Morphologically- 및 Neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음

이 절차의 전반적인 목표는 확인된 해마 파브알부민 양성 인터 뉴런에서 GABA B 수용체 매개 효과를 특성화하는 것입니다. 이것은 먼저 고품질의 급성 해마 조각을 생산함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 비디오 현미경을 사용하여 정맥 YFP 발현과 paral albumin positive neuron의 알려진 특성을 기반으로 뉴런을 선택하는 것입니다.

다음으로, 전체 세포 패치 클램프 기록을 얻고 세포 외 자극 또는 쌍을 이루는 기록을 사용하여 GABA B 수용체 매개 효과를 조사합니다. 마지막 단계는 뉴런을 시각화하고 기록된 뉴런이 실제로 파 알부민 양성이며 파라체세포 또는 수지상 억제 뉴런인지 확인하는 것입니다. 궁극적으로 이 방법은 GABA B 수용체 매개 억제 효과의 특성화를 가능하게 하고 기록된 뉴런 사이를 명확하게 분류할 수 있습니다.

이 방법은 인터 뉴런 필드의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 예를 들어, 뉴런 간 세포가 어떻게 서로 소통하는지, 흥분성, 시냅스 출력이 신경 조절 시스템에 의해 어떻게 제어되는지. 이 방법은 GABAergic, 해마의 뉴런 제어에 대한 통찰력을 제공하지만 다른 뇌 영역, 신경 조절 시스템 또는 세포 유형에도 적용할 수 있습니다.

17-24 일 된 형질 전환 쥐에서 반냉동 탄수화물 자당에 보관 형광 정맥 YFP를 발현하는 형질 전환 쥐의 뇌를 가져 가고, 메스를 사용하여 CSF를 사용하고, 피질의 전두엽 3 분의 1, 소뇌를 제거하고, 반구를 분리합니다. 피질의 등쪽 표면을 제거하여 절단을 위해 뇌를 붙일 수 있는 평평한 표면을 제공합니다. 반구를 viome 단계에 접착제로 붙이고, viome bath를 rozen carbogen native sucrose로 채웁니다.

CSF는 해마 형성의 300마이크로미터 가로 조각을 절단했습니다. 각 슬라이스를 섭씨 35도의 탄수화물 자당, A CSF가 들어 있는 수중 보관실로 옮깁니다. 30 분 : 데운 자당에 마지막 조각을 넣은 후, CSF는 보관을 위해 조각을 실온으로 옮깁니다.

유리 모세관에서 패치 피펫을 당겨 2-4메가옴의 피펫 저항을 달성합니다. 채워지면 해마 조각을 녹음실로 옮기고 실크 단일 섬유로 묶인 백금 고리로 제자리에 고정합니다. 챔버를 레코딩 셋업에 배치하고 분당 5-10밀리리터의 유속으로 카보겐 가온 레코딩 A CSF로 관류를 시작합니다.

비디오 카메라를 사용하여 40배 대물렌즈 배율에서 I-R-D-I-C 광학 장치의 슬라이스 품질을 평가합니다. 슬라이스의 품질이 좋다고 가정합니다. 많은 수의 둥글고 적당히 대비되는 경우 ca one parametal cell은 매끄럽고 가볍게 분화구가 있는 표면 아래 20-30마이크로미터 깊이의 stratum 매개변수에서 볼 수 있습니다.

epi 형광 조명을 사용하여 추정되는 빠른 스파이크 인터 뉴런을 parama 층 내부 또는 근처에서 큰 다극 체세포를 가진 정맥 YFP를 발현하는 뉴런으로 식별합니다. 다음으로, 시냅스 후 전류를 식별하기 위해 생리학적으로 관련성이 낮은 염화물 농도가 포함된 용액으로 패치 피펫을 채우고 헤드 스테이지의 피펫 홀더에 놓습니다. 그런 다음 튜브 라인을 통해 낮은 양압을 가합니다.

피펫을 슬라이스 표면으로 내리고 선택한 뉴런의 중심에서 약간 오프셋합니다. 압력을 70 - 80mbar로 높이고 슬라이스를 통해 선택한 세포의 소마 바로 위까지 피펫을 빠르게 낮춥니다. 피펫을 세포막에 대고 눌러 딤플을 만듭니다.

이 단계를 신속하게 수행합니다. 인접 세포의 비오틴 표지를 방지하려면 압력을 해제하고 동시에 파이펫에 음의 20mV 전압 명령을 적용하여 기가 옴 씰을 만듭니다. 밀봉이 시작되면 전압 명령을 일반적으로 음의 70에서 음의 60밀리볼트 사이의 예상되는 휴지 멤브레인 전위로 줄입니다.

이제 짧은 음압 펄스를 가하여 멤브레인 패치를 파열시켜 전체 세포 구성을 달성합니다. 전류 클램프 모드를 사용하여 과분극 및 탈분극 전류 펄스에 대한 계열에 대한 반응으로 빠르게 스파이크하는 뉴런을 식별합니다. 시냅스로 유발된 반응을 관찰하려면 라듐층(stratum radium)과 라움층(latum laun oum) 분자 기록의 경계에 있는 슬라이스에 세포외 자극 전극을 배치합니다.

전압 클램프 모드에서는 절연 정전압 자극기를 사용하여 20초마다 5개의 50볼트 전기 자극의 단일 또는 200헤르츠 트레인을 시냅스 전 축삭에 전달합니다. 다음으로, 이온성 글루타메이트 수용체 길항제를 수조에 적용하여 분리된 모노를 드러냅니다. 시냅스 IPSC.

GABA A 수용체 길항제의 적용으로 GABA B 수용체 매개 IPSC를 추가로 분리합니다. 페어링된 녹음을 시작합니다. 먼저, 이전과 같이 pre-synaptic inter neuron의 전체 세포 기록을 확립하고 fast spiking 표현형을 확인합니다.

다음으로, 시냅스전 뉴런을 보유하고 있는 인터 뉴런으로부터 20-100마이크로미터 거리 내에 있는 CA 1 파라메탈 세포를 패치합니다. 현재 클램프 모드에서. 간단한 SRA 임계값 탈분극 전류 펄스를 적용하여 인터 뉴런에서 활동 전위를 유도합니다.

시냅스 연결이 존재하는 경우, 인터 뉴런의 활동 전위는 전압 클램핑 ca 하나의 파라메탈 세포에서 IPC를 생성합니다. 연결이 설정되면 50밀리초 간격으로 두 개의 탈분극 자극의 일반적인 쌍을 이루는 펄스 프로토콜로 시냅스 전 빠른 스파이크 인터 뉴런에서 활동 전위 쌍을 유도합니다. 대조군 흔적을 수집한 후, 선택적 GABA B 수용체 작용제 바클로펜을 관류 A CSF에 적용하여 GABA B 수용체를 활성화합니다.

다음으로, 길항제 CGP 55 8 45를 적용하여 수용체 매개 효과를 완전히 차단합니다. 기록이 완료되면 전압 클램프에서 세포체에서 피펫을 천천히 빼냅니다. 시리즈에서 측정된 저항이 증가함에 따라 멤브레인 전압을 마이너스 40밀리볼트로 줄여 외부 아웃 패치를 형성하여 체세포막을 밀봉합니다.

녹음에 이어 섭씨 4도 세척 인산염 완충액이 있는 4% 파라 포름알데히드에 하룻밤 동안 인산염 완충액을 담근 다음 인산염 완충 식염수에 담그고 실온에서 1시간 동안 10% 일반 염소 혈청 0.03% 트리톤 X 100 및 0.05% 아지드화나트륨으로 차단하여 파 알부민 발현을 위해 라벨을 붙입니다. PBS에 5% 정상 염소 혈청 0.3% TRITTON X 100 및 0.05% 아지드화나트륨을 함유한 용액에 희석된 안티 파브알부민 단클론 마우스 항체를 사용하여 섭씨 4도에서 2-3일 동안 1차 항체를 배양합니다. 배양 후, PBS에서 슬라이스를 철저히 헹구고, 형광 색소에 접합된 비오틴 결합 단백질 스트립핀과 함께 형광 항미 2차 항체를 바르고, PBS에 희석된 3% 일반 염소 혈청 0.1% 트리톤 X 100 및 0.05% 나트륨을 함유한 용액에서 배양하고, 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음 날, PBS로 슬라이스를 2-3회 넉넉히 헹구고 인산염 완충액으로 2-3회 헹굽니다.

슬라이스를 유리 슬라이드에 장착하고 300마이크로미터 한천 스페이서를 사용하여 슬라이스가 무너지는 것을 방지합니다. 그런 다음 뚜껑을 덮고 형광 장착 매체로 조각을 밀어 넣고 네일 바니시로 밀봉합니다. 높은 배율과 개구수로 inter neuron의 par 알부민 면역 반응을 평가합니다.

대물렌즈 세포는 파 알부민에 대해 면역 반응성이 있는 것으로 간주됩니다. 면역 표지가 비오틴 표지 구조와 일치하는 것으로 확인되면 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 Z축 일련의 이미지를 촬영하여 형태학적 식별 및 3차원 재구성을 위해 형광 Aden을 이미징합니다. 그런 다음 수상돌기 및 축삭 arborization을 통합하여 이미지를 3차원으로 뉴런으로 재구성합니다.

단일 세포외 자극에 대한 반응으로 빠르게 스파이크하는 뉴런 사이의 복합 시냅스 반응이 여기에 나와 있습니다. 이온성 글루타메이트 수용체 길항제, DNQX 및 PV 분리제의 적용, 가바 수용체 길항제의 모노 시냅스 억제 시냅스 후 전류 또는 IPSC 적용. Gazin은 IPSC의 빠른 구성 요소를 폐지했습니다.

5개의 자극으로 구성된 일련의 반응은 IPSC를 매개하는 느린 GABA B 수용체를 나타냈으며, 이는 CGP의 후속 적용에 의해 차단되었습니다. 이러한 흔적은 목욕 후 제어 조건하에서 CA 1 파라메탈 세포의 시냅스 전, 빠른 스파이크 인터 뉴런 및 짧은 잠복 유니터리 I PSC의 활동 전위, 바클로펜의 적용 및 CGP의 후속 적용을 보여줍니다. 바클로펜은 IPSC 진폭을 약 50% 감소시키는 반면, GABA B 수용체 길항제는 IPSC 진폭을 거의 완전히 회복시켰습니다.

IPSC 진폭의 시간 코스 플롯은 20 배 배율로 표시된 바클로 펜과 CGPA 빠른 스파이크 인터 뉴런의 효과를 보여 주며, 모수 돌기가 수직으로 달리고 모든 층에 걸쳐 있는 ca 한 지역의 라듐 지층 및 파라마 인형의 경계에 위치한 소마타를 가졌습니다. 축삭돌기의 대부분은 바구니 세포의 전형적인 세포체 층 안팎에서 발견되지만, 60배 확대 이미지는 주황색 별표로 표시된 추정 ca one parametal salata 주위에 형성되는 전형적인 축삭 바구니를 보여줍니다. 동일한 inter neuron의 3차원 재구성은 여기에 나와 있으며 soma와 dendrites는 검은색으로, axon은 빨간색으로 표시됩니다.

ca one의 레이어는 마스터되면 파란색으로 표시됩니다. 이 기술은 개발 후 한 번에 여러 슬라이스에 대해 수행되는 박사 후 과정 분석을 통해 하루 만에 수행할 수 있습니다. 이 결합된 접근 방식은 해마 및 피질 미세 회로 연구자들이 형태학적 생리학적 다양성뿐만 아니라 뉴런 간 유형의 구조 기능 상호 관계를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.