Morphologically- 및 Neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음

본 절차의 전반적인 목적은 식별된 해마 파발부민(parvalbumin) 양성 인터뉴런에서 GABA B 수용체 매개 효과를 규명하는 것입니다. 이는 먼저 고품질의 급성 해마 슬라이스를 제작함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로는 비디오 현미경을 사용하여 정맥 YFP 발현과 파발부민 양성 뉴런의 알려진 특성을 바탕으로 뉴런을 선택하는 것입니다.

다음으로 전체 세포 패치 클램프 기록을 얻으며, 세포 외 자극 또는 쌍 기록(paired recordings)을 사용하여 GABA B 수용체 매개 효과를 조사합니다. 마지막 단계는 뉴런을 시각화하여 기록된 뉴런이 실제로 par albumin 양성이며, 세포체 주위 또는 수지상 돌기 억제성 뉴런임을 확인하는 것입니다. 궁극적으로, 이 방법은 GABA B 수용체 매개 억제 효과의 특성 분석을 가능하게 하며, 기록된 중간 뉴런의 명확한 분류를 가능하게 합니다.

이 방법은 중간 뉴런(inter neuron) 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 제시할 수 있습니다. 예를 들어, 중간 뉴런들이 서로 어떻게 소통하는지, 그리고 이들의 흥분성과 시냅스 출력이 신경조절 시스템에 의해 어떻게 제어되는지 등이 있습니다. 본 방법은 해마 중간 뉴런의 GABA성 제어에 대한 통찰을 제공하지만, 다른 뇌 영역, 신경조절 시스템 또는 세포 유형에도 적용될 수 있습니다.

반냉동 상태의 carbogen sucrose-A CSF에 보관된, 형광 정맥 YFP를 발현하는 17~24일령 형질전환 쥐의 뇌를 꺼냅니다. 메스를 사용하여 피질의 앞쪽 1/3과 소뇌를 제거하고, 양쪽 반구를 분리합니다. 절편 제작을 위해 뇌를 고정할 수 있는 평평한 면을 만들기 위해 피질의 등쪽 표면을 제거합니다. rozen carbogen native sucrose가 채워진 viome bath가 있는 viome stage 위에 반구를 접착하여 고정합니다.

A CSF를 사용하여 해마 형성체의 300 µm 두께 횡단 절편을 제작합니다. 각 절편을 35 °C의 carbogen sucrose A CSF가 담긴 침지 보관 챔버로 옮깁니다. 마지막 절편을 가온된 sucrose A CSF에 넣은 후 30분 뒤에, 보관을 위해 절편들을 상온으로 옮깁니다.

유리 모세관에서 패치 피펫을 뽑아 2~4 MΩ의 피펫 저항을 확보합니다. 피펫을 채운 후, 단일 실크 섬유로 고정된 백금 링을 사용하여 해마 절편을 기록 챔버로 옮겨 고정합니다. 챔버를 기록 장치에 설치하고, 5~10 mL/min의 유속으로 가온된 carbogen recording A CSF를 사용하여 관류를 시작합니다.

40배 대물렌즈 배율의 I-R-D-I-C 광학계에서 비디오 카메라를 사용하여 슬라이스 품질을 평가하십시오. 슬라이스 품질이 양호하다고 가정합니다. 매끄럽고 가벼운 분화구가 있는 표면에서 20~30 µm 깊이의 stratum parameter에서 적당한 대비를 가진 둥근 ca one parametal 세포가 다수 관찰되는지 확인하십시오.

에피 형광 조명을 사용하여 stratum pyramidale 내부 또는 근처에 크고 다극성인 세포체를 가지며 YFP를 발현하는 세포를 추정되는 fast spiking 중간뉴런으로 식별합니다. 다음으로, 시냅스 후 전류를 식별하기 위해 낮고 생리학적으로 적절한 염화물 농도를 포함하는 용액을 패치 피펫에 채우고 이를 헤드 스테이지의 피펫 홀더에 장착합니다. 그 후 튜브 라인을 통해 낮은 양압을 가합니다.

피펫을 절편 표면으로 내린 후, 선택한 뉴런의 중심에서 약간 벗어난 위치에 맞춥니다. 압력을 70~80 millibars로 높이고, 피펫을 절편을 통해 빠르게 내려 선택한 세포의 soma 바로 위까지 이동시킵니다. 피펫을 세포막에 밀착시켜 막에 작은 홈(dimple)을 만듭니다.

이 단계를 신속하게 수행하십시오. 인접한 세포에 비오틴 표지가 되는 것을 방지하기 위해, 압력을 해제함과 동시에 피펫에 -20 mV의 전압 명령을 가하여 기가옴 씰(giga ohm seal)을 형성하십시오. 씰 형성이 시작되면, 전압 명령을 일반적으로 -70 mV에서 -60 mV 사이인 예상 휴지 막전위로 낮추십시오.

이제 짧은 음압 펄스를 가해 멤브레인 패치를 파열시켜 전세포(whole cell) 구성을 완성합니다. 전류 클램프 모드를 사용하여, 과분극에서 탈분극에 이르는 일련의 전류 펄스에 대한 반응을 통해 빠르게 스파이킹하는 인터뉴런을 식별합니다. 시냅스 유발 반응을 관찰하려면, 슬라이스의 stratum radiatum과 stratum lacunosum 경계 부위에 세포 외 자극 전극을 배치하십시오.

전압 클램프 모드에서, 절연된 정전압 자극기를 사용하여 20초마다 전시냅스 축삭에 50 volt 전기 자극을 단일 펄스로 또는 5회로 구성된 200 hertz 열(train) 형태로 전달합니다. 다음으로, 단독 모노시냅스 억제성 사후시냅스 전류(IPSC)를 확인하기 위해 이온성 글루타메이트 수용체 길항제를 배양액에 처리합니다.

GABA_A 수용체 길항제를 처리하여 GABA_B 수용체 매개 IPSC를 추가로 분리합니다. 쌍 기록(paired recording)을 시작하려면, 우선 이전과 동일하게 시냅스 전 인터뉴런의 전체 세포 기록(whole cell recording)을 수행하고 fast spiking 표현형을 확인하십시오.

다음으로, 시냅스 전 인터뉴런을 잡고 있는 인터뉴런으로부터 20 to 100 µm 거리 내에 있는 CA1 피라미드 세포를 패치합니다. 전류 클램프 모드에서, 인터뉴런의 활동 전위를 유도하기 위해 짧은 SRA 임계값 탈분극 전류 펄스를 가합니다.

시냅스 연결이 존재하면, 중간 뉴런의 활동 전위는 전압 클램핑된 ca one parametal 세포에서 IPC를 유발합니다. 연결이 확인되면, 50 millisecond 간격의 탈분극 자극 두 번으로 구성된 전형적인 paired pulse 프로토콜을 사용하여 시냅스 전 fast spiking 중간 뉴런에서 쌍의 활동 전위를 유도합니다. 대조군 트레이스를 수집한 후, 관류 중인 A CSF에 선택적 GABA B 수용체 작용제인 baclofen을 투여하여 GABA B 수용체를 활성화합니다.

다음으로, 수용체 매개 효과를 완전히 차단하기 위해 길항제 CGP 55 8 45를 처리합니다. 기록이 완료되면 전압 클램프 상태에서 세포체로부터 피펫을 천천히 회수합니다. 직렬 측정 저항이 증가함에 따라, 막 전압을 -40 mV로 낮추어 outside-out 패치를 형성함으로써 세포체 막을 밀봉합니다.

기록이 완료된 후, 슬라이스를 4°C에서 하룻밤 동안 0.1 M 인산염 완충액이 포함된 4% 파라포름알데히드에 침전시켜 고정하고, 인산염 완충액으로 세척한 다음 인산염 완충 식염수로 세척합니다. 이어서 10% 정상 염소 혈청, 0.03% TRITTON X 100 및 0.05% Sodium azide를 사용하여 실온에서 1시간 동안 블로킹합니다. par albumin 발현을 표지하기 위해, 5% 정상 염소 혈청, 0.3% TRITTON X 100 및 0.05% Sodium azide가 포함된 PBS 용액에 희석한 anti parvalbumin 단클론 마우스 항체를 사용하며, 1차 항체를 4°C에서 2~3일 동안 반응시킵니다. 반응 후 슬라이스를 PBS로 충분히 헹구고, 형광 anti-US 2차 항체와 형광색소가 접합된 비오틴 결합 단백질 스트렙타비딘을 함께 처리한 후, 3% 정상 염소 혈청, 0.1% tritton X 100 및 0.05% Sodium azide가 PBS에 희석된 용액 내에서 4°C로 하룻밤 동안 반응시킵니다. 다음 날, 슬라이스를 PBS로 2~3회 충분히 헹군 후 인산염 완충액으로 2~3회 다시 헹굽니다.

절편을 유리 슬라이드에 고정하고, 절편이 뭉쳐지는 것을 방지하기 위해 300 µm 아가 스페이서를 사용합니다. 그 다음, 형광 마운팅 매질을 사용하여 절편을 커버 슬립으로 덮고 네일 바니시로 밀봉합니다. 고배율 및 수치 구경을 이용하여 인터 뉴런의 par albumin 면역 반응성을 평가합니다.

수정체 렌즈 세포가 par albumin에 대해 면역 반응성이 있는 것으로 간주됩니다. 면역 표지가 비오틴 표지 구조와 일치하는 것이 확인되면, 형태학적 식별 및 3차원 재구성을 위해 형광 Aden을 이미지화하여 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 Z축 일련의 이미지를 촬영하십시오. 그런 다음 수지상 돌기와 축삭 분지를 포함하여 해당 이미지를 3차원 뉴런으로 재구성하십시오.

단일 세포외 자극에 대한 fast-spiking 중간 뉴런의 복합 시냅스 반응이 여기에 제시되어 있습니다. 이온성 글루타메이트 수용체 길항제인 DNQX와 APV를 처리하여 단일 시냅스 억제성 시냅스 후 전류(IPSC)를 분리하였으며, GABAA 수용체 길항제인 가진(Gazin)을 처리하여 IPSC의 빠른 성분을 제거하였습니다.

5회의 자극 열을 통해 GABA B 수용체 매개 IPSC가 서서히 나타났으며, 이는 이후 CGP를 처리함으로써 차단되었습니다. 이 트레이스들은 대조군 조건, baclofen의 배스 처리, 그리고 이어서 CGP를 처리한 후의 시냅스 전 fast spiking 인터뉴런의 활동 전위와 CA1 피라미달 세포의 짧은 잠복기 단위 IPSC를 보여줍니다. baclofen은 IPSC 진폭을 약 50% 감소시킨 반면, GABA B 수용체 길항제는 IPSC 진폭을 거의 완전히 회복시켰음에 유의하십시오.

IPSC 진폭의 시간 경과 그래프는 baclofen과 CGPA의 효과를 보여줍니다. 20배 배율로 관찰된 fast spiking inter neuron은 수지상 돌기가 수직으로 뻗어 모든 층에 걸쳐 있으며, 세포체는 CA1 영역의 stratum radiatum과 stratum pyramidale 경계에 위치하고 있습니다. basket cell의 전형적인 특징과 같이 축삭의 대부분은 세포체 층 내부 및 주변에서 발견되며, 60배 배율 이미지에서는 주황색 별표로 표시된 추정 CA1 pyramidal cell 주변으로 축삭이 전형적인 바구니 형태를 이루고 있음을 보여줍니다. 동일한 inter neuron의 3차원 재구성 이미지가 여기에 제시되어 있으며, 세포체와 수지상 돌기는 검은색으로, 축삭은 빨간색으로 표시되었습니다.

CA1의 층들은 파란색으로 구분되어 있습니다. 이 기술을 숙달하면, 개발 이후 여러 개의 절편을 한꺼번에 분석하여 박사후 연구원 수준의 형태학적 분석을 하루 만에 수행할 수 있습니다. 이러한 통합적 접근 방식은 해마 및 피질 미세 회로 연구자들이 인터뉴런 유형의 형태적, 생리적 다양성과 구조-기능 간의 상호 관계를 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.