Name: 심층하고 유익한 대사 체 분석을위한 여러 대사 산물 화합물 클래스를 복구하려면 여러 단계의 제조 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: 학습하세요 복잡한 생물학적 유체에서 대사산물을 분리하는 다단계 추출법을 통해 지질 대사체 커버리지를 개선하는 방법을. 이 기술은 대사체학 프로파일링 연구에 필수적인 재현성과 신뢰성을 제공합니다.

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제시 튜토리얼은 국립 유대인 건강에 질량 분석의 핵심 시설 내에서 수행하고 개발되었다. NJH MS 시설이 CCSTI UL1 TR000154에 의해 부분적으로 지원됩니다. NIH 교부금에서 자금 P20은 HL-113445와 R01 HL-095432는이 작업을 지원했다.

1. 초기 고려 사항, 악기 및 표준의 준비 <ol><li> 항상 (유리 문화 튜브, 유리 자동 시료 주입기 튜브)를 저장하거나 (유리 피펫) 지질 및 유기 용매를 전송하기 위해 유리를 사용합니다. </li><li> 공기에 대한 모든 지질 시료와 표준의 노출을 최소화합니다. 씰 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PFTE)은 공기 노출과 증발을 방지하기 위해 단단히 모자. 바로 다음 용매를 건조 지질을 재현 탁 또는 질소를 일정에 보관하십시오. </li><li> 샘플 100 μl를 사용합니다. 이상 (또는 이하) 샘플을 사용할 경우에 따라 볼륨을 조정합니다. 그러나 NH 2 SPE 컬럼의 지질 분별하는 동안, 표시된 볼륨이 남아 있어야 말했다. </li><li> 원심 분리기를 켜고 샘플 준비의 시작 이전에 0 ° C로 설정합니다. </li><li> 이 기술은 많은 휘발성이 너무 샘플 준비하는 동안 출장 모든 용제를 계속 사용합니다. </li><li> 권고 당 기준의 두 종류를 준비. </li><li> 일정 농도의 아군에서 표준 모든 구성 음의 제어를 준비합니다. 이것은 모든 샘플뿐만 아니라 배치 QC (별도의 일에 샘플 준비 재현성을 모니터링하는 데 사용 아군 풀링 샘플)과 악기로 사용되는 풀링 된 샘플로 아군이다 QC (풀링 된 샘플은 이전에 준비 하위 분주하고하는 데 사용되는 스파이크 ) 분석시 별도의 일에 기기 상태 / 변동을 모니터링 할 수 있습니다. <ol><li> 1X, 배 및 4 배의 표준 스파이크에 긍정적 인 컨트롤을 준비합니다. 양성 대조군은 모든 샘플뿐만 아니라 풀링 된 혈장 샘플에 첨가하고 샘플 준비 단계 및 보장하는 데이터 분석 중에 방면 변화의 차이를 분석하고 확인하는 기기 분석 단계 모두에 대한 품질 관리 화합물로서 사용되는 모든 측면 준비 및 기기 분석은 정확히 수행 하였다. </li></ol></li><li> -80 ° C에서 -20 ° C 및 저장 샘플에서 보관 기준 특정 내부 스탠드장기 저장을 다음 저하하는 경향이 급성 호흡 곤란 증후군은 -80 ℃에서 보관해야 </li><li> 이 절차는 MTBE와 같은 위험한 가연성 또는 휘발성 용매의 사용을 필요로합니다. 흄 후드의 모든 단계를 수행합니다. </li></ol> 2. 내부 표준 <ol><li> 개별 프로젝트 및 특정 실험 설계를 기반으로 내부 기준 (ISTD)을 선택합니다. 플라즈마, BALF, 소변,이 샘플에 생물학적으로 발견 된 것과 본질적으로 유사하다 동위 원소 표지 ISTDs 같은 biofluids에 이상적 일 것입니다. 이들은 포함 할 것입니다 만, 아미노산, 호르몬이나 지질에 한정되지 않는다. 식물 대사 체 샘플은 플라보노이드 또는 카로티노이드로 분류 기준이 사용될 수있다. 동일은 조사 샘플의 유형을 분석하는 대표 내부 표준을 선택해야된다, 다른 대사 체 연구에 적용됩니다. </li><li> 선택 ISTD는 크로마토 그램의 넓은 범위를 커버 있는지 확인합니다; 예를 들어, 경우 t그는 수집 시간은 5 분마다 용출 기준이 사용될 수있다, 20 분입니다. </li><li> ML 분석 시료에 외생 동위 원소 표지 된 표준 및 / 또는 다른 극성 화합물의 다양한 사용하여 2 ㎎ / 친수성 ​​재고 솔루션을 만듭니다. 25 ㎍ / ㎖의 크레아티닌-D (3)의 최종 농도가 100 ㎍ / ㎖의 라이신 D 4, 및 / ㎖ 발린-D 8 200 μg에 대한 모든 표준 물 : 각각의 원액에서 1:1 메탄올 하나의 솔루션을 만들 . </li><li> 분석 시료에 외생 동위 원소 표지 된 표준 및 / 또는 기타 비극성 화합물의 다양한 사용하여 소수성 주식 솔루션을 만들; 17시 지방산 (4 ㎎ / ㎖)의 스톡 농도 19시 1분 지방산 (4 ㎎ / ㎖), 17시 세라미드 (2 ㎎ / ㎖), 17시 PE (1.75 ㎎ / ㎖), 15 : 0 PC (2 ㎎ / ㎖) 테스토스테론 D-2 (1 ㎎ / ㎖). 각 주식에서 1:1 클로로포름에 하나의 솔루션을 만들 : (50)의 최종 농도에 대한 모든 표준과 메탄올㎍ / ml의 17시 세라미드, 100 ㎍ / ㎖의 15시 PC, 100 ㎍ / ㎖의 테스토스테론 D-2, 200 ㎍ / ㎖의 17시 지방산, 200 ㎍ / ㎖의 19시 1분 지방산 및 200 ㎍ / 표준 믹스 ML 17시 PE. </li><li> 탐지 및 이들 화합물에 대한 기기의 선형성의 리미트를 결정하기 위하여 각각의 표준에 대해 적어도 다섯 가지의 농도를 사용하여 미리 각 표준의 이온화 정도를 테스트한다. 각 표준 원액의 농도는 실험 설계에 따라 다양하며, 결합 아군 표준형 각 표준의 농도는 2 ㎎ / ㎖로 ML 20 ㎍ /로부터 그들이 이온화 얼마나 잘 따라 범위 일 수있다. </li><li> 양성 대조군의 스파이크 믹스를 생성하고 정량적으로 샘플 준비 및 쓸모 데이터의 정확성의 강도를 모니터 할 1X, 2X, 4X 또는 농도 수준에서 샘플에 추가. 양성 대조군의 최종 농도 수수 : 2 ㎎ / ㎖의 D-글루코스, 100 ㎍ / ㎖의 알라닌-D 3, 200 ㎍ / ㎖의 메틸 말 론산-D 3, 20 ㎍ / ㎖의 트리글리 세라이드-D 5, 및 / 또는 기타 소수성 및 친수성 기준. 분석에 사용되는 MS와 HPLC 기기의 감도에 따라 표준 농도를 조정합니다. </li></ol> 3. 단백질 침전 <ol><li> 아래에 설명 된대로 해동 RT 샘플과 각 시료에 ISTD의 10 μl를 스파이크. </li><li> 각각의 샘플 (단계 2.3 및 2.4에있는 주식에서 만든) 모두 친수성과 소수성의 표준 솔루션을 10 μl를 스파이크. 분석을 위해 사용되는 MS 및 HPLC 기기의 감도에 근거 필요한 표준 농도를 조정 <ol><li> 각 샘플에 1X, 2X 또는 4X 긍정적 인 제어 솔루션 (단계 2.6 재고에서 생성) 중 하나의 10 μl를 스파이크. MS와 HP의 감도에 따라 필요에 따라 표준 농도를 조정분석에 사용되는 LC 계측 </li><li> 전에 단백질 침전 단계 10 초 동안 소용돌이 각 샘플 </li></ol></li><li> 각각의 샘플 (-20 ° C에 저장) 얼음 냉 메탄올 400 μL를 추가합니다. </li><li> 튜브 당 10 초 동안 소용돌이. </li><li> 18,000 X g에서 15 분 0 ° C에서 원심 분리기. </li><li> 새로운 유리 문화 튜브에 모두 뜨는을 전송하고, N 2에서 다음 건조. </li><li> 단백질 펠렛의 비율을 분석하면, 단계 3.8-3.11를 진행합니다. 단백질 펠렛을 분석하지 않으면, 섹션 4로 이동. 참고 : 단백질 펠렛 약물 연구를 수행 할 때 유용 할 것 소수성을 가진 화합물을 포함 할 수있다 (18), 음식은 신경 ceroid-lipofuscinoses 20 리소좀 지질 저장 등의 소수성 화합물이 축적 질환과 관련된 소수성 플라보노이드 19 또는 대사 체 연구를 포함하는 분석 질병 21. </li><li> t에 MTBE의 1 ML을 추가합니다그는 흰색 (미색) 단백질 펠렛, 튜브 당 30 초 동안 소용돌이는, 다음 X g 18,000에서 15 분 0 ° C에서 원심 분리기. 새로운 유리 배양 관에 MTBE 층을 가만히 따르다. 이것은 (대표 결과 그림 5 참조) 여기에 오류가 획기적으로 결과에 영향을 미치기 때문에 중요한 단계입니다. <ol><li> 펠릿의 크기가 샘플에 따라 달라집니다 이후 지속적으로 모든 샘플에 대한 MTBE의 동일한 금액을 대기음. 만 900 μL가 상층의 최소 금액과 함께 샘플 경사 분리 할 수​​있는 경우에 따라서, 모든 시료 900 μl를 가만히 따르다. </li></ol></li><li> 3.9 단계를 반복 한 단계 3.7에서 제조 된 동일한 유리 문화 튜브에 유기 층을 결합한다. </li><li> 1시 1분 클로로포름 200 μL에있는 N 2 흐름에 resuspend로 드라이 샘플 : 메탄올. 소용돌이 짧게. </li><li> 원심 분리 관에 전송합니다. 18,000 XG에 15 분 0 ° C에서 원심 분리기는 다음 유리를 사용하여 스크류 캡 튜브를 자동 시료 주입기에 뜨는을 전송피펫. </li></ol> 4. 액체 - 액체 추출 <ol><li> 유리 피펫을 사용하여, (3 절, 6 단계에서) 잔여 건조 메탄올, 소용돌이 30 초에 3 ㎖의 MTBE를 추가 소용돌이 후, 튜브 당 10 초를 물 750 μl를 추가합니다. </li><li> RT에서 원심 분리기에서 10 분 ~ 200 XG에 스핀. </li><li> 기음 MTBE의 (물을 받고하지 않고) 층과 깨끗한 유리 문화 튜브로 전송의 2.5 ML. 참고 :이 여기에 차이가 결과에 영향을 미치기 때문에 중요한 단계입니다. 그것은 고정 된 볼륨이 아래 수성층을 피펫 팅없이 경사 분리 될 수 있기 때문에 MTBE 2.5 ml를 조심스럽게 상층으로부터 경사 분리한다. 실험의 시작에서 샘플의 부피는이 방법을 위해 표시된 100 μL보다 작은 경우에는, 비례이 초기 샘플 볼륨을 반영하도록 MTBE의 볼륨을 확장. </li><li> 샘플의 잔여 물 부분에 3 ㎖의 MTBE를 추가하고 튜브 당 소용돌이 10 초. </li><li> 스핀 ~ 200RT의 원심 분리기에서 10 분 동안 XG. </li><li> 대기음 (물을 받고하지 않고) MTBE 3 ㎖ 및 MTBE 튜브와 결합. </li><li> N 2 하에서 건조하여 남은 수층을 집중한다. </li><li> 물 100 μL에 잔여 물을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 간단히 유리 문화 튜브, 소용돌이에 얼음 냉 메탄올 400 μl를 추가하고 microcentrifuge 관에 전송합니다. </li><li> 20 ~ 30 분 동안 -80 ° C에 둡니다. 18,000 X g에서 15 분 0 ° C에서 회전. 참고 :이가 남아있는 단백질이 메탄올에 침전 수로 -80 ° C의 냉동고에 전체 샘플 랙을 배치하는 것이 좋습니다. -80 ° C의 냉동고를 사용할 수없는 경우, 다른 옵션은 다음과 같습니다, -20 ° C에서 저장하는 드라이 아이스에 샘플을 배치, 또는 얼음 통에 그들을 유지. 일관되게 침전을 허용하도록 추운 환경에서와 동일한 온도에서 샘플을 저장하기 위해 중요하다. </li><li> 에 뜨는 전송 대기음 450 μL깨끗한 microcentrifuge 관. 더 이상 45 ° 이상의 온도에서 진공 원심 농축기에서 완전히 건조 (약 1 ~ 2 시간 소요). </li><li> 5 % 아세토 니트릴 / 물 200 μL에서 건조 뜨는을 Resuspend. 소용돌이 짧게. -80 ℃에서 동결 </li></ol> 오. 고체 상 추출 <ol><li> 질소의 좋은 흐름 (약 10 ~ 15 분 소요)와 35 ° C에서 질소 하에서 MTBE의 일부를 건조. </li><li> 완전하게 건조, 질소의 흐름을 중지하고 신속하게 유리 피펫을 사용하여 1 ㎖의 클로로포름 (클로로포름)에 재현 탁. 소용돌이 짧게. 참고 사항 : 클로로포름 등의 용제가 낮은 점도 있습니다. 피펫 팅하는 동안, 낮은 표면 장력은 피펫 용매 손실이 발생합니다. 그것은 피펫 팁이 피펫되는 용매와 피펫의 공간 사이의 평형을 허용하기 위해 적어도 두 번 prewet하는 것이 좋습니다. 가능하다면 기밀 주사기가 또한 사용될 수있다. </li><li> SPE 진공 매니 폴드 및 NH 2를 설정합니다 </서브&gt; 분별을위한 SPE 열. </li><li> 따뜻한 RT 샘플과는 항상 N 2의 지속적인 흐름에 따라 정지 유지. RT에의 온난화 지질 재 부상을 허용하고 질소는 산화 지질의 중합을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 400 μL 헥산 세척 조건 SPE 카트리지 2 배. 폐기물을 버리고 새로운 유리 수집 관으로 교체. </li><li> SPE 컬럼에 샘플을 추가, 유리 튜브에 흐름을 통해 수집합니다. </li><li> 유리 피펫 2:1 클로로포름 1 ㎖를 추가로 : IPA를, (이것은 중립 분수입니다) 같은 유리 튜브에 흐름을 통해 수집합니다. </li><li> 산화를 (약 10 ~ 15 분 소요) 최소화하기 위해 N 2에서 중립 부분을 건조. </li><li> 유리 피펫은 디 에틸 에테르 5 % 아세트산 1 ㎖를 추가로, (이것은 지방산 분수입니다) 새 유리 튜브에 흐름을 통해 수집합니다. </li><li> 산화를 (약 10 ~ 15 분 소요) 최소화하기 위해 N 2에서 지방산의 비율을 건조. </li><li> (800)를 추가하는 플라스틱 팁을 사용 &amp;# 181; SPE 카트리지에 메탄올의 L, 그리고 흐름을 통해 15 ML 플라스틱 원뿔 튜브 (이것은 인지질의 분수입니다) 수집합니다. </li><li> 1.5 ㎖의 원심 분리기 튜브에 인지질 분획을 전송합니다. 45 ° C (약 1.5 시간 소요)의 진공 원심 농축기와 샘플을 건조시킵니다. </li><li> 저장 작은 유리 병 스크류 캡을 자동 시료 주입기 100 % 메탄올, 소용돌이 및 전송의 200 μL의 세 분수에서 각 샘플을 Resuspend. </li></ol> 6. 저장 조건 샘플 <ol><li> 기기 분석을위한 준비가 될 때까지 -80 ° C에서 모든 샘플을 저장합니다. 참고 : 유기 용매에 재구성 추출 된 샘플은 -20 ℃에서 저장 될 수있다 관심의 잠재적 인 대사 산물이 온도에서 떨어집니다 그러나이 권장되지 않습니다. 액체 질소 저장은 수사관 오염 문제, 특수 저장 작은 유리 병이 필요 신고되었습니다로 추천하고, 챔버 CAU의 동질성 부족이되지 않는다넓은 온도 변동을 노래. </li><li> 샘플 볼륨 (&lt;100 μL) 작은 경우에, 저장 중에 헤드 스페이스에서 용매 증발을 방지하기 위해 튜브의 삽입을 사용한다. </li><li> 샘플의 동결 - 해동을 피하십시오. 오른쪽 기기 분석 전에 한번만 샘플을 해동. 반복 된 동결 - 해빙 샘플 저하. </li></ol> 7. 액체 크로마토 그래피 조건 <ol><li> 소수성 부분을 분석하기 위해 C-18 2.1 mm X 12.5 mm (5 μm의) 가드 열이있는 C-18 2.1 mm X 50mm (1.8 μm의) 분석 컬럼을 사용합니다. </li><li> (4) 오토 샘플러 온도 설정 &#160; ° C, 60 열 온도 &#160; ° C, 0.25 ㎖ / 분으로 2 μL 및 유량 주입량. </li><li> 이동상 B의 물 (60:36:4) : 아세토 니트릴 : 이동상 물에 0.1 % 포름산, 이소프로판올 0.1 % 포름산을 사용하여 </li><li> 다음 구배 용출 프로파일을 실행 시작T 30 %의 B 및 0 ~ 1 분 70 % B로 증가하고 15 분에 1에서 100 % B로 증가하고 5 분 10 % B 세척 및 5 분 후 실행 한 다음 5 분을 위해 보유. </li><li> 친수성 부분을 분석하기 위해 보호 컬럼과 HILIC 2.1 mm X 50mm (2.6 μm의) 분석 컬럼을 사용합니다. </li><li> (4) 오토 샘플러 온도 설정 &#160; ° C, 20 열 온도 &#160; ° C, 0.5 ㎖ / 분으로 2 μL 및 유량 주입량. </li><li> 10mM의 아세트산 암모늄, 이동상에 대한 pH를 5.8 및 이동상 B. 10 mM의 아세트산 암모늄 pH를 5.8에서 90 % 아세토 니트릴의 50 % 아세토 니트릴을 사용 </li><li> 다음 구배 용출 프로파일 실행 0 ~ 2 분에서 100 % B에서 시작을 한 다음 5 분 0 %의 B 세척하고 10 분 후 실행 한 다음, 15 분에 2에서 50 % B로 감소. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

임상 대사 체 연구의 하나의 목표는 질병이나 치료에 관련된 대사 체의 변화를 파악하는 것입니다. 따라서 샘플 준비 기술은 강력하고, 일관성 있고, 기술자의 기술자 및 실험실에서의 실험 (22)에 양도해야합니다. 결과 데이터는 샘플의 대표해야하고, 식별 된 변경 오히려 샘플 준비 오차보다 길게 설정하여 샘플을 반영 할 필요가있다. 따라서 정확한 피펫, 정확한 온도, 섞이지 않는 층을 효율적으로 디캔팅, 질소 하에서 건조하고, 유리 및 팁 같은 브랜드와 크기의 사용이 필요합니다. 단백질 침전 공정 동안, 용액의 동량 각 펠릿으로부터 경사 분리하는 것이 중요하다. 이 볼륨의 변화를 줄이고 같은 샘플 데이터의 변화를 줄일 수 있습니다. 이 단백질의 침전 단계는 대사 체 연구를위한 필요하고, 그것은에서 단백질을 제거하기 때문에 생략 할 수 없습니다종래의 작은 분자 시료는 질량 분석기에서 분석 프로파일. 그것은 병원균 큰 거대 분자를 제거하고 릴리스는 단백질 7에서 대사 산물을 결합. 시료에서 단백질 축적 부족 HPLC 컬럼의 수명을 확장 및 정확성과 결과의 품질. 5는 혈장에이 기술을 수행 할 때 형성 단백질 펠릿 묘사 인도 증가한다. 이는 작은 분자의 검출은, 이온 풍부를 강화하고, 시료 중의 단백질의 매트릭스 효과를 줄일 수있다. 이 모든 단백질이 단계에서 제거되는 것으로 가정하고 있기 때문에 또한, LC-MS 분석에서 발견 된 아미노산 대사 변경에서보다는 단백질 분해에서 발생한 것입니다. 이 두 섞이지 않는 층으로 친수성과 소수성의 대사 산물을 분리하기 때문에 액체 - 액체 추출 단계가 중요합니다. 6 그림 LLE 절차 및 담당자를 보여줍니다LLE 층의 resentation. 두 층의 부적절한 분리 대사 손실되는 또는 두 분수에서 용출되는 중 하나가 발생합니다. 이 단계를주의 깊게 응용 프로그램은 소수성 부분에 표시 친수성 ​​화합물의 수를 줄일 수 있습니다. 는 대표적인 결과를 포함하는 분획을 판단 할 수 없기 때문에 이러한 화합물에 대한 결과는 신뢰할 수없는됩니다. 제대로 할 때, 대사 오버랩 감소된다. 특히 지질에서뿐만 아니라, 예를 들어 티올 그룹을 포함 할 수있는 작은 분자, 산화 분해를 방지하기 위해 산소에 노출이 최소로 유지되어야한다. 따라서,이 절차는 항상 지질 또는 티올 함유 화합물의 산화를 방지 / 감소시키는 질소하에 수행된다. 또한, 샘플 및 / 또는 솔루션의 전송 샘플을 신속하게 아래로 건조 질소를 일정하게 아래에 배치 한 후, 산소 노출을 줄이기 위해 (첫 번째 분 이내) 빠르다. 일단 건조, 그들은 즉시 주이다ately 위에서 설명한 이유로 100 % 메탄올에 재현 탁. 연구소는 여러 가지 방법이 포괄적 인 방법 혜택을 누릴 수 있습니다; 화합물의 하나의 클래스를 분리하고자하는 연구자는 자신의 요구에 가장 적합한 방법의 일부를 선택할 수 있습니다. 단지 대사 풀을 구하는 단백질 침전을 수행하고자하는 사람은 그렇게 할 수있다. 친수성 대사 산물과 같은 많은 의약품, 아미노산, 당류, 또는 단지 소수성 대사 물질과 같은 트리글리 세라이드, 에폭시, 지용성 비타민, 예를 들어 인지질로서, 소망이라면, 연구자 액체 - 액체 추출을 수행 할 수 있으므로, 요구된다면 단백질 침전 다음 단계로 원하지 않는 부분을 삭제. 소수성 화합물 (중성 지질, 지방산, 인지질)의 추가 하위 분류를 요구하는 수사는 분류 단계로 진행할 수있다. 스토리지 고려 maintaini에 중요하다나중에 분석을 위해 샘플의 가능성을 겨. 샘플이 잘못 저장되어있는 경우, 분해 또는 분해가 발생할 수 있습니다. 이상적으로, 샘플은 빛에 민감 종의 저하를 방지하기 위해 멀리 빛에서 스크류 캡 호박색 유리 병에 보관해야합니다. 샘플은 또한 신진 대사 저하 23-25을 방지하기 위해 -80 ° C에서 냉동 보관해야합니다. 여기에서 자세히 설명하지 않지만, 샘플은 항상 LC-MS 분석에서 자동 시료 주입기 트레이에 4 ° C에 보관됩니다. 이것은 모든 샘플을 일정한 온도 및 주위 온도의 변화가 샘플의 점도, 용해도, 또는 안정성에 영향을주지 않는 것으로 유지되는 것을 보장한다. 그것은 같은 LLE 및 SPE로이 절차의 매뉴얼 측면이,,하는 단계와 자신감과 편안함을 얻기 위해 연습을하는 것이 좋습니다. 몇 가지 제한 사항이 기술을 위해 존재한다. 소수성 및 친수성 ​​대사의 비밀스러운 분리는 특정 화합물을 본인 의지로 보장 할 수 없습니다이라 고한다면, 때문에 그들의 화학 성분 및 충전 상태로 두 분수로 분할. 도 4, 단백질 펠렛 추출 단계 동안 부적절한 기술 샘플 및 품질 관리 모두 불량 대사 재현성이 발생할 수있는 바와 같이 또. 통계 전원이 사용할 수 없기 때문에 특히 작은 데이터 세트에서 통계에 영향을 미칩니다. 따라서이 단계가 정확하게 각 샘플에 대해 동일한마다 수행하는 것이 중요합니다. 또 다른 한계는 시간입니다. 정지 점 샘플을 고정 할 수 있고, 준비가 다음날 계속이 프로토콜을 통해이 있지만, 하루 종일이 절차를 수행 할 따로 설정해야합니다. 셋째, 생체 시료 내의 모든 화합물은 이온 억제를 위해 평가 될 수 없습니다. 이 행렬은 각각의 대사에 영향을 미치는 방법을 식별 할 수 없기 때문에, 현재의 옵션은 이론적 endogenou 몇몇 클래스를 모방 내부 기준을 평가할 수있다의 대사. 마지막으로, 절대 식별이 방법으로 단독으로 수행 할 수 없습니다. 데이터베이스 검색 및 표준에 공동으로 협력하여 MS는 절대 대사 산물 식별이 필요합니다. 대사의 중요한 부분은 화합물의 식별이다. 여기에서 상세하게 논의되지는 않았지만, 품질 관리 샘플을 LC-MS를 이용하여 분석 하였다. 여러 샘플 준비 공백 및 악기 공백함으로써보다 안정적인 대사 히트의 결과로, 오염 물질에서 잘못된 반응의 속도를 줄이기 위해 배경 빼기로 사용하기 위해 준비 하였다. 이 단계에 이어, &quot;분자 기능&quot;의 수는 m / z, 머무름 시간, 동위 원소 비율, 실제 화합물의 목록을 생성하는 부가 물을 기반으로 그룹화 하였다. 화합물의 목록이 크게 감소되었지만 그들이 동일한 화합물에서 체류 부가 물에 기초하지 않은 것처럼, 결과는 더 안정적이었다. 전체 방법은 포괄적이고 isolatio 수 있습니다그러한 중성 지질, 인지질, 지방산, 트리글리 세라이드, 및 스테로이드, 또한 수성 분획 친수성 클래스를 분리하는 동안, 어느 에이코 사 노이드는 당, 플라보노이드, 및 아미노산 12 확인 된 26 소수성 대사 N.

생물학적 반응은 세포 프로세스의 최종 제품 등의 대사 산물을 생성합니다. 대사 체학은 이러한 과정의 결과로 유기체에 존재하는 모든 화합물의 집합이다. 그것은 세포의 생리학의 사진을 제공하고, 외부 또는 내부 자극 1, 2에 유기체의 반응을 반영한다. 이러한 자극은, 환경 독성, 약물,식이 요법, 호르몬, 질병과 관련이있을 수 있습니다. 많은 대사 체 응용 프로그램이 현재 연구자들에 의해 연구되고 있으며, 바이오 마커의 발견 3, 영양 연구 4, 식품 과학 (5), 약물 테스트 6 (가) 있습니다. 에 관계없이 응용 프로그램, 데이터, 오염 및 오탐 (false positive)의 존재의 변화가 감소 또는 제거하는 것이 바람직 할 필요가있다. 바이오 마커 발견에 또는 생물학적 F를 제어하고 질환 군 간의 차이를 결정하는, 또는 피사체에 약물의 효과를 조사하는 경우LUID는 요청을 받고 질문에 따라 선택하고, 대사 산물의 종류는 7 조사를 받고. 예를 들어, 샘플 전 염증성 시토카인의 농도에서 대사 산물을 탐구하고 투여 후, 천식 환자의 폐에 흡입 약물의 즉각적인 효과를 공부하는 경우는 우선 일 것입니다. 차이가 실제 생물학적 변화보다는 부적절한 시료 전처리 기술에 기인 관찰 보장하기 위해 표준화되고 일관성있는 실험 프로토콜은 8 필수적이다. 샘플 정보를주의 깊게 같은 몇 가지 이름을 생물학적 유체, 동물, 변형, 샘플링 시간, 대상 연령, 성별, 같은 변수가 모두 고려 및 연구 9에 고려되는 것을 보장하기 위해 문서화되어야한다. 또, 오염이나 오 탐지의 가능성을 줄이기 위해, 그것은 용매 블랭크 계측기 블랭크가 열을 분석 할 것을 권장한다. 이 프로토콜의 경우, 용어 &quot;대사LITES는 &quot;확인 된 실제 화합물을 참조하는 데 사용됩니다. 벤더의 소프트웨어를 사용하여, 초기 피크 발견 알고리즘은 질량 스펙트럼 피크를 검출하기 위해 사용된다. 이들 피크는 질량 대 전하 (m / z)의 비율 및 체류 시간을 기준으로 정렬된다. 두번째 알고리즘은 다음 단일 화합물에 여러 기능을 결합하는 데 사용된다. 이 나트륨, 칼륨, 또는 양성 이온화 모드 암모늄 부가 물, 및 음이온 모드 클로라이드와 같은 기능을 포함한다. 소프트웨어의 추가 옵션은 이량 체 및 기타 부가 물 등의 기능이 포함되어있다. 181.0707 m / z (M + H)에서의 피크와 함께, 예를 들어 글루코스를 사용 198.0972 m / z (M + NH 4) 및 203.05261 m / z (M + NA), 동일에 대응하는 세 개의 피크가 될 제 알고리즘을 사용하여 인 화합물. 분자식을 기반으로하는 두 번째 알고리즘은, 적용 그러나 때이 세 가지 부가 한 화합물의 결과로 그룹화됩니다. 대사 산물은 SAMP 내에서 간섭을 일으킬 수 있습니다본 발명의 화합물의 복잡성으로 인해 레. 하나의 샘플 원인의 대사 산물의 수천의 존재는 특히 낮은 풍부한 대사의 억제 신호. 샘플 정리 단백질을 방해 제거하고 다수의 분수에 이후의 분리는 샘플이되어, 피크 분리를 개선 해상도를 증가시키고 신진 대사 coelution 감소의 복잡성을 줄일 수 있습니다. 따라서, 샘플 정리 및 화합물의 개선 된 분리가 필요합니다. 그것도 다양한 극성 용매의 사용과 혼자 단백질의 침전을 보여왔다,이 문제를 11, 12를 확인할 수 없습니다. 그러나, 후속 분별 단계와 같은 MTBE와 같은 강한 유기 용매를 조합하여 대사 산물 범위가 증가된다. 양 등. (12)는 결합 MTBE 용매 추출을 사용하여 3,806 대사에 각각 메탄올 또는 단독으로 메탄올 에탄올 침전 1,851 또는 2,073에서 대사 산물의 증가를보고고체 상 추출 (SPE) 단계 하였다. 감소 된 대사 산물의 중복, 향상된 피크 분리 및 증가 된 대사 산물의 풍요 로움은이 방법으로 관찰되었다. 이러한 중합체와 같은 비 대사에서 오염은 시료 채취, 용매, 또는 장비 노이즈가 발생할 수 있으며, 잠재적으로 중요한 대사 산물의 신호 억제 될 수 있습니다. 그것은 것을 권장 기술자 (들)과 준비가 지속적으로 같은 브랜드, 유형 및 샘플 수집 튜브, 피펫 팁과 샘플의 수집과 준비를하는 동안 사용되는 다른 튜브의 크기를 사용하여 샘​​플링하기 전에 샘플을 수집하는 사람들. 이 데이터 분석은 관측 된 변화가 실제와 다른 소스에서 배경의 차이에 기인하지 않는 것으로 가득 차있는 신뢰를 가질 수 있습니다. 치료 효과, 질병 및 제어 그룹 또는 다른 대사 분석 사이의 차이는 증가 자신감을 조사 할 수 있습니다. 메타OD 여기에서 논의 플라즈마, BALF, 또는 뇌척수액 (CSF) 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 (LCMS)을 기준으로 분석을위한 비 대상으로 대사 체 프로파일 링에 대한 샘플에 적용 할 수있는 결합 된 샘플 준비 방법 13-15에 초점을 맞추고 있습니다. 액체 크로마토 그래피 (LC)와 초 고성능 액체 크로마토 모두 (UPLC) 분리 기술이 절차에이어서 MS에 연결될 수있다. 대사 체 연구를 수행하는 많은 연구자들은 단백질 침전 기술 및 / 또는 액체 - 액체 추출법 (16, 17) 중 하나를 사용한다. 우리의 연구에서이 적은 대사 산물이 검출되는 결과. 여기에 설명 된 방법 (12)은 대사 체의 넓은 범위를 덮고, 대사의 많은 수의 검출 및 식별을 가능하게한다. 이 증가는 대사 산물 클래스의 사전 분리로 인한 감소 된 샘플 및 매트릭스 효과의 높은 순도에 기인한다. 초기 제자EIN 침전 단계는 샘플로부터의 단백질을 제거하고, 냉 메탄올 (메탄올)을 사용하여 수행된다. 메틸 tert-부틸 에테르 (MTBE) 및 물을 사용하여 액체 - 액체 추출 (LLE)이 친수성 ​​및 소수성 화합물을 분리하는 데 사용된다. 지방산, 중성 지질, 인지질 및 -이어서 고상 추출 (SPE)가 세 개의 클래스로 소수성 화합물을 분리하는 소수성 층에서 수행된다. 친수성 분획을 물 중 5 % 아세토 니트릴 재구성하면서 소수성 분획을 100 % 메탄올에서 재구성된다. 고상 추출 (SPE) 단계는 달리 본 것 coeluting 화합물의 수를 줄임으로써 결과에 자신의 첨가 수준은 분리 단계가 수행되지 않았 제공한다.

<table><tbody><tr><td>아세토니트릴</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>L-6815</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>C606-1</td><td></td></tr><tr><td>헥산</td><td>시그마 알드리치</td><td>34859</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>시그마 알드리치</td><td>49199-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>메틸 tert-부틸 에테르</td><td>J.T. Baker</td><td>9042-03</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 알코올</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34965-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>물</td><td>Honeywell Burdick Jackson</td><td>365-4</td><td></td></tr><tr><td>OA-SYS 난방 시스템</td><td>Organomation Associates, Inc</td><td></td><td>35 &#176에서 샘플을 일정한 질소 흐름 하에 유지하는 데 사용됩니다. C</td></tr><tr><td>12-위치 진공 매니폴드</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strata NH2 (55 &micro; M, 70&Aring;) 100 mg/ml SPE 카트리지</td><td>Phenomenex</td><td>8B-S009-EAK</td><td></td></tr><tr><td>유리 피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td>샘플을 SPE 컬럼으로 옮기는 데 사용</td></tr><tr><td>플라스틱 피펫 팁</td><td>USA Scientific</td><td>1182-1830</td><td>유리 팁이 필요하지 않을 때 사용</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>눈금이 매겨진 유리 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-27B</td><td>시료 준비 중 유기 용매를 이송하는 데 사용</td></tr><tr><td>Pyrex 유리 배양 튜브</td><td>Corning Incorporated</td><td>99499-16X</td><td>다음 단계까지 수성 및 지질 분획을 저장하는 데 사용</td></tr><tr><td>Autosampler 바이알 Agilent</td><td>Technologies</td><td>5182-0545</td><td></td></tr><tr><td>자동 샘플러 바이알용 스냅 캡 바이알</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0541</td><td></td></tr><tr><td>유리 인서트</td><td>Agilent Technologies</td><td>5183-2085</td><td>소량의 시료에 사용</td></tr><tr><td>Mass Hunter 정성 분석 소프트웨어</td><td>Agilent Technologies</td><td>버전 B.06.00</td><td>머무름 시간 및 압력 곡선을 모니터링하는 데 사용</td></tr><tr><td>Mass Hunter 정량 분석 소프트웨어</td><td>Agilent Technologies</td><td>버전 B.05.02</td><td>품질 관리 및 샘플 데이터 분석에 사용</td></tr><tr><td>Mass Profiler Professional 소프트웨어</td><td>Agilent Technologies</td><td>버전 B.12.50</td><td>통계를 결정하고, 변화를 접고, 대사 산물 식별을 수행하는 데 사용됩니다</td></tr></tbody></table>.

심층하고 유익한 대사 체 분석을위한 여러 대사 산물 화합물 클래스를 복구하려면 여러 단계의 제조 기술

Multi-step Preparation Technique to Recover Multiple Metabolite Compound Classes for In-depth and Informative Metabolomic Analysis

대사는 생물 학적 과정에 대한 통찰력을 얻기 위해 살아있는 유기체에서 샘플 프로파일 링을 가능하게하는 새로운 분야이다. 대사의 중요한 측면은 일관성이 기술은 신뢰할 수없는 결과를 생성함으로써 샘플 준비입니다. 이 기술은 단백질의 침전, 액체 - 액체 추출, 4 개의 별개의 클래스로 대사 산물을 분별 수단으로 고상 추출을 포함한다. 감도의 결과로 증가 낮은 풍부한 분자의 개선 농축을 얻을, 그리고 궁극적으로 분자의 더 많은 신분을 확인하는 결과됩니다. 이 기술은 플라즈마, 기관지 세척액, 50 μL의 낮은 볼륨이있는 뇌척수액 샘플에 적용되었습니다. 시료는 여러 다운 스트림 애플리케이션에 사용될 수있다; 예를 들어, 단백질의 침전으로 인해 펠릿 나중에 분석을 위해 저장 될 수있다. 이 단계에서 상등액을 사용하여 액체 - 액체 추출을 겪는다물과 친수성과 소수성 화합물을 분리하는 강한 유기 용제. 분별하면, 친수성 ​​층은 나중에 분석을 위해 처리 될 수 있거나 필요하지 않으면 폐기. 소수성 분획은 추가로 지방산, 중성 지질 및 인지질로 분별하는 세 고상 추출 단계에서 용매의 시리즈로 처리된다. 이 기술자에게 화합물의 클래스 분석을 위해 선호되는 선택할 수있는 유연성을 허용한다. 또한 화학 클래스가 존재의 지식 이후보다 안정적인 대사 산물 식별에 도움이됩니다.

전체 샘플 준비 기술은 전술 한 바와 같이 수행하고, 중요한 및 / 또는 중요한 측면은 다음과 같다. 친수성과 소수성 내부 표준은 다양한 추출 방법을 사용하여 내부 표준 및 내인성 대사 존재비의 직접적인 비교를 수행하는 풀링 된 혈장 샘플로 스파이크 하였다. 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (LC-MS)의 데이터가 정량적 소프트웨어를 사용하여 분석하고 우수한 복구 및 내인성 화합물 및 내부 표준을 모두 분리 초래 하였다.도 1은 지질 수준 모두를 추출하는 MTBE-SPE 방법의 효과를 보여 (A) 및 내인성 화합물 (B). 전반적으로 더 추출 및 대사 산물의 커버리지 메탄올 추출, 또는 &#39;MTBE 전용&#39;추출 등의 다른 방법에 비해 얻었다 때 숫자 OF 기능은 LC-MS 분석을 다음과 같은 질적 및 양적 소프트웨어를 사용하여 비교 하​​였다. 예를 들어, 메탄올만을 추출하여, 크레아티닌 D-3에 대한 편차는 15.2 %였다. 그러나, MTBE LLE,이 1.04 %의 CV로 감소했다. MTBE를 사용하여, 지질 및 수성 화합물의 재현성 &lt;지질 및 수성 화합물의 각각 29 %보다 큰 편차의 15 % 귀착 간단 메탄올 추출에 비해 각각 8 % &lt;5 %였다. 지질 회수율을 모니터링하는 데 사용되는 내부 표준 - 테스토스테론 D-2, C17 세라미드, 15시 PC, 단독 메탄올을 사용하는 것에 비해 26 %, 200 %, 100 %, 400 % 각각 증가 17시 PE. 비슷한 증가는 지방산 내부 기준과 phosphotidylcholine 및 phosphotidylethanolamine 내인성 대사 산물 검출되었다. 이러한 스핑, 세라마이드, 디아 실 글리세롤, 트리 아실 글리세롤, 콜레스테롤, 스 핑고 마이 엘린과 같은 다른 내인성 대사 산물이 검출되지 않은 하나메탄올을 사용하거나 무시할 수있는 수준으로 검출되었다. 그러나 이러한 내인성 지질 쉽게 MTBE 추출을 사용하여 검출 하였다. 표준 프로토콜을 비교 분석 결과에서, 다음과 같은 결과가 얻어졌다 : 메탄올 침전 단독 1851 대사 결과, 메탄올 - 에탄올 침전이 2073 대사를 베푼, 액체 - 액체 추출과 MTBE는 액체 - 액체 회수 고체상 추출로 3125 및 MTBE 준 3,806 대사. 감소 된 이온 억제 전에 LC-MS에 청소기 샘플에 가장 가능성이 추출되는 대사 산물의 큰 숫자에 따라서이 방법의 결과. 그림 2는 자신감 대사 산물 식별을위한 각각의 화학 클래스로 소수성 대사 산물을 분리의 효율을 보여줍니다. SPE는 다음의 세 가지 지방질 분획에서 식별 화합물의 최소의 중첩이있다. 지원, 3은 그림ISTD의이 화학적 클래스에 관련된 부분에서 용출 된 것을 보여주는 내부 기준을 복구 할 수 있습니다. 품질 관리 샘플, 샘플 준비의 품질을 평가하기위한 분석의 체류 시간이 큰 샘플 세트를 위해 필요할 때 어떤 배치 효과를 결정하기 위하여, 계측기 재현성을 모니터링하는 데 사용된다. 크로마토 그램에서 스파이크 된 표준 이하 ± 5 % 이하 ± 3 ppm을 보존 시간 윈도우 질량 오류 복구 90 %보다 큰 것을 보장하기 위해 시험된다. 이러한 기준이 충족되지 않으면, 그 결과는 폐기되고 샘플은 다시 분석된다. 보존에 시프트 한 배치에 대해 관찰된다 배치 효과의 경우, 데이터 분석 소프트웨어가이 보정 할 수있다. 풀링 된 혈장의 이전 준비 일괄 처리는 샘플 준비를 시행 하였다. 분획 후 오토 샘플러 바이알에 계대 분주 및 감시 기기 조건에서 사용하기 위해 -80 ° C에 보관 하였다모든 샘플의 분석에 걸쳐 tions. 표 1은이 스파이크에 기준의 결과를 보여줍니다. QC 샘플을위한 스파이크의 표준의 % CV는 10 %보다 더 컸다 때문에 지방산 마이너스 이온화 모드 분획 (데이터 표에 도시되지 않음) 분석에 사용되지 않았다. 그 부분에 대한 데이터 집합에 따라서 폐기 장비는 검사 및 유지 하였다. 표 2는 샘플 준비 및 세중 악기 주사의 세 가지 다른 일 다음 샘플에서 내인성 대사의 결과를 보여줍니다. 샘플 준비 QC 샘플의 내인성 대사 샘플 준비의 강도뿐만 아니라 기기 주입 재현성을 나타내는 모든 재현성. 샘플 준비 단계가 제대로 지켜지지 않는 경우에는, 그러나, 신뢰할 수와 일치하지 않는 결과를 얻을 수있다. 그림 4는 결과를 보여줍니다 때 방법의 단백질 침전 단계설명 된대로 따라하지 않습니다. 세 개의 연산자, A, B, 및 C는 풀링 된 혈장 샘플에 대해 동일한 샘플 준비 절차를 수행. 조작자가 아니라 실험 프로토콜마다 상등액의 요구량을 피펫보다 대신 펠렛의 일부를 모두 세척 대해&gt; 1 ㎖를 피펫. 이것은 그 부분에 대한 잘못된 반응의 높은 숫자에 나 섰으나 데이터의 변동성을 증가뿐만 아니라. 데이터의 재현성 크로마토 그래피는도 7에서 볼 수있다. 풀링 혈장 샘플이 프로토콜에 설명 된 단백질 침전, 액체 - 액체 추출, 및 고체상 추출을 사용하여 각각 다른 날에 중으로 준비 하였다. 각각의 분획은 프로토콜의 섹션 7에 기재된 크로마토 그래피 분리를 이용하여 분석 하였다. 샘플은 다음기구 및 샘플 제조의 재현성을 평가하기 위하여 LC-MS에 중으로 주입 하였다. 이 일관성 중복 streng를 모두 보여줍니다세 가지 일에 준비된 샘플 준비뿐만 아니라 재생 가능한 결과를 생산 크로마토 그래피 방법의 강도의 재현성 번째. 화학적 노이즈 증가는 지방산 분획의 마이너스 이온화 모드로 관찰된다. 이는 LC-MS 용제의 오염 물질 발생과 일치하지 않는 양적 메타 볼로 결과가 발생할 수 있습니다. 따라서 이전의 9 분에 용출 만 대사 산물을 분석 하였다. 긴 작업 목록을 실행하는 경우, 기기의 감도와 버퍼 농도의 변화의 손실 감소 신호 강도와 유지 시간의 변화의 결과로 시간이 지남에 따라 발생할 수 있습니다. 머무름 시간 오버랩 편차가 5 % 미만이며, 신호 강도의 변화가 10 % 미만이면, 데이터는 표준 실험실 한계 내에 여전히. 분석 소프트웨어는 기기 및 머무름 시간 드리프트 보정하기 위해 데이터를 정렬하고 정규화하는데 사용될 수있다. 그러나 편차가 있다면 LARGE는 다음 이유는 결정되어야한다. 이것은 정류되면, 샘플을 다시 분석 할 수있다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1. 추출과 역상 크로마토 그래피 (RPC) 12 다음 지질 ISTDs (A) 및 내인성 대사 물질 (B)의 풍요 로움. 추출을 수행하고, 얻어진 샘플은 RPC를 사용하여 분리하고, 양 및 음 이온화 모드에서 LC-MS를 이용하여 분석 하였다. 이 수치는 양 등, 크로마토 그래피 (1300), 217-226 (2013)의 저널에서 수정되었습니다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2. MTBE-SPE의 비교는 12 분수. 각 FR에서 식별 대사동작은 프렙의 SPE 부분 동안 오버랩의 양을 식별하는 비교 하​​였다. 벤 다이어그램의 숫자는 각 분획에서 검출 된 대사 산물의 수를 반영한​​다. 여기서 마이너 오버랩 SPE 단계 동안 성공적인 화합물 추출 및 대사 산물 클래스 분리를​​ 나타내는 세 개의 분획물 구비 관찰된다. 이 수치는 양 등, 크로마토 그래피 (1300), 217-226 (2013)의 저널에서 수정되었습니다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig3highres.jpg" width="500" /> 그림 3. MTBE-SPE 방법 (12)을 사용하여 분수에 ISTDs의 복구. 추출을 수행하고, 얻어진 샘플은 RPC를 사용하여 분리하고, 텍스트에서 설명한 양 및 음의 모드 LCMS를 이용하여 분석 하였다. 이 수치는 양 등, 217-226 (2013) 크로마토 그래피 (1300)의 저널에서 수정되었습니다. &lt;/ P&gt; <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig4highres.jpg" width="500" /> 그림 4. 3 사에 의해 제조 된 펠릿 부분에서 결과. 세 개의 샘플 준비 사업자 A, B, 및 C는 풀링 된 혈장 시료에 동일한 단백질의 제조 공정을 수행 하였다. 벤 다이어그램의 숫자는 각 오퍼레이터에 의해 검출 된 대사 산물의 수를 반영한​​다. 운영자가 500보다 대사, 대부분의 특정 부분에 대한 오 탐지되는 결과, 전체 뜨는 펠릿을 피펫 팅하는 동안 운영자 B와 C는 샘플 준비 프로토콜 당 필요한 볼륨을 피펫. <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig5highres.jpg" width="500" /> 단백질 침전 단계에서 단백질 펠렛의 그림 5. 형성 &lt;. / strong&gt;을 (A) 인간 혈장 100 μL 사전 준비 견본, (B) 플라즈마 얼음 냉 메탄올을 첨가 한 후, 18,000 X에서 15 분 0 ° C에서 원심 분리 한 후 튜브의 바닥에 형성된 (C) 단백질 펠렛 g. <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig6highres.jpg" width="500" /> 액체 - 액체 추출 (LLE) 단계에서 친수성과 소수성 층의 그림 6. 분리. 유기 용매를 메틸 t-부틸 에테르 (MTBE) 및 물을 친수성과 소수성의 대사 산물을 분리하기 위해 사용되었다. MTBE 층은 비극성 화합물을 용해하고 물 층은 극성 화합물을 용해했다 (A) 플라즈마 상청액 단백질 제거 후;. (B) 플라즈마 질소하에 건조시킨 후, MTBE를 첨가 한 후 (C) 플라즈마; <str<html> 사연&gt; 플라즈마 및 MTBE에 물 (D) 또한, 원심 분리 후 형성 (E) MTBE 물 층, 최고 MTBE 층 (F) 제거, (G) MTBE 제거 후 남아 주로 친수성 층. <img alt="그림 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51670/51670fig7highres.jpg" width="500" /> 그림 7.. 샘플 준비는 세 개의 분리 된 풀링 된 플라즈마 QC 샘플 및 각 샘플에 수행 된 선택 집합의 분수의 크로마토 그램은 LC-MS 악기 회 반복 주입 하였다. 메소드 프로토콜의 섹션 7에 나타낸 LC-MS의 파라미터를 이용하여 얻은 혈장 시료의 총 이온 크로마토 그램이다 나타낸다. 다른 생물학적 유체 크로마토 그래피 표현으로 인해 신진 대사 조성의 차이에 따라 달라질 수 있습니다.&quot;K&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="485"><colgroup><col /><col /><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="42"><td height="42" style="height:42px;width:85px;"> 분수 </td><td style="width:72px;"> 이온화 모드 </td><td style="width:127px;"> 내부 표준 </td><td style="width:23px;"> N </td><td style="width:103px;"> 평균 피크 면적 </td><td style="width:77px;"> 피크 면적 %의 CV </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 수성 </td><td> 긍정적 인 </td><td> 크레아티닌-D 3 </td><td> 31 </td><td> 2217311 </td><td> 3.8 % </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 중성 지질 </td><td> 긍정적 인 </td><td> 트리글리 세라이드-D 5 </td><td> 31 </td><td> 4837032 </td><td> 9.9 % </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></tD&gt; <td></td><td> C17 세라마이드 </td><td> 31 </td><td> 12736707 </td><td> 7.9 % </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 인지질 </td><td> 긍정적 인 </td><td> 15시 PC </td><td> 32 </td><td> 1248929 </td><td> 9.3 % </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> 17시 PE </td><td> 32 </td><td> 517234 </td><td> 7.9 % </td></tr></tbody></table> 아군 내부 기준에서 표 1. 품질 관리 결과. 폐기종 마우스 모델 데이터 세트로부터 풀링 된 혈장 샘플이 다중 주 연구를위한 매일 악기 상태를 감시하기 위해 분석 하였다. 정량 분석​​ 소프트웨어는 내부 기준 (N 악기 QC = 주사의 개수)의 피크 면적을 측정 하였다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="555"><colgroup><col /><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="42"><td height="42" style="height:42px;width:85px;"> 분수 </td><td style="width:76px;"> 이온화 모드 </td><td style="width:212px;"> 내인성 대사 </td><td style="width:103px;"> 평균 피크 면적 </td><td style="width:80px;"> 피크 면적 %의 CV </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 수성 </td><td> 긍정적 인 </td><td> 크레아티닌 </td><td> 2554574 </td><td> 2.3 % </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> 발린 </td><td> 3712151 </td><td> 3.3 % </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> 포도당 </td><td> 2669190 </td><td> 6.9 % </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 중성 지질 </td><td> 긍정적 인 </td><td> 3 Dehydrosphinganine </td><td> 226644 </td><td> 3.9 % </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><tD&gt; DG (16시 / 16시 1분 / 0:0) </td><td> 11301 </td><td> 8.2 % </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> DG (P-14 : 0 / 18 : 1) </td><td> 364119 </td><td> 1.9 % </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 인지질 </td><td> 긍정적 인 </td><td> PC (24:0 / 0:0) </td><td> 27599 </td><td> 0.9 % </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> PC16 : 0 / 22 : 6) </td><td> 2873326 </td><td> 4.5 % </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> PI (16시 / 18시 1분) </td><td> 112998 </td><td> 4.4 % </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 지방산 </td><td> 긍정적 인 </td><td> 10 - 옥소 -5,8 - decadienoic 론산 </td><td> 1363284 </td><td> 2.3 % </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> 16 - 옥소 - 헵타 데칸 술폰산 </td><td> 83700 </td><tD&gt; 2.9 % </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> 2 - 메틸 발레르 산 </td><td> 285782 </td><td> 5.7 % </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 지방산 </td><td> 부정 </td><td> 10 - 하이드 록시 -8 - 옥타 술폰산 </td><td> 10042 </td><td> 4.9 % </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> (R) - laballenic 산 </td><td> 173929 </td><td> 6.5 % </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"></td><td></td><td> 2 - 케토 발레르 산 </td><td> 35488 </td><td> 6.0 % </td></tr></tbody></table> 내인성 대사에서 표 2. 품질 관리 결과. 인간의 질병 데이터 집합의 풀링 된 혈장 샘플은 별도의 일에 샘플 준비 재현성을 모니터링 분석 하였다. 샘플은, 3 일 동안 중으로 준비 (N = 9 준비 QC 주사)했다.

대사 체학 실험 결과의 신뢰성은 시료 준비의 효율성과 재현성에 따라 달라집니다. 이후 화합물의 수천까지 분석, 또는 관심의 단지 화합물의 클래스의 옵션을 사용하여 생체 액에서 대사 산물의 추출을 가능하게하는 엄격하고 심도있는 방법입니다 설명.

Metabolomics is an emerging field which enables profiling of samples from living organisms in order to obtain insight into biological processes. A vital ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 복잡한 생체 시료 내의 대사물을 효과적으로 분획하여 메타볼롬(metabolome) 분석 범위를 넓힐 수 있도록 단순화된 시료를 얻는 방법을 제시하는 것입니다. 이를 위해 먼저 각 시료에 내부 표준물질을 첨가하여 시료 조제 과정의 재현성과 기기 상태를 모니터링합니다. 두 번째 단계로, 각 시료에 얼음처럼 차가운 메탄올을 첨가하여 이후의 크로마토그래피 및 질량 분석법 분석을 방해할 수 있는 단백질을 침전시킵니다.다음으로, 액체-액체 추출 단계를 통해 친수성 대사물질과 소수성 대사물질을 분리합니다. 마지막 단계는 고상 추출로, 지질 대사물질을 인지질, 지방산 및 중성 지질로 더 세분화하여 분획하는 것입니다. 궁극적으로, 이 결합된 다단계 방법은 혈장 메타볼롬의 효율적인 분리, 우수한 재현성 및 개선된 커버리지를 보여주는 데 사용됩니다.단순 메탄올 추출과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 메타볼로믹스 프로파일링 연구를 수행하거나 지질에 특히 관심이 있는 경우에 중요한 지질을 포함하여 메타볼라이트 커버리지가 개선된다는 점입니다. 단백질 침전 전에 먼저 샘플을 실온에서 해동하여 준비하십시오. 그다음, 미리 준비한 내부 표준물질 ISTD를 샘플에 첨가하십시오.모든 표준 농도는 사용된 MS 및 HPLC 기기의 감도에 따라 필요에 맞게 조정되었습니다. 분석을 위해 각 시료에 10 µL를 첨가하십시오. 친수성 및 소수성 표준 용액 각각에 대해, 1배, 2배 또는 4배의 양성 대조군 용액 10 µL를 각 시료에 첨가하십시오.모든 시료에 내부 표준물질과 양성 대조군 용액을 첨가한 후, 각 시료를 10초 동안 볼텍싱합니다. 단백질 침전을 시작하려면 각 시료에 얼음처럼 차가운 methanol 400 µL를 넣습니다. 튜브당 10초 동안 볼텍싱한 후, 0 °C에서 18,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다.G, 튜브 바닥에 단백질 펠렛이 형성되어야 합니다. 원심분리 후 모든 상층액을 새로운 유리 배양 튜브로 옮긴 다음 질소 기류 하에서 건조합니다. 이렇게 건조된 잔류물은 이후에 액-액 추출 과정을 거치게 됩니다.단백질 펠릿 분획을 분석하려면, 흰색 또는 유백색의 단백질 펠릿에 1 mL의 methyl tert-butyl ether(MTBE)를 첨가하고 튜브당 30초 동안 볼텍싱한 후, 0 °C에서 18,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. MTBE 층을 새로운 유리 배양 튜브로 데칸트합니다. 샘플마다 펠릿의 크기가 다르므로, 모든 샘플에 대해 동일한 양의 MTBE를 일관되게 흡입하는 것이 중요합니다.예를 들어, 상청액의 양이 가장 적은 샘플에서 900 µL만 분리할 수 있다면 900 µL만 분리합니다. 모든 샘플에 대해, 단백질 펠렛에 MTBE 1 mL를 추가로 넣고 30초 동안 볼텍싱한 다음, 0 °C에서 15분 동안 원심분리합니다. 이전과 동일하게 18,000 ×g로 처리한 후 MTBE 층을 흡입하여 앞서 준비한 유리 배양 튜브에 추가합니다.질소 기류로 샘플을 건조시킨 후 1:1 클로로포름-메탄올 200 µL에 다시 현탁합니다. 각 샘플을 원심분리관으로 옮기고 0 °C에서 18,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 그 다음, 유리 피펫을 사용하여 상층액을 오토샘플러 스크류 캡 바이알로 옮깁니다. 이 절차를 시작하려면, 유리 피펫을 사용하여 앞서 준비한 건조된 메탄올 잔류물에 MTBE 3 mL를 첨가하고 30초 동안 볼텍싱합니다.그 후, 각 튜브에 750 µL의 물을 넣고 10초 동안 볼텍싱합니다. 상온에서 약 200 ×g로 10분 동안 원심분리하면 두 개의 뚜렷한 층이 나타납니다. 원심분리 후, 하단의 수성층이 섞이지 않도록 주의하여 상단의 MTBE 층 2.5 mL를 조심스럽게 흡입하여 깨끗한 유리 배양 용기에 옮깁니다. 각 샘플의 남은 수성 부분에 3 mL의 MTBE를 추가합니다.각 튜브를 10초 동안 볼텍싱한 후, 약 200 ×g에서 10분간 원심분리합니다. 실온에서 수층이 섞이지 않도록 주의하며 MTBE 3 mL를 흡입하여 이전의 MTBE 튜브와 합칩니다. 이 MTBE 분획은 나중에 고체상 추출 과정을 거치게 됩니다.질소 기류 하에서 건조하여 남은 수층을 농축하십시오. 잔류물을 100 µL의 용매에 재현탁하고, 각 튜브에 얼음처럼 차가운 methanol 400 µL를 추가하여 볼텍싱한 후, 마이크로 원심분리 튜브로 옮기십시오. -80 °C에서 20~30분 동안 방치하여 남아 있는 단백질이 methanol 내에서 침전되도록 하십시오.다음으로 0 °C에서 18,000 ×g로 15분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 튜브 벽면을 따라 침전물이 형성되어야 합니다. 침전물이 흡입되지 않도록 주의하며 상층액 450 µL를 취해 깨끗한 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 진공 원심 농축기에서 45 °C 이하의 온도로 약 1~2시간 동안 완전히 건조합니다. 건조된 상층액을 5% acetonitrile 수용액 200 µL에 재현탁한 후 보텍싱합니다.샘플을 빠르게 오토샘플러 바이알로 옮기고 -80 °C에서 냉동 보관합니다. 고상 추출 절차를 시작하려면, 이전에 얻은 MTBE 분획을 35 °C에서 질소 기류 하에 10~15분 동안 건조시킵니다. MTBE 분획이 완전히 건조되면 질소 흐름을 중단하고, 유리 피펫과 볼텍스를 사용하여 각 샘플을 1 mL의 클로로포름에 신속하게 재현탁합니다.고상 추출 또는 SPE 카트리지를 400 µL의 hexane으로 두 번 빠르게 세척 및 컨디셔닝합니다. 폐액을 버리고 새로운 유리 수집 튜브로 교체합니다. SPE 컬럼에 시료를 첨가하고, 진공을 가해 통과액을 수집합니다.유리 피펫을 사용하여 2:1 비율의 클로로포름-이소프로필 알코올 1 mL를 SPE 컬럼에 첨가하고, 통과액을 동일한 유리 튜브에 수집합니다. 이것이 중성 분획입니다. 중성 분획을 질소 기류 하에서 10~15분 동안 건조시킵니다.유리 피펫을 이용한 산화를 최소화하기 위해, SPE 컬럼에 5% acetic acid in ethyl ether 1 mL를 첨가하고 통과액을 수집합니다. 이것이 지방산 분획입니다. 플라스틱 팁을 사용하여 산화를 최소화하려면, 질소 기류 하에서 지방산 분획을 10~15분 동안 건조시킵니다.SPE 카트리지에 methanol 800 µL를 가하고 15 mL 플라스틱 원뿔형 튜브에 통과액을 수집하며, 이것이 인지질 분획입니다. 인지질 분획을 1.5 mL 원심분리 튜브로 옮기고, 진공 원심 농축기를 사용하여 45 °C에서 약 1~1.5시간 동안 샘플을 건조합니다. 마지막으로, 세 가지 분획의 각 샘플을 100% methanol 200 µL에 재현탁하여 오토샘플러 바이알로 옮긴 후, -80 °C 냉동고에 보관합니다.지질 표준물질과 내인성 대사체 모두를 추출하는 데 있어 M-T-B-E-S-P-E 방법의 효과는 정성 및 정량 소프트웨어를 사용하여 특징(feature) 수를 비교했을 때, 메탄올 추출이나 MTBE 단독 추출과 같은 다른 방법들에 비해 대사체의 추출 효율과 커버리지가 전반적으로 더 우수함을 통해 입증되었습니다. LC-MS 분석 결과, M-T-B-E-S-P-E 분획물을 비교했을 때 SPE 이후 세 분획물 간의 중첩이 최소화된 것으로 나타났으며, 이는 더 확실한 대사체 식별을 위해 소수성 대사체를 각각의 화학적 분류군으로 분리하는 효율성이 높음을 보여줍니다. 또한, M-T-B-E-S-P-E 방법을 사용한 분획물 내 내부 표준물질의 회수율 NR 12는 내부 표준물질이 해당 화학적 분류군과 관련된 분획물에 할당되었음을 입증하였습니다.데이터의 크로마토그래피 재현성을 평가하기 위해 세 개의 별도 풀링된 혈장 QC 샘플을 대상으로 샘플 조제를 수행하였으며, 각 샘플을 LCM MSS 기기에 세 번씩 반복 주입하였습니다. 일관된 중첩은 기기 및 샘플 조제의 재현성을 입증합니다. 지방산 분획의 음이온 모드에서 관찰된 화학적 노이즈의 증가는 LCM S 용매 내의 오염 물질로 인한 것일 수 있습니다.따라서 9분 이전에 검출된 대사산물만 분석하였습니다. 클로로포름, MTBE, 에틸 에테르 및 본 방법에서 사용되는 더욱 일반적인 시약들을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 항상 실험복, 장갑, 보호안경을 착용하고 흄 후드 내에서 시료 조제를 수행하는 등의 예방 조치를 취해야 한다는 점에 유의하십시오.

multi-step-preparation-technique-to-recover-multiple-metabolite

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

신진 대사를 통해 유전체학, 공동 발현 유전자 분석 및 대상 화합물의 식별의 조합은 유전자 기능 주석을 제공합니다.

결합 지노 믹스, Metabolomics와 정보학 통해 식물 유전자 기능의 주석

이 동영상은 대사 산물 프로파일링을 위해 유방암 세포 샘플을 준비하는 기술에 대해 설명합니다. 유방암 세포는 에스트로겐 수용체 알파에 결합하여 대사 산물 구성에 변화를 일으키는 에스트라디올로 치료됩니다.

Sample Preparation for Metabolomics: A Method to Prepare Cell Samples for Metabolitecs(대사체학을 위한 시료 준비: 대사체를 위한 세포 시료 전처리 방법)

질량분석법(UPLC-MS)과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 비표적 대사 산물 프로파일링은 대사를 조사하는 강력한 기술입니다.  이 문서에서는 시료 조직 및 준비, 데이터 수집, 데이터 분석, 품질 관리 및 대사 산물 식별을 포함하여 혈청의 비표적 대사 산물 프로파일링에 사용되는 일반적인 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

울트라 성능 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (UPLC-MS)에 의해 혈청 대규모 비 타겟 Metabolomic 프로파일

타겟이 불분명 한 대사는 대사 프로파일의 스냅 샷을 생성하는 가설을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈청 세포 또는 조직에서 대사 산물의 추출 및 분석을 보여줍니다. 대사 산물의 범위는 액체 - 액체 상 추출을 사용하여 조사하는, 마이크로 ultraperformance 액체 크로마토 그래피 / 차동 분석 소프트웨어에 결합 고해상도 질량 분석법 (UPLC-HRMS).

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

대사 산물 프로파일 링은 건강과 질병에있는 신진 대사의 연구에 소중한 자산이다. 극성 스위칭 및 급속한 듀티 사이클 고분해능 질량 분석법에 결합 통상 대별 액체 크로마토 그래피를 이용해서, 우리는 높은 감도, 정밀도 및 해상도를 가진 생물학적 물질의 극성 대사 조성을 분석하는 프로토콜을 기술한다.

민감한, 대규모 양적 대사 체학을위한 전략

단백질 대사 산물 및 단백질-단백질 상호 작용은 모든 세포 기능에 중요 한. 여기, 우리는 선택의 이러한 상호 작용 단백질으로의 병렬 분석을 허용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 식물 세포 배양에 대 한 최적화 되었습니다 및 질량 분석 기반 단백질 및 대사 산물 검출 친 화력 정화를 결합 했다.

2 1: 원스텝 단백질 단백질과 단백질 대사 산물 단지의 병렬 분석에 대 한 친 화력 정화

이 프로토콜 자연 유기 물질과 다른 생태계에서 미생물 단백질의 완전 한 쌍 특성에 culminating 보완 분석 및 omics 기술에 대 한 단일 처리량을 설명 합니다. 이 이렇게 강력한 비교 대사 경로 및 변환을 설명 하는 온실 가스 생산 및 환경 변화에 대 한 응답을 예측에 대 한 중요 한 식별 수 있습니다.

복잡 한 자연 유기 물질 혼합물을 특성화에 대 한 단일 처리량 보완 고해상도 분석 기법

이 프로토콜에서는 많은 샘플의 효율적이고 빠른 샘플 준비를 결합한 최적화된 워크플로를 제시합니다. 또한, 대사 GWAS 연구의 고처리량 평가를 위한 분석 변형을 줄이기 위한 단계별 가이드를 제공합니다.

대규모 다중 오믹스 게놈 전체 연관 연구 (Mo-GWAS) : 샘플 준비 및 정상화에 대한 지침

우리는 XY-Meta와 metaX를 함께 통합하는 표적화되지 않은 대사 산물 워크 플로우를 구축했습니다. 이 프로토콜에서는 XY-Meta를 사용하여 오픈 액세스 스펙트럼 참조에서 데코이 스펙트럼 라이브러리를 생성하는 방법을 표시 한 다음 FDR 제어를 수행하고 대사체 스펙트럼을 확인한 후 metaX를 사용하여 대사 산물을 정량화했습니다.

FDR 제어 기반 비표적 메타볼로임에 대한 식별 및 정량화의 통합 워크플로우

이 프로토콜은 휘발성 염 용액 세척, 급속 액체 질소 담금질, 동결 건조 및 -8°C 저장을 결합하여 단일 세포 질량 분석법(SCMS)을 위한 세포 대사 산물을 보존하는 것을 목표로 합니다. 이는 액체 질소 담금질이 대사 산물 프로필을 유지하는 데 필수적이며, 대사 변화를 방지하기 위해 장기간 냉장 보관을 최소화해야 함을 보여줍니다.

단일 세포 질량 분석법 대사체학 연구를 위한 시료 전처리: 결합된 세포 세척, 담금질, 건조 및 보관

학습하세요 복잡한 생물학적 유체에서 대사산물을 분리하는 다단계 추출법을 통해 지질 대사체 커버리지를 개선하는 방법을. 이 기술은 대사체학 프로파일링 연구에 필수적인 재현성과 신뢰성을 제공합니다.

심층하고 유익한 대사 체 분석을위한 여러 대사 산물 화합물 클래스를 복구하려면 여러 단계의 제조 기술

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