인트 브러시를 사용합니다. 뇌와 OCT를 무대에 고정되어야한다. </li></ol></li><li> 또한 (ROI)의 영역에 도달 할 때까지 조직을 통해 구획 시작한다. </li><li> ROI에 도달하면, 블레이드의 부분을 제거하고 24 - 웰 플랫폼로 전송할 작은 페인트 솔을 이용E 0.1 M PB (단계 2.5.2)를 포함. 이전의 블레이드에서 섹션을 제거하는 0.1M의 PB에 적셔서 촉촉한 페인트 붓을 유지합니다. 참고 : 섹션 4 ℃에서 하룻밤 0.1 M PB에 남아있을 수 있습니다 </li><li> 섹션가 수집되고 나면, 형광 해부 현미경 선행 성 라벨을 시각화하고 투자 수익 (ROI)을 포함하는 섹션을 선택합니다. </li><li> 작은 페인트 브러시와 슬라이드 섹션을 탑재합니다. <ol><li> 충전 된 현미경 슬라이드에 0.1 M PB의 작은 수영장을 적용합니다. </li><li> PB의 풀에 조직 섹션을 전송합니다. </li><li> 방향을 PB 및 페인트 브러시를 사용하여 조직을 확산. </li><li> 초과 PB를 윅 킴 와이프를 사용합니다. 섹션을 심지 않도록주의하십시오. </li><li> 완전히 건조 공기 수 있습니다. </li><li> 각 섹션에 장착 매체의 작은 방울을 적용하고 (22 × 50 mm의 1.5 호) 상단에 커버 슬립을 탑재합니다. </li><li> 영상 세션 때까지 -20 ° C에서 매니큐어 및 저장소와 슬라이드의 가장자리를 밀봉. 참고 : 이미징하지만준비가 좋습니다 일주일에 슬라이드 이전 영상에 몇 주 동안 -20 ° C로 유지 될 수있다. </li></ol></li></ol> 3. 이미징 조직 모든 이미지는 회전 디스크 공 초점 현미경 (UltraView 복스 회전 디스크 다이오드 레이저 (405 nm의, 445 nm의, 488 nm의, 514 nm의, 561 nm의, 640 nm의)을 갖춘 공 ​​초점 현미경)에 인수됩니다. 이미지는 또한 (예를 들면, 레이저 스캐닝 공 초점 현미경, 디콘 볼 루션 등 뒤에 epifluorescent 현미경)은 고해상도 Z-스택을 획득하는 능력을 가진 임의의 현미경에 취득 할 수있다. 프레임 크기는 일반적으로 1,000 X 1,000 픽셀입니다. <ol><li> 10 배 배율로 투자 수익 (ROI)을 찾아 이미지를 획득. retinogeniculate 시스템에서 미세 아교 세포 이미징의 경우, 투자 수익 (ROI)이 가장 내측 dLGN 섹션입니다. </li><li> 높은 배율로 이동 (60X 계획 아포 목적, NA 1.4는 일반적으로 사용되는 =). </li><li> 0.2 μm의 Z-단계를 사용하여 식세포를 포함하는 뷰의 첫 번째 필드 획득의. </li><li> 동물 당 식세포를 포함하는 15-19 더 많은 필드를 취득. </li></ol> 4. 정량화 (ImageJ에)에 대한 이미지를 준비 <ol><li> ImageJ에있는 열기 Z-스택. </li><li> 이미지 메뉴에서 색상 및 분할 채널로 이동합니다. </li><li> 가득 채우고 재료를 포함하는 채널에서 배경을 뺍니다. <ol><li> 가득 채우고 재료 (예를 들면, 시냅스 입력)를 포함하는 채널 창을 선택합니다. </li><li> 프로세스 메뉴로 이동 빼기 배경을 선택합니다. dLGN에있는 시냅스 입력의 선행 성 추적 10 픽셀의 롤링 볼 반경을 사용합니다. 참고 : 롤링 볼 반경이 경험적으로 결정된다. 그러나, 일반적으로 배경의 일부가 아닌 이미지에서 가장 큰 개체의 반​​경만큼 커야한다. </li></ol></li><li> 식세포를 포함하는 채널을 부드럽게. <ol><li> 식세포 (예를 들면, 미세 아교 세포)를 포함하는 채널 창을 선택합니다. </li><li> 프로세스 메뉴 및 셀프로 이동요법 필터, 평균. 1.5의 평균 필터 (이것은 이후 단계에서 표면의 렌더링 이미지를 부드럽게)를 사용합니다. </li></ol></li><li> 식세포를 포함하는 채널에서 배경을 뺍니다. <ol><li> 식세포 (예를 들면, 미세 아교 세포)를 포함하는 채널 창을 선택합니다. </li><li> (설정은 경험적으로 결정해야합니다) 빼기 배경을 선택, 프로세스 메뉴로 이동합니다. EGFP 양성 미세 아교 세포에 대한 50 픽셀의 롤링 볼 반경을 사용합니다. </li></ol></li><li> 이미지 메뉴로 이동하고 색상, 채널 병합을 선택하여 채널을 병합합니다. </li><li> (이것은 빠른 렌더링 표면을 만드는 5 단계 참조) 병합 파일에서 식세포를 포함 자르기 ROI. <ol><li> 도구 모음에서 직사각형 선택 도구를 사용하여 투자 수익 (ROI)의 주위에 상자를 그립니다. </li><li> 이미지 메뉴로 이동하여 자르기를 선택합니다. </li></ol></li><li> (단계 4.2 참조) 다시 채널을 분할합니다. </li><li> 자신의 TIFF 파일로 각 채널을 저장합니다. </li></ol> 5. 정량화를 위해 이미지를 준비Imaris에 <ol><li> 열기 Imaris과 볼륨 아이콘이 왼쪽 상단 메뉴 (그림 2)에 선택되어 있는지 확인합니다. </li><li> 잘라낸 이미지의 열기 첫 번째 채널 (채널 중 하나, 그냥 일관성이 처음 열릴 수 있습니다.) </li><li> 다른 채널을 추가합니다. 편집 메뉴로 이동하여 채널을 추가하고 파일의 다음 채널을 선택을 선택합니다. (나머지 채널에 대해이 단계를 반복합니다.) 참고 : 색상을 변경하려면 표시 조정 창으로 이동하여 채널 이름 (그림 3A)을 클릭합니다. 이 색상을 조정하는 대화 상자가 나타납니다. 화면 조정 화면이 표시되지 않는 경우, 편집 메뉴로 이동하여 디스플레이 조정을 선택합니다. </li><li> 픽셀 값을 조정합니다. 편집 메뉴로 이동하여 이미지 속성을 선택합니다. 이 창에서, x, y 및 z 픽셀 값 (이 값은 현미경 대물, 카메라, 및 z 단계 취득에 의존하여 이미지를 획득하는 데 사용되는 소프트웨어에서 찾아 볼 수있다)를 조정. </li><li> 단계 5.5은 매우 발생합니다작은 이미지. 의 크기를 조절하려면, 오른쪽 하단 모서리에있는 맞춤 아이콘 (그림 2)을 클릭합니다. </li><li> 화면 조정 창에서 왼쪽과 가운데 삼각형을 사용하여 각 채널의 밝기와 대비를 조정합니다. </li></ol> 식세포의 6. 3 차원 (3D) 표면 렌더링 <ol><li> 상단 도구 모음에서 능가 ​​모드 (그림 3C)를 선택해야합니다. </li><li> 화면 조정 창에서 식세포 채널을 제외한 모든 채널을 선택 취소합니다. 이 시야에서 제거됩니다. </li><li> 표면 렌더링 아이콘 (그림 2)를 클릭합니다. </li><li> 작성 창 왼쪽 아래 (그림 4A) 표시됩니다 반드시 세그먼트의 ROI는이 첫 번째 창에서 선택을 취소합니다. 아래에있는 파란색 앞으로 버튼을 클릭하십시오. </li><li> 스무딩을 조정합니다. <ol><li> 다음 창에서 풀다운 메뉴 (그림 4B)에서 식세포 채널을 선택합니다. 이것은 조정표면화되고 (0.1 μm의 다듬기는 일반적으로 미세 아교 세포에 사용되는) 경험적으로 결정되어야한다 세부 금액입니다. </li><li> 절대 임계 값을 선택합니다. </li><li> 아래에있는 파란색 앞으로 버튼을 클릭하십시오. </li></ol></li><li> 임계 이미지. <ol><li> 이미지 (그림 4C) 적절하게 표면화 될 때까지 막대 그래프 및 드래그를 클릭합니다. 이것은 형광 이미지 위에 겹쳐 회색 표면은 정확한 표면 표현 보장하기 위해 이미지를 회전하여 실험적으로 결정된다. 참고 : 회전 화면 (그림 3B)의 상단 오른쪽에있는 포인터 메뉴에서 이동을 선택, 클릭하고 회전 할 이미지를 누릅니다. 원래 방향으로 이미지를 반환하려면 원점을 선택하면 하단보기 메뉴에서 왼쪽. </li><li> 아래에있는 파란색 앞으로 버튼을 클릭하십시오. </li></ol></li><li> 다음 창에서 이미지가 매우 잡음이되지 않는 등의 크기에 의해 모든 표면을 필터링 할 수있는 옵션이있어, 필터링을 삭제하지 마십시오자동으로 표시 Y 필터. 식세포를 렌더링 표면을 완료 아래에있는 녹색 화살표를 클릭합니다. 탭의 새로운 세트는 (그림 5)가 나타납니다 </li><li> 필요한 경우, 그 식세포의 일부가 아닌 모든면을 삭제합니다. <ol><li> 선택 옵션이 포인터 메뉴 (그림 3B)에 선택되어 있는지 확인합니다. </li><li> 이 노란색으로 변하도록 삭제 될 모든 표면을 클릭합니다. 제어 버튼을 누른 상태에서 여러 개의 표면을 삭제하려면 표면을 클릭합니다. </li><li> 연필 탭에서 삭제를 클릭합니다. </li></ol></li><li> 를 선택하고 한면에 식세포의 모든 표면을 병합합니다. <ol><li> 유입 경로 (; 그림 5C, 즉 필터 탭)을 클릭합니다. </li><li> 추가를 클릭합니다. </li><li> 어떤 필터를 선택까지 (모든 표면은 황색이어야한다) 왼쪽에있는 막대 그래프를 드래그합니다. </li><li> 다시 연필 탭으로 이동하여 통일을 클릭합니다. </li></ol></li><li> 그래프 탭으로 이동합니다 (그림 5A </strong&gt;) 및 세부 정보를 클릭하고 표시 할 매개 변수를 선택합니다. 볼륨 (그림 5D)을 선택합니다. 여러 매개 변수를 표시, 왼쪽 아래에있는 렌치 아이콘 (그림 2)로 이동하고 기록하는 매개 변수를 선택합니다. </li><li> 식세포의 볼륨을 기록하고 계속하기 전에 파일을 저장합니다. </li></ol> 가득 채우고 소재의 7. 3D 표면 렌더링 <ol><li> 식세포에 의해 침몰 된 재료를위한 새로운 채널을 만듭니다. <ol><li> 식세포 표면이 선택한 상태에서 연필 탭을 클릭합니다. </li><li> 모든 마스크를 클릭합니다. </li><li> 표시되는 대화 상자에서 침몰 자료 (; 그림 (b) 예를 들어, 시냅스 입력의 선행 성 추적)에 해당하는 채널을 선택합니다. </li><li> 마스크를 적용하기 전에 중복 채널을 선택하고 확인을 누르십시오. </li><li> 새로운 채널이 침몰 된 소재만을 포함하고 내부 디스플레이 조정 창에 나타납니다식세포. </li></ol></li><li> 표면 렌더링 총 빨아 nonengulfed 물질을 포함하는 채널입니다. <ol><li> 표면 할 채널을 제외하고 표시 조정 창에있는 모든 채널의 선택을 취소하고 식세포에 대해 생성 된 표면을 취소합니다. </li><li> 다시 표면 렌더링 아이콘을 클릭합니다 (단계 6.3 참조) (6.4-6.11 단계) 식세포에 대해 설명한 것과 동일한 단계를 사용하여 채널의 표면을 만들 수 있습니다. 참고 : 이전에 (단계 6.5, 그림 (b))을 부드럽게하고 임계 값에 올바른 채널을 선택해야합니다. 임계 값을 적어 두십시오 (; 그림 4C 단계 6.6 참조). 이 값은 또한 표면 렌더링 후 얻을 수있는 것은 (지팡이 탭, 그림 5A) 완료됩니다. </li></ol></li><li> 총 침몰과 비 가득 채우고 재료의 양을 기록하고 계속하기 전에 파일을 저장합니다. </li><li> 표면 가득 채우고 재료 (식세포 내 소재)를 렌더링합니다. <ol><li> 만의 형광을 시각화침몰 재료의 새로운 채널 (단계 7.2.1 참조). </li><li> 상기와 같은 단계를 (7.2-7.3 단계)에 따라. 참고 : (단계 7.1에서 만든 새 채널을 선택) 이전 평활화 풀다운 메뉴에서 올바른 채널을 선택해야합니다. 임계 창에서 수동 다운로드 잠겼 비 잠겼 재료 (단계 7.2.2 참조) 렌더링 설정된 임계 값을 입력한다. </li></ol></li><li> 침몰 물질의 양을 기록하고 계속 진행하기 전에 파일을 저장합니다. </li></ol> 8.보기의 필드의 총 양을 계산 <ol><li> 모든 채널의 새로운면을 만듭니다. </li><li> 전체 필드가​​ 표면화되도록 임계 창 (단계 6.6)에서, 막대 그래프를 왼쪽으로 끝까지 밀어 넣습니다. </li><li> 전체 필드를 부상 완료하고 (6.7-6.11 단계) 양을 기록한다. </li><li> 파일을 저장합니다. </li></ol> 9. 포식 재료의 양을 계산 <ol><li> 의 농도를 계산다음과 같은 알고리즘을 사용하여 총 침몰과 비 가득 채우고 재료 채널 : 필드 (8 단계)의 총 가득 채우고과 비 가득 채우고 재료의 양 (7.3 단계) / 볼륨. </li><li> 다음과 같은 알고리즘을 사용하여 셀 당 %의 말림를 계산 (가득 채우고 재료의 양 (7.5 단계) / 식세포 (단계 6.11)의 총 양이) × 100 노트 : 셀의 크기의 변동을 고려하여이 데이터는 식세포의 총 부피로 정규화된다. 단계 9.1에서 숫자 필드에 걸쳐 매우 가변적 인 경우 9.1로 계산 단계 9.2에서 데이터를 정규화 할 필요가있다. </li></ol>

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

식균 작용을 정확하게 측정하기 위해, 재료가 잠겼 리소좀 분해가 발생하면 연구자가 그것을 시각화 할 수있는 방식으로 표시하여야한다. 또, 고해상도 영상은 셀 전체의 볼륨을 시각화하고 그 내용을 정량화 연구원있게 소프트웨어의 사용에 선행 요구된다. 이 프로토콜에서는, 우리는 높은 해상도의 공 초점 현미경 및 3D 재건과 함께 가득 채우고 재료 레이블을 알렉사 염료에 접합 CTB를 사용하여 식세포 매개 말림을 측정하는 매우 안정적이고 정량적 인 방법을 설명합니다. 이 방법은 성공적으로 개발 마우스의 뇌 (retinogeniculate 시스템) 7 시냅스 리모델링을받은 시냅스 입력의 미세 아교 세포 매개-말림을 분석하기 위해 실험실에서 사용되었습니다. 또, unde 다른 발달 연령대 걸쳐 말림의 미묘한 변화를 구분할 수있는 매우 민감한 기술로 입증R 비 병적 인 조건과 야생형과 녹아웃 마우스 사이. 약간의 조정으로,이 프로토콜은 시간 경과 영상 살아있는 조직에서 말림을 연구에 적용 할 수 있습니다. 또,이 프로토...

<html> 시냅스 회로는 동물의 생활 전반에 걸쳐 리모델링. 개발 두뇌에서 시냅스가 초과 형성하고 시냅스의 일부를 선택적으로 제거 및 8-10 유지하는 시냅스의 유지 및 강화를 포함 시냅스 가지 치기를 받아야한다. 이 프로세스는 성인 신경계의 정확한 연결 특성을 달성 할 필요가있다. 성인에서, 시냅스 또한 특히 학습 및 기억의 맥락에서 플라스틱 일 수있다. 이 가소성의 구조적 상관 관계가 돌기 쪽과 연접 BOUTONS 11 ~ 13의 추가 및 / 또는 제거를 포함하는 것으로 생각된다. 건강한 신경 시스템의 이러한 역할뿐만 아니라, 시냅스 리모델링은 신경계 질병 / 상해 12,14,15에 참여하고있다. 예를 들면, 척수 손상 후, 절단 축삭이어서 개조 및 기능적 회복 16-19을 달성하기 위해 새로운의 시냅스를 형성한다. NT는 &quot;&gt; 시냅스 가소성의 중요한 부분으로 신흥 식균 작용 또는 제거 3,5,20 향하는 시냅스의 말림하는 과정입니다. 우리는 최근 건강, 출생 후 마우스의 뇌 7 시냅스 가지 치기의 맥락에서이 현상을 보였다. 특히 , 미세 아교 세포는 상주 CNS 면역 세포와 대 식세포는 피크 기간 동안 발달 시냅스 가지 치기, 시상의 출생 등의 측면 굽은 핵 (dLGN)의 영역에서 시냅스 입력을 삼켜 표시했다.이 말림의 유전자 또는 약물 봉쇄 시냅스 연결의 지속적인 적자로 만들었습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 시냅스 입력 식세포 매개 말림을 측정하는 신뢰성 높은 정량 분석​​에 대해 설명합니다. 이 문서의 목적을 위해,이 분석에서는 망막에 존재하는 망막 신경절 세포를 포함 현상 retinogeniculate 시스템 (망막 신경절)의 맥락에서 제시 될 것이라는dLGN (그림 1A)에 시냅스 입력을 전망이다. 시작하기 위해, 리소좀 분해 내성 선행 성 라벨 전략 dLGN에서 RGC 특정 시냅스 입력 (도 1) 7,21를 시각화하는데 사용되는, 설명한다. 이 설명, 이미징을위한 세부 방법론에 따라 정량적으로 3 차원 (3D) 표면의 볼륨 렌더링과 결합 된 공 초점 현미경을 사용하여 말림을 측정하는 받게 될 것입니다. 이 방법론은 고정 티슈 제조에 기반뿐만 아니라 라이브 영상 연구에 사용하기 위해 적응 될 수있다. 분석은 건강한, 출생 후의 retinogeniculate 시스템의 맥락에서 검증되었지만 중요한 하나는 다른 뇌로 걸쳐 질병 중에 식세포 신경 세포의 상호 작용뿐만 아니라 다른 장기 시스템의 식세포 기능을 평가하기 위해 동일한 기술을 적용 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>히트 패드</td><td>Vet Equip, Inc.</td><td>965500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>열 패드 용 온수 원</td><td>켄트 사이언티픽</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td>DSC 광학</td><td>Zeiss Opmi -6 수술</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이딩 마이크로 톰 동결 단계</td><td>라이카</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 톰 블레이드</td><td>라이카</td><td>14021607100</td><td></td></tr><tr><td>형광 해부 현미경</td><td>니콘</td><td>SMZ800 첨부 Epi-fluorescence 부착물</td><td></td></tr><tr><td>회전 디스크 컨포칼 현미경</td><td>Perkin Elmer</td><td>UltraView Vox 회전 디스크 컨포칼</td><td></td></tr><tr><td>10 &마이크로; l Hamilton 가스 꽉 주사기</td><td>Hamilton</td><td>80030</td><td>각 색상 염료 / 추적기에 대해 다른 주사기를 사용하십시오</td></tr><tr><td>Hamilton 바늘</td><td>Hamilton</td><td>7803-05, 사양 : 무딘, 1.5 "</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-conjugated cholera toxin &beta; subunit (CTB)</td> <td>Invitrogen</td><td>488 : C22841</td><td>멸균 식염수, 80 &micro에서 재구성; L (488), 100 &마이크로; L (594), 20 &마이크로; l (647)</td></tr><tr><td>594: C22842</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>647: C34778</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수&nbsp;( PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>네오마이신 및 폴리믹신 B 황산염 및 바시트라신 아연 안과 연고 USP(항생제 연고)</td><td>Bausch & Lomb</td><td>24208-780-55</td><td></td></tr><tr><td>30.5 G 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Spring Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5630</td><td></td></tr><tr><td>Cotton-tipped applicator</td><td>Fisher</td><td>23-400-125</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeyde (PFA)</td> <td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>PBS에서 16 %에서 4 %로 희석합니다. 파라포르 말데히는 독성이 있으며 흄 후드에서 사용하고 개인 보호 장비를 착용하십시오.</td></tr><tr><td>해부 도구 &ndash; 가위, 집게, 주걱</td><td>작은 가위: Fine Science Tools</td><td>작은 가위:14370-22</td><td></td></tr><tr><td>큰 가위: Roboz</td><td>큰 가위: RS-6820</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#55 집게: Fine Science Tools</td><td>#55 집게: 11255-20</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주걱: Ted Pella, Inc.</td><td>주걱 : 13504</td><td></td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마</td><td>S8501-5KG</td><td>PBS (무게 / 부피)에서 30 % 자당 만들기 (중량 / 부피)</td></tr> <tr><td>OCT 화합물</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>무게 보트</td><td>USA Scientific</td><td>2347-1426</td><td></td></tr><tr><td>24 웰 플레이트</td><td>BD Biosciences</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>인산 나트륨 일염기</td><td>성 시그마</td><td>S6566-500G</td><td>ddH2O에서 0.2M 인산나트륨 일염기성(PB-A)을 만들고 ddH2O에서 0.2M 인산나트륨 이염기성(PB-B)을 만듭니다. 0.1 M PB를 만들려면 19 ml PB-A와 81 ml PB-B를 결합하고 ddH2O</td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성으로</td> 200ml까지 채웁니다.<td>Sigma</td><td>S5136-500G</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립, 22 X 50 mm, No. 1.5</td><td>VWR</td><td>48393 194</td><td></td></tr><tr><td>충전 현미경 슬라이드</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Vectasheild</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

말림 분석 : cns 식세포와 신경 세포 사이의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

식균 작용은 세포가 주변 세포 환경에서 자료 (전체 세포, 세포, 이물질 등의 일부를) 침몰 이후에 일반적으로 리소좀의 분해를 통해이 물질을 소화하는 과정이다. 미세 아교 세포는 식세포 기능 신경 퇴행성 질환 건강한 뇌의 발달 (알츠하이머 병의 예, 베타 - 아밀로이드 클리어런스) (즉, 시냅스에서의 조건의 넓은 범위에 설명 된 중추 신경계 (CNS)의 상주 면역 세포 아르 가지 치기) 1-6. 다음 프로토콜 개발 마우스 retinogeniculate 체제 7 연접 입력 미세 아교 세포 - 매개 말림을 시각화하고 계량화하기 위해 개발 말림 분석법이다. 이 분석은 특정 컨텍스트에서 미세 아교 세포의 기능을 평가하기 위해 사용되었지만, 유사한 접근법은 뇌 (예를 들어, 성상 교세포) 및 신체의 나머지 다른 식세포를 평가하기 위해 사용될 수있다(예를 들어, 말초 식세포)뿐만 아니라 시냅스 리모델링이 발생하는 다른 문맥 (예, 뇌 손상 / 질병).

최근에, 우리는 개발 retinogeniculate 시스템의 시냅스 입력의 미세 아교 세포 - 매개 말림 (그림 1) 7을 시각화하고 정량화이 말림 분석을 사용했다. CX3CR1-EGFP 이형 쥐에서 망막 신경절은 anterogradely 각각 왼쪽과 오른쪽 눈에 CTB-594 및 CTB-647으로 추적했다. 이 추적에 이어, dLGN 내에서 EGFP 양성 미세 아교 세포가 몇 군데 있었다. 이러한 이미지는 이후에 볼륨 측정을 위해 표면 렌더링되었다. 이 기술을 사용하여, 우리는 dLGN (P5) 내에서 개발 시냅스 리모델링의 피크 기간 동안, 시냅스 입력이 미세 아교 세포 (그림 6)에 의해 침몰되는 것으로 나타났습니다. 리모델링 다량 (P9) 거의 완료 될 때 적은 AS 4 일 후, 잠겼 입력의 양의 극적인 감소가있다. 또한, 말림과 가지 치기는 고전적인 보완 폭포에 속하는 단백질이 결핍 된 ...

미세 아교 세포는 세포 외 환경에서 소재를 탐식거나 삼키는 고용량으로 중추 신경계 (CNS)의 상주 면역 세포이다. 여기 시냅스 구성 요소의 미세 아교 세포 - 매개 말림을 시각화 및 측정 광범위하게 적용, 신뢰성, 높은 정량 분석​​은 설명한다.

말림 분석 : CNS 식세포와 신경 세포 사이의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

이 절차의 전반적인 목표는 미세아교세포에 의한 시냅스 전 입력물의 포식 작용을 시각화하고 정량화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 형광 전행 추적자를 눈에 주입하여 외측 슬상핵에 있는 망막 신경절 세포의 시냅스 전 입력물을 표지합니다. 두 번째 단계는 뇌를 적출, 고정 및 평형화하는 것입니다.다음으로, 뇌 조직을 절편화합니다. 마지막 단계는 이미징 및 분석을 위해 뇌 절편을 커버슬립에 부착하는 것입니다. 최종적으로, 공초점 현미경을 사용하여 미세아교세포에 의한 시냅스 전 입력물의 포식 작용을 평가합니다.이 방법은 식세포성 토양(phagocytic soils)이 시냅스 회로의 가소성 및 재구성에 어떻게 기여하는지와 같은 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 건강한 뇌의 시냅스 회로 재구성에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 신경계 질환 중의 시냅스 회로 재구성과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 실험 절차 시연은 기술자인 Chris Heller와 Stevens 실험실의 대학원생 Emily Laman이 진행하겠습니다.플렉시글라스 유도 챔버에서 4% ISO fluorine으로 마우스를 마취하여 이 절차를 시작합니다. 1~3분 후, 꼬리를 집어 적절한 마취 수준에 도달했는지 확인합니다. 그런 다음 마우스를 실체 현미경 아래에 옆으로 눕히고, 콧등에 3~4% ISO fluorine을 공급하는 노즈 콘을 배치합니다.공막을 노출시키려면, 작은 스프링 가위를 사용하여 눈꺼풀을 열고 피부를 뒤로 당깁니다. 신생아의 경우, 때로는 눈 구석에 수직으로 추가 절개를 해야 할 수도 있습니다. 눈꺼풀 구석에는 혈관이 있으므로 절개 시 주의하십시오.멸균된 30.5 gauge 바늘을 사용하여 공막이 시작되는 안구 측면에 작은 구멍을 냅니다. 바늘의 경사면(bevel)이 안구 내부로 들어갈 정도로만 살짝 삽입하여 수정체가 손상되지 않도록 주의하십시오. 유리체가 구멍 밖으로 흘러나오게 한 뒤, 멸균된 cut and tipped applicator를 사용하여 액체를 흡수합니다.유리체가 구멍 밖으로 흘러나오는 것이 멈추면, 전방 추적용 염료가 미리 충전된 Hamilton 시린지에 연결된 둔단 바늘을 구멍 속으로 천천히 삽입하십시오. 이후 염료를 안구 내로 천천히 주입합니다. 일반적으로 Alexa 594, 647 또는 488이 접합된 콜레라 독소 베타 서브유닛이 전방 추적에 사용됩니다.Late trace R GC 입력 바늘을 구멍에 몇 초간 그대로 두었다가 천천히 제거합니다. 면봉을 사용하여 과잉 액체를 흡수하고 염료가 새어 나오지 않도록 합니다. 그런 다음 눈에 소량의 항생제 연고를 도포합니다.안구를 외과적으로 절개한 경우, 주입 후 눈꺼풀을 부드럽게 다시 맞물려 줍니다. 마취에서 회복되기 시작할 때까지 마우스를 가열 램프 아래나 가열 패드 위에 둡니다.마우스를 깨끗한 홈 케이지로 옮기고, 군집으로 복귀시키기 전 완전히 깨어났는지 모니터링하십시오. 주사 후 약 24시간이 지나면 마우스를 희생시키고 뇌를 적출하십시오. 다음 날 4°C에서 4% PFA가 채워진 Falcon 튜브에 뇌를 넣어 하룻밤 동안 고정하십시오.먼저 뇌와 PFA를 빈 웨이 보트(whey boat)에 붓고, 스패튤라를 사용하여 뇌를 PBS가 채워진 다른 웨이 보트로 옮겨 PBS로 3회 헹굽니다. 뇌를 PBS로 2회 더 세척한 후, 30% sucrose 용액이 채워진 Falcon 튜브로 옮깁니다. 뇌가 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 4°C의 sucrose 용액에 보관합니다.그 후, 면도날을 사용하여 뇌의 불필요한 부분을 제거합니다. 드라이아이스 위의 알루미늄 호일 조각 위에서 뇌를 동결시킵니다. 그동안 마이크로톰 스테이지를 냉각시키고, 24웰 플레이트의 각 웰에 0.1 molar PP 0.5 mL를 채워 동결 스테이지에 뇌를 고정할 준비를 합니다.스테이지에 소량의 OCT를 도포합니다. OCT가 얼기 시작하면 그 위에 뇌를 놓습니다. 이때 절단할 뇌의 단면이 위를 향하게 해야 합니다.다음으로, 뇌와 OCT를 아주 곱게 부순 드라이아이스로 덮습니다. 드라이아이스를 뇌 위에 약 30초 동안 둡니다. 그런 다음 커다란 페인트 브러시를 사용하여 드라이아이스를 제거합니다.슬라이스를 40 micron 두께로 섹셔닝하기 시작합니다. 그런 다음, 약간 젖은 작은 붓을 사용하여 관심 영역이 포함된 섹션을 블레이드에서 제거하고 0.1 molar pb가 들어 있는 24-웰 플레이트로 옮깁니다. 섹션 수집이 완료되면, 형광 해부 현미경으로 전방 등급 라벨링을 시각화하고, 슬라이드에 마운트할 관심 영역 포함 섹션을 선택합니다.먼저, 전하가 인가된 현미경 슬라이드 위에 0.1 molar PB를 소량 떨어뜨립니다. 다음으로, 조직 절편을 PB 웅덩이로 옮깁니다. 그런 다음 붓을 사용하여 조직의 방향을 잡고 펼쳐줍니다.Kim wipe를 사용하여 XSPB를 닦아내되, 절편이 함께 닦이지 않도록 주의하십시오. 절편을 완전히 공기 건조시킵니다. 그 후 각 절편에 봉입제를 한 방울씩 떨어뜨리고 마지막에 커버슬립을 덮어 봉입합니다.매니큐어로 슬라이드의 가장자리를 밀봉합니다. 이후 영상 촬영 세션 전까지 슬라이드를 -20 °C에서 보관하십시오. 다음은 전방 등급 추적 전략의 모식도입니다.좌안과 우안의 RGC 입력은 각각 CTB 6 47 및 CTB 5 94로 추적합니다. 그 후 입력의 미세아교세포 매개 포식을 평가합니다. 다음은 좌안 및 우안 입력의 통합 추적 후 생후 5일 된 마우스 DLGN의 대표적인 저배율 이미지입니다.이것은 좌우 안구 입력의 경계 영역에서 채취한 미세아교세포입니다. 미세아교세포 부피 외부의 모든 CTB 형광을 제거하여, 포식된 RGC 입력과 미세아교세포 및 포식된 RGC 입력의 표면 렌더링을 나타냈습니다. 여기에 RGC 입력이 표시되어 있습니다.P5, P9 및 P30 마우스에서 유래한 대표적인 표면 렌더링 미세아교세포의 모습입니다. DLGN에서 RGC 입력단에 대한 포식 작용은 고령기에 비해 가지치기가 정점에 달하는 시기에 유의미하게 증가합니다. 보체 수용체 3가 결핍된 마우스의 미세아교세포는 야생형 형제 마우스와 비교했을 때 RGC 입력단을 포식하는 정도가 유의미하게 낮습니다. 숙달 완료.본 기술은 적절히 수행될 경우 72시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 뉴런을 통합적으로 표지하고 미세아교세포와 시냅스의 상호작용을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

an-engulfment-assay-protocol-to-assess-interactions-between-cns

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 문서는 소설 프로토콜 및 시약 높은 컨텐츠 분석을 사용하여 뉴런과 astrocytes의 공동 문화 화합물과 치료의 neurotoxic 효과 민감한 측정을위한 설정에 대해 설명합니다. 결과는 높은 컨텐츠 분석 neurotoxicity 평가에 대한 흥미 진진한 소설 기술을 대표하는 것을 보여줍니다.

Neurotoxicity 높은 컨텐츠 분석의 연결 및 Astrocyte 공동 문화 분석

이 연구는 소설 neuronal 축삭과 (천체) glia 공동 문화 플랫폼을 설정하는 절차를 설명합니다. 이 공동 문화 시스템에서 하나의 축삭 (및 단일 glial 세포) 사이의 직접 상호 작용 조작은 glial 신호에 대한 상호 신경 세포의 기계론의 분석을 수 있도록 가능한된다.

마이크로 유체 문화 플랫폼에 Glia 상호 작용 (MCP) 기반 Neuronal 축삭과 Glia 공동 문화 시스템에 신경의 영상 분석

이 비디오에서는 유도 만능 줄기 세포를 사용하여 신경모세포종에 대한 미세아교세포 형성 분석을 수행합니다. 이 분석은 신경퇴행성 질환에서 미세아교세포 기능의 손상을 평가하는 데 도움이 됩니다.

미세아교세포작용 분석법: iPSC 대식세포를 사용하여 신경모세포종 세포에 대한 미세아교세포작용 모델을 확립하기 위한 체외 분석

이 비디오에서는 실시간 이미징 분석을 통해 in vitro에서 정제된 성상세포의 식세포 능력을 평가합니다. 이 분석은 성상세포의 식세포 능력을 향상시키거나 억제할 수 있는 화합물을 식별하기 위한 효과적인 스크리닝 플랫폼 역할을 합니다.

In vitro phagocytosis Assay: 실시간 성상세포 매개 시냅토솜 식세포작용을 연구하기 위한 라이브 이미징 기반 방법

출처: Funes, S., et. al., Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes(인간 시냅토솜을 사용한 유도 만능 줄기세포 및 체외 생세포 식세포작용 분석의 분화). J. Vis. Exp. (2022)이 비디오는 pH에 민감한 형광 염료 표지 시냅토솜을 사용하여 미세아교세포와 같은 세포의 식세포 능력을 연구하는 분석을 보여줍니다.

인간 시냅토솜을 이용한 미세아교세포 유사 세포의 생세포 식세포작용 분석

조직의 항상성 및 부적절한 식세포 기능의 유지 보수 병리에 연루되었습니다에 대한 소교 식균 작용은 매우 중요하다. 그러나, 생체 내에서 미세 아교 세포의 기능을 평가하는 것은 기술적으로 어려운 것이다. 우리는 정확하게 모니터링 및 생리 학적 환경에서 미세 아교 세포의 식세포 가능성을 정량화하기위한 간단하지만 강력한 기술을 개발했다.

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

이 프로토콜은 신경 세포 - glia의 상호 작용의 실형 분석을위한 간접적 인 신경 세포 성상 세포의 공 배양을 설명합니다.

간접 신경-성상 세포 공동 배양 분석 일 :<em&gt; 체외</em&gt; 신경 세포 - glia 상호 작용의 상세한 조사를위한 셋업

이 프로토콜 생체 외에서 라이브 이미징 먹어서 분석 결과 이다 phagocytic 용량의 측정을 제공 합니다. Microglia 및 순화 된 쥐 이다 pH 지시자 활용 된 synaptosomes 함께 사용 됩니다. 이 방법은 실시간 engulfment과 저하 속도 검색할 수 있습니다 하 고 사이토 식 균 작용을 조절 하는 요소를 식별 하는 적합 한 심사 플랫폼을 제공 합니다.

소설 체 외에 라이브 이미징 분석 결과의 사이토 중재 먹어서 사용 하 여 pH 지시자 활용 Synaptosomes

신경 퇴행성 질환은 dysregulated 마이크로글리아 기능과 관련이 있습니다. 이 문서는 iPSC-대식세포에 의한 신경 모세포종 세포의 phagocytosis의 체외 분석방법을 설명합니다. 정량현미경 판독은 살아있는 세포 시간 경과 화상 진찰 과 고정 세포 고함량 화상 진찰을 위해 기술됩니다.

iPSC-대식세포에 의한 죽은 신경 모세포종 세포의 식증에 대한 체외 정량적 이미징 분석

여기에서는 유세포 분석을 사용하여 vGLUT1 양성 시냅스 및 pHRodo Red 표지 미처리 시냅토좀의 미세아교세포 삼킴을 정량화하는 두 가지 프로토콜을 제시합니다.

유세포분석을 사용한 시냅스 물질의 미세아교세포 삼킴 정량화

학습하세요 중추신경계 미세아교세포가 시냅스 구성요소를 포식하는 과정을 정량화하는 방법을. 형광 추적자 주입과 공초점 현미경을 활용하여 신경회로 가소성 연구에 활용할 수 있습니다.

말림 분석 : CNS 식세포와 신경 세포 사이의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜

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