심층하고 유익한 대사 체 분석을위한 여러 대사 산물 화합물 클래스를 복구하려면 여러 단계의 제조 기술

이 절차의 전반적인 목표는 대사체의 적용 범위를 개선하기 위해 단순화된 샘플을 얻기 위해 복잡한 생물학적 유체에서 대사 산물을 분획하는 효과적인 방법을 입증하는 것입니다. 이는 먼저 각 샘플에 내부 표준물질을 스파이크하여 샘플 준비 및 기기 상태의 재현성을 모니터링함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 각 샘플에 얼음처럼 차가운 메탄올을 첨가하여 단백질을 침전시키는 것인데, 그렇지 않으면 후속 크로마토그래피 및 질량 분석법을 통한 분석을 방해할 수 있습니다.

다음으로, 액체 액체 추출 단계는 친수성 대사 산물로부터 친수성 대사 산물을 분리합니다. 마지막 단계는 지질 대사 산물을 인지질, 지방산 및 중성 지질로 추가로 분류하기 위한 고체상 추출입니다. 궁극적으로, 이 결합된 다단계 분석법은 효과적인 분리, 우수한 재현성 및 혈장 대사체의 향상된 적용 범위를 보여주는 데 사용됩니다.

간단한 메탄올 추출과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 특히 지질의 대사 산물 적용 범위를 개선한다는 것이며, 이는 대사체학 프로파일링 연구를 수행하거나 지질에 특히 관심이 있을 때 중요합니다. 단백질 침전 전에 먼저 샘플을 준비하여 실온에서 샘플을 해동합니다. 다음으로, 사전에 준비된 내부 표준 ISTD로 샘플을 스파이크합니다.

모든 표준 농도는 사용된 MS 및 HPLC 기기의 감도에 따라 필요에 따라 조정되었습니다. 분석을 위해 각 샘플에 10마이크로리터를 스파이크합니다. 친수성 및 소수성 표준 용액 각각은 각 샘플에 10마이크로리터의 1 x 2 x x 또는 4 x 양성 대조 용액을 스파이크합니다.

모든 샘플에 내부 표준물질과 양성 대조군 용액을 주입한 후 각 샘플을 10초 동안 볼렉스합니다. 단백질 침전을 시작하려면 각 샘플에 400마이크로리터의 얼음처럼 차가운 메탄올을 추가합니다. 관 당 10 초 동안 와동, 0 섭씨 온도에 15 분 동안 18, 000 시간 원심 분리기.

G, 튜브 바닥에 단백질 펠릿이 형성되어야 합니다. 원심분리 후 모든 상층액을 새로운 유리 배양 튜브로 옮긴 다음 질소로 건조시킵니다. 이 건조된 잔류물은 나중에 액체 액체 추출을 거칩니다.

단백질 펠릿 조각의 분석을 위해, 메틸 turt 딱정벌레 에테르 MTBE의 1 밀리리터를 백색 회백색 단백질 펠릿 와동에 관 당 30 초 동안 추가하고 0 섭씨 온도에 18, 000 시간에 15 분 동안 원심분리하십시오. G MTBE 층을 새로운 유리 배양 튜브로 디캔팅합니다. 펠릿의 크기는 샘플마다 다르기 때문에 모든 샘플에 대해 동일한 양의 MTBE를 일관되게 흡인하는 것이 중요합니다.

예를 들어, 가장 적은 양의 상등액으로 샘플에 대해 900마이크로리터만 디캔팅할 수 있는 경우 900마이크로리터를 디캔팅할 수 있습니다. 모든 샘플에 대해 30초 동안 단백질 펠릿 와류에 MTBE 1밀리리터를 더 첨가한 다음 섭씨 0도 또는 15분에서 원심분리합니다. 18, 000 시간 G를 전에 것과 같이 추가하고, MTBE 층을 흡인하고, 이전에 준비된 유리제 배양 관에 추가하십시오.

질소 흐름으로 샘플을 건조시키고 200 마이크로 리터의 일대일 클로로포름 메탄올에 재현탁시킵니다. 18, 000 시간 G.After, 자동 견본러 나사 모자 작은 유리병에 상등액을 옮기기 위하여 15 분 동안 0 섭씨 온도에 분리기 및 분리기 및 분리기 각각을 원심분리기 관과 분리기로 옮기십시오. 이 절차를 시작하려면 유리 피펫을 사용하여 이전에 준비한 건조된 메탄올 잔류물에 3ml의 MTBE를 추가하고 30초 동안 와류시킵니다.

그런 다음 각 튜브에 750마이크로리터의 물을 넣고 10초 동안 소용돌이칩니다. 실온에서 약 200배 G로 10분 동안 원심분리기를 하면 두 개의 뚜렷한 층이 보입니다.원심분리 후 아래의 수성층을 피펫팅하지 않고 상단 MTBE 층 2.5ml를 조심스럽게 흡입하고 깨끗한 유리 배양으로 옮깁니다. 2. 각 샘플의 남은 물 부분에 MTBE 3ml를 추가합니다.

그리고 튜브 당 10초 동안 와류를 일으키고, 약 200배 G에서 10분 동안 원심분리기를 합니다. 실온에서 물을 얻지 않고 3ml의 MTBE를 흡입하고 이전 MTBE 튜브와 결합하십시오. 이 MTBE 분획은 나중에 고체상 추출을 거칠 것입니다.

질소 하에서 건조하여 나머지 수층을 농축합니다. 잔류물을 100마이크로리터에 재현탁시키고 각 튜브 와류에 400마이크로리터의 얼음처럼 차가운 메탄올을 첨가한 다음 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 섭씨 영하 80도에서 20-30분 동안 그대로 두어 남은 단백질이 메탄올에 침전될 수 있도록 합니다.

18, 000 시간 G에 15 분 동안 0 섭씨 온도에 다음 분리기는 침전물을 흡인하고 청결한 마이크로 분리기 관에 이동 없이 상등액의 450 마이크로리터를 흡인한 후에 관의 측을 따라서 침전물이 있어야 합니다. 섭씨 45도 이하의 진공 원심 농축기에서 약 1-2시간 동안 완전히 건조시킵니다. 건조된 상등액을 200마이크로리터의 5%아세틸 니트릴 물과 와류에 재현탁합니다.

샘플을 자동, 샘플러, 바이알로 간단히 옮기고 섭씨 영하 80도에서 얼립니다. 고체상 추출 절차를 시작하려면 이전에 얻은 MTBE 분획을 섭씨 35도에서 섭씨 10도에서 15분 동안 질소의 양호한 흐름으로 건조합니다. MTBE 분획이 완전히 건조되면 질소의 흐름을 중지하고 유리 피펫 와류를 사용하여 각 시료를 1ml의 클로로포름에 신속하게 재현탁시킵니다.

고체상 추출 또는 SPE 카트리지를 400마이크로리터의 헥산으로 두 번 간단히 세척하고 컨디셔닝합니다. 폐기물을 버리고 새 유리 수집 튜브로 교체하십시오. SPE 컬럼에 샘플을 추가하고 진공을 적용한 다음 흐름을 수집합니다.

유리 피펫을 사용하여 1ml의 2-1 클로로포름 이소프로필 알코올을 SPE 컬럼에 추가하고 동일한 유리관에 흐름을 수집합니다. 이것은 중립 부분입니다. 중성 분획을 질소에서 10-15분 동안 건조시킵니다.

유리 피펫으로 산화를 최소화하려면 에틸 에테르에 함유된 5% 아세트산 1ml를 SPE 컬럼에 첨가하고 흐름을 수집합니다. 이것은 지방산 분획입니다. 지방산 분획을 질소 아래에서 10-15분 동안 건조시켜 플라스틱 팁을 사용하여 산화를 최소화합니다.

SPE 카트리지에 800마이크로리터의 메탄올을 추가하고 15밀리리터 플라스틱 원추형 튜브를 통해 흐름을 수집합니다. 이것이 인지질 분획입니다. 인지질 분획을 1.5 밀리리터 원심분리 튜브로 옮기고, 섭씨 45도의 진공 원심 농축기로 약 1-1.5시간 동안 샘플을 건조시킵니다. 마지막으로, reus는 200 마이크로 리터의 100 % 메탄올에 3 개의 분획에서 각 샘플을 현탁시켜 자동차, 샘플러, 바이알로 전달하고 섭씨 80도의 음의 냉동고에 보관합니다.

지질 표준물과 내인성 대사 산물을 모두 추출하는 데 있어 M-T-B-E-S-P-E 방법의 효과는 정성적 및 정량적 소프트웨어를 사용하여 기능 수를 비교했을 때 메탄올 추출 또는 MTBE 전용 추출과 같은 다른 방법에 비해 대사 산물의 추출 및 적용 범위가 전반적으로 더 우수하다는 것이 입증되었습니다. lc MS 분석 후 M-T-B-E-S-P-E 분획을 비교한 결과 SPE 다음에 나오는 세 분획 간의 중복이 최소화된 것으로 나타났으며, 이는 보다 신뢰할 수 있는 대사 산물 식별을 위해 소수성 대사 산물을 각각의 화학 등급으로 분리하는 데 있어 효율성을 보여줍니다. 또한, M-T-B-E-S-P-E 방법, NR 12를 사용하여 분획에서 내부 표준물질을 복구한 것은 내부 표준물질이 화학 등급과 관련된 분획에 암시되었음을 보여주었습니다.

데이터의 크로마토그래피 재현성을 평가하기 위해 3개의 개별 풀링 혈장 QC 샘플에서 샘플 준비를 수행하고 각 샘플을 LCM MSS 기기에 3회 주입했습니다. 일관된 중복은 기기 및 시료 전처리 재현성을 보여줍니다. 지방산 분획의 음이온화 모드에서 관찰된 화학적 노이즈의 증가는 LCM S 용매의 오염 물질로 인한 것일 수 있습니다.

따라서 9분 이전에 언급된 대사 산물만 분석했습니다. 클로로포름, MTBE, 에틸 에테르 및 이 방법에 사용되는 더 일반적인 시약으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 실험실 가운, 장갑 및 보안경을 착용하고 흄 후드에서 샘플 준비를 수행하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.