Name: Morphologically- 및 Neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 37 s
Description: 학습하세요 해마 parvalbumin 양성 interneuron에서 GABA B 수용체 매개 효과를 특성화하는 전체 세포 패치 클램프 기법을. 이 방법은 신경생물학 연구에 필수적인 정밀한 기능 분석을 가능하게 합니다.

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저자는 그녀의 뛰어난 기술 지원을 인애 볼터을 감사드립니다. VGAT - 금성 형질 전환 쥐 박사에 의해 생성되었다. 박사 A. 미야 와키에서 제공 PCS2-비너스를 사용하여 Y. 야나가와, M. 히라 바 야시와 국립 생리 과학 연구소, 오카자키, 일본 Y. 가와구치.

윤리 정책 : 모든 절차와 동물 유지 관리 기관 지침에 따라 수행되었다, 독일어 동물 복지법, 유럽 이사회 (European Council) 동물의 보호에 관한 지침 609분의 86 / EEC 및 지방 자치 단체 (베를린, T-0215​​ / 11에서 가이드 라인 ) 급성 - 해마 조각의 1 준비 <ol><li> 대뇌 피질의 억제의 interneurons 13의 대부분을 레이블 vGAT 프로모터, 아래의 형광 비너스 / YFP의 단백질을 발현, (17-24일 이전) 형질 전환 쥐를 가져 가라. 쥐의 목을 벨. 신속 carbogenated, semifrozen (95 %, O2 / 5 % CO 2) 자당 기반 인공 뇌척수액 (자당 ACSF, 그림 1A)로 뇌 (&lt;40 초)을 해부하다. </li><li> , 램프 및 515 방출 필터를 LED 고글의 쌍에 장착 nm의 505 비너스 / YFP 형광에 대한 해부 쥐의 뇌를 평가합니다. </li><li> 피질과 cereb의 정면 셋째 제거ellum; 모든 메스, 반구를 구분합니다. 이전 14 설명한 바와 같이, 뇌를 붙 평평한 표면을 제공하기 위해 피질의 등 표면을 제거합니다. </li><li> vibratome에 해마 형성의 횡단면 (300 μm의) 잘라 반구가 semifrozen로 묶어야한다, 자당 ACSF (그림 1B) 14 carbogenated. 주동이 피질, 중뇌 및 뇌간의 추가 영역을 제거합니다. carbogenated 35 ºC에 가온 자당 ACSF를 포함하는 잠긴 유지 챔버에 각각의 조각을 전송합니다. </li><li> 따뜻하게 ACSF를 입력 마지막 조각의 시간에서 30 분 동안 35 ºC에서 복구하기 위해 조각을 둡니다. 신진 대사를 활성화하고 잘라 신경 세포 프로세스의 재 밀봉을 용이하게하기 위해이 작업을 수행합니다. 그런 다음 저장 (그림 1C) 실온에 전송할 수 있습니다. </li></ol> 2 제작 및 녹음 피펫의 충전 <ol><li> 푸(세포 내 라벨링) 0.1 % biocytin를 포함하는 세포 내 솔루션 : 여과 가득 때 2-4 MΩ의 피펫 저항이 달성 될 수 있도록 유리 모세관에서 LL 패치 피펫 (0.2 μm의 주사기 필터, 기공 크기). 그 성분의 저하를 방지하기 위해 얼음에 냉장 세포 내 솔루션을 유지합니다. </li><li> 농도 (; 솔루션 목록을 보려면 E R (의 Cl-) = -61 MV) - 생리 학적 관련성이 낮은 염소를 포함하는 용액과 시냅스 후 전류의 식별을 위해 패치 피펫을 채 웁니다. </li><li> 농도 (E R (의 Cl-) = - 쌍 녹음 시냅스 수용체 매개 반응을 확인하기 위해, 저 칼슘 버퍼 시냅스 송신기 릴리스와의 간섭을 방지하기 위해 용량뿐만 아니라 4 배 높은 염소를 같은과 세포 내 용액으로 패치 피펫을 채울 -20 MV)는 신호대 약리 RESP의 정확한 평가를 가능 관측 IPSCs 5 점을 개선하기 위해onsiveness. 농도 IPSC 동역학 (15)을 변경할 수 있습니다 - 염소를 변경하는 것이 있습니다. </li></ol> FS-INS에서 3 전 세포 패치 클램프 녹음 <ol><li> ACSF을 Carbogenate하고 (또한 흡입 라인,도 2a를 통해 기록 챔버로부터 제거 ACSF) 연동 펌프를 이용하여, 상기 기록 챔버로 관류 시스템을 통해 피드. 기록에 대비하여 설정에 대한 모든 장비의 전원을 켭니다. </li><li> 기록 챔버에 슬라이스를 전송하고 실크의 단일 섬유와 중독 백금 반지와 장소에서 개최합니다. CA1의 지층 (STR). pyramidale 모두 STR 2 피펫으로 액세스 할 수 있도록 시야를 통해 수직으로 실행되도록 슬라이스를 배치합니다. radiatum 및 STR. oriens 동시에 (그림 2C 및 4A). </li><li> (32 ~ 34 ° C) 기록을 설정으로 챔버를 놓고 carbogenated의 관류를 시작하고 따뜻하게50-10 ㎖ / 분의 유속으로 CSF. </li><li> 40X 대물 배율 IR-DIC 광학 아래 슬라이스 품질을 평가하고, 디스플레이 상에 보여 CCD 카메라로 시각화. 라운드 적당히 대조 CA1 피라미드 세포 (CA1의 PC)의 다수 STR에서 알 수 있으면 좋은 슬라이스 품질을 가정한다. 부드럽고 가볍게 크레이터 표면 (그림 2C) 아래 20 ~ 30 μm의 깊이에서 pyramidale. 품질이 낮은 조각은 고르지 슬라이스 표면과 매우 대조, 수축 또는 팽창 세포의 큰 숫자를 포함합니다. </li><li> 또는 STR 근처 큰 다극 세포체와 비너스 / YFP (그림 2B)를 표현하는 것과 같은 표면 형광 조명 아래 추정 FS의의 interneurons을 확인합니다. pyramidale. 합리적으로 깊은 순서대로 조각 (50 ~ 100 μm의 그림 2C) 내에서 셀을 선택 더 나은 자신의 형태 무결성을 유지합니다. </li><li> headstage에 피펫 홀더에 기록 전극을 장착; 다음 응용 프로그램LY 튜브 라인을 통해, 낮은 정압 (20 ~ 30 밀리바). 조각의 표면에 피펫을 내리고, 약간 선택된 뉴런의 중심 오프셋. </li><li> 이전에 (14, 16)을 설명하고 또한 2D 및 2E 피규어 참조로 전체 셀 녹음 구성을 얻습니다 <ol><li> 셀을 대상 : 70 ~ 80 밀리바에 압력을 높이 빠르게 단지 선택된 셀 (그림 2 차원, 3 위)의 소마 위 슬라이스를 통해 피펫을 낮 춥니 다. </li><li> 셀을 접근 : (위, 그림 2D) 그것에 &quot;딤플&quot;를 생산하는 세포막에 피펫을 누릅니다. 이웃하는 셀들의 biocytin 라벨링을 방지하기 위하여,이 단계를 신속하게 수행한다. </li><li> 기가 옴 씰을 만들기 : 피펫에 20mV의 전압 명령을 적용 동시에 압력을 해제합니다. 기가 옴 씰 (1-50 GΩ, 그림 2D, 아래쪽 및 그림 2E 가운데) typic동맹은 신속하게 개발하고 있습니다. 일단 전압 지령으로 전위 예상 쉬고 막 (전형적으로 -70과 -60 MV)를 적용, 밀봉. </li><li> 패치 돌파 : 밀봉 일단 부압의 짧은 펄스와 멤브레인 패치 파열; 따라서 전체 셀 구성 (도 2E, 아래) 달성. </li></ol></li><li> 전체 - 세포의 커패시턴스 및 직렬 저항 (R의 S)를 보상. R의 120 분까지 정상적으로 5 ~ 20 MΩ하고 안정적이다. 돌파구에 막 전위 (V M)가 -50 MV보다 비극성 화되면 세포를 포기; R S는 30 MΩ보다 초기에 큰; 기록에 걸쳐 20 % 이상 또는 R S 변화. </li><li> (250 pA의 그림 2 층 맨 -250)에 전류 펄스를 탈분극하는 하이퍼의 가족 (전류 클램프 모드에서) 자신의 반응에 의해 FS 기능을 확인합니다. FS 기능은 상대적으로 V M을 (일반적으로 -50 t 분극이있다오 -60 MV), 짧은 막 시정 (&lt;20 밀리 초) 및 주파수에서 활동 전위의 기차 (APS)와 전류 주입을 탈분극 500 pA의 응답&gt; 100 Hz에서 11 (그림 2 층 바닥), 현저하게되는 CA1의 PC (그림 2 층 중앙)에서와는 다른. </li></ol> (4) 세포 외 전기 자극 GABA B R 매개 응답을 연상 <ol><li> STR의 경계에 슬라이스에서 :; 시냅스 유발 반응을 관찰하기 위해 세포 외 자극 전극 (0.1 ~ 0.3 MΩ 저항이 M NaCl로 가득 패치 피펫)을 배치합니다. radiatum 및 STR. lacunosum-moleculare은. 자극 아티팩트 (그림 3A)을 세포에 직접 전기 자극을 방지하고 최소화하기 위해 소마에 전극 200 ~ 300 μm의 측면을 배치합니다. </li><li> 자극 전극을 배치하면, 전체의 셀의 기록을 구하는선택한 셀은 3.9 절 (그림 3B)에서와 같이 전류 클램프 모드에서 생리 학적 표현형을 평가합니다. </li><li> 전압 클램프 (V의 M -65 MV)에 기록 된 신경 세포와 함께,에서 시냅스 축삭의 전기 자극을 제공하는 50 V (~ 500 μA 효과적인 자극) 절연 정전압 자극기를 사용하여 20 초마다. 하나의 자극을 사용하여 (100 마이크로 초 기간, 그림 3C, 상단)은 GABA B 형 R 매개 IPSCs을 관찰하고, 큰 송신기 릴리스를 생산하는 (200 Hz에서) 여러 자극의 기차와 인터리브. </li><li> 고립 monosynaptic IPSC (중앙 상단 그림 3C)를 공개 :; 목욕은 이온 성 글루타메이트 수용체 길항제 (D-AP5 [50 μM] NMDA 수용체 DNQX [10 μM] AMPA 수용체)을 적용한다. 또한 GABA R 차단제의 응용 프로그램과 함께 GABA B R 매개 IPSC를 분리 (gabazine [10 μM] 그림 3C 중간 리터된 ower). </li><li> GABA B 이후의 응용 프로그램 CGP-55845 [5 μM] (그림 3C 낮은 회색이 밑에)에 의해 R이 매개되는 등의 결과 천천히 바깥쪽으로 전류 (확장 그림 3C 낮은를) 확인 </li></ol> FS-IN 및 CA1 PC를 결합 시냅스의 5 페어 녹음 <ol><li> 아래에 설명 된대로 시냅스 결합 IN과 PC 쌍 사이에 수행 동시 녹음과 억제 성 시냅스 전달의 GABA B R 매개 시냅스 컨트롤을 평가합니다. </li><li> 먼저, (섹션 3에서와 같이) 시냅스 interneuron의 전 세포 기록을 설정하고 FS 표현형 (도 4a)를 확인한다. </li><li> 그런 다음 이웃 CA1 PC (20 ~ 100 μm의 거리, 그림 4A)를 패치와 AP를 유도하기 위해 (전류 클램프 모드에서 개최) 시냅스 IN에 전류 펄스 (1 밀리 초 기간, 1-5 nA의 진폭을) 탈분극 간단한 초과 임계를 적용합니다. 시냅스의 공동 경우nnection은 전압 클램프에서 개최 된 CA1 PC에서 IPSCs에서 IN 결과에서 AP를 (약 80 % R의 S 보상) 존재한다. </li><li> 필요한 경우 연결이 발견 될 때까지, 상기 컴퓨터 &amp; CA1로부터 새로운 기록 전극과 기록을 채운다. </li><li> 연결이 설정되면, 단일 시냅스 응답과 동적 거동을 모두 평가하기 위해 시냅스 FS-IN에서의 AP 쌍을 유도. 50 밀리 초 간격 (그림 4B)와 2 바꿀만한 자극의 전형적인 쌍 펄스 프로토콜을 사용합니다. </li><li> 기준 조건에서 제어 흔적을 수집합니다. 그런 다음, 따라서 완전히 수용체 매개 효과를 차단하려면 길항제 CGP-55845 (5 μM) 다음 GABA B의 R을, 활성화, 관류 ACSF에 선택적 GABA의 B R 작용제 바클로 펜 (10 μM)을 적용한다. 각 약물의 조건 (그림 (b) 및 C)의 정상 상태시 ~ 50 트레이스를 수집합니다. </li><li> 기록이 완료되면, 찍으 형성함으로써 신체 멤브레인을 밀봉전자 아웃 패치 : 천천히 V-클램프에 세포체에서 피펫을 철회하고 R의 S가 증가함에 따라, MV -40 V의 M을 줄일 수 있습니다. 외부 아웃 패치의 형성을 촉진하기 위해이 작업을 수행; 다음 화장실에서 피펫을 제거합니다. </li></ol> 전기 생리 특성의 6 분석 <ol><li> 참고 : 다른 소프트웨어 패키지의 무리가 전기 생리 데이터의 취득에 사용할 수 있습니다. 여기서, WinWCP는 자유 스트래스 전기 생리학 소프트웨어 패키지에서 윈도우 프로그램은 최대 16 개의 아날로그 입력 채널에 기록 된 디지털 신호 (10)의 출력을 허용하는 데 사용된다. </li><li> 로우 패스 필터 20 kHz에서 모든 5-10 kHz에서 데이터 및 샘플. </li><li> 오프라인 분석 제품군을 생리 학적 데이터를 분석 할 수 있습니다. 참고 : Stimfit,이 경우에 사용되는 파이썬 쉘을 포함하는 오픈 소스 소프트웨어 패키지; 그러나, 다른 대안을 용이 대신 사용될 수있다. <ol><li> 수동 막 페이지 분석기록 뉴런의 roperties, 막 전위를 휴식에서, 현재의 클램프에 인수했다. </li><li> 기록의 시작에서 기록 된 반응의 기준선 평균 쉬고 막 전위를 측정한다. </li><li> 작은 과분극 전류 펄스 (≤ -50 PA)에 전압 응답에서, 옴의 법칙을 사용하여 입력 저항을 계산합니다. 잡음 비율, 평균 경로가 여러 개에 신호를 향상시킬 수 있습니다. 참고 : 우리의 예는 일반적으로 10 ~ 50 개인 스윕의 평균입니다. </li></ol></li><li> 과분극 작은 전류 펄스에 응답하여 감쇠 곡선을 단지 수 피팅에 의해 일정한 겉보기 막 시간을 추정한다. </li><li> 임계 값, 진폭 (임계 피크) 및 기간 (반 높이에서 측정 폭) 전류 펄스를 탈분극 임계 수준에 의해 유발을 결정하는 활동 전위 파형을 분석 할 수 있습니다. </li><li> GABA B R에게 전압 클램프 녹음에서 매개 IPSCs을 분석합니다. 필터에서 오프라인을 추적500 Hz에서 (가우시안 필터) 및 (적어도 10 트레이스의 평균)의 GABA B의 R 매개 반응의 피크 진폭과 지연 시간을 평가한다. </li><li> 피크와 앞의베이스 라인 사이에서 측정 GABA R-매개 IPSCs의 피크 진폭의 변화와 같은 기능의 억제 출력에 GABA B의 루피의 효과를 감지합니다. 제어주기 및 모든 약물 시대의 정상 상태에 대한 ≥50 흔적에서 평균 진폭을 계산합니다. </li></ol> 7 시각화 및 면역 세포 화학 FS-기능 <ol><li> 녹화 후, 4 ℃에서 0.1 M 인산염 완충액 (PB, 산도 = 7.35) O / N로 4 % 파라 포름 알데히드에 담가 조각을 수정. </li><li> 필요한 조각을 처리하기 전에 최대 1 ~까지 일주일 동안 PB로 전송 및 저장 할 수 있습니다. </li><li> 자유롭게 신선한 PB 및 이후 0.9 %의 NaCl 0.025 M PB 씻으 조각 (PBS, pH가 7.35). </li><li> FO 조각을 차단, 비특이적 결합 항체를 줄이기 위해10 % 정상 염소 혈청 (NGS), 0.3 % 트리톤-X100 PBS에서 만든 NaN이 3, 및 0.05 % (막 Permeabilize 하시려면하는 세정제)를 함유하는 용액에 RT에서 R 1 시간. </li><li> PBS에 NaN이 세 5 % NGS, 0.3 % 트리톤 - X100, 0.05 %를 함유 용액에 희석 방지 PV 단일 클론 마우스 항체를 사용, 태양 광 표현에 레이블을 지정하려면. 4 ° C (12) 2-3 일 동안 일차 항체를 품어. 철저하게 PBS에서 조각을 씻어. </li><li> 형광 항 마우스 이차 항체를 적용 (예 : Alexafluor-546.) 바이오틴 결합 단백질 스트렙 타비 딘과 함께, 형광 색소에 결합 (예를 들어, Alexafluor-647); 및 PBS에 희석 NaN의 3 3 % NGS, 0.1 % 트리톤 - X100, 0.05 %를 함유 한 용액에서 배양하고 4 ° C에서 O / N을 품어. </li><li> 대충 2-3 PB에 린스가 PBS에 따라 2 ~ 3 배 조각을 씻어. 유리 슬라이드에 슬라이스를 마운트합니다. 붕괴 슬라이스를 방지하기 위해 300 μm의 한천 스페이서를 사용합니다. fluores와 커버 슬립 조각네일 바니쉬 %를 장착 매체와 인감. </li></ol> 8 이미징 및 시각화의 재건 FS-기능 <ol><li> 적절한 레이저 라인 (다이오드 레이저 Alexafluor-647에 대한 635 nm의 흥분 fluorochome 기자와 함께, 주사 공 초점 현미경을 사용하여 조각을 시각화, 금성 Alexafluor-546 PV에 대한 표시와 아르곤 488 또는 515 nm의 헬륨 - 네온 543 nm의 / YFP). </li><li> 전체 셀의 Z-스택을 생산하는 (20X 목표를 사용하여, 일반적으로 0.5 μm의 단계) 적절한 Z-해상도에서 이미지를 가져 가라. 다중 스택은 일반적으로 이미지에 디지털 피지 / ImageJ에 소프트웨어 (그림 5A)를 사용하여 오프라인 스티치 할 수있는 전체 셀을해야합니다. </li><li> 반자동 추적 방법을 사용하여 스티치 이미지 스택에서 셀을 재구성 (피지 / ImageJ에 소프트웨어 패키지 17 단순 돌기의 추적기 플러그인을 그림 C). </li><li> 마지막으로, I의 PV-면역 반응성을 평가높은 개구 수 대물 렌즈 nterneuron (60X 규소 침지, NA = 1.3). PV의 체세포 세척이 너무 강한 경우 소마의 이미지, 근위 수상 돌기 근위 축삭, 또는 대안 축삭 터미널을 확인합니다. 면역 라벨이 biocytin 표지 구조 (그림 5B)에 부합하는 것으로하면 세포는 태양 광 발전에 대한 면역 간주됩니다. </li></ol>

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<li>Malinow, R., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+enhancement+shown+by+whole-cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346, 177-180 (1990).</li>
<li>Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shunting+inhibition+improves+robustness+of+gamma+oscillations+in+hippocampal+interneuron+networks+by+homogenizing+firing+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates.</a> Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).</li>
<li>Neu, A., Földy, C., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+origin+of+CB1-dependent+tonic+inhibition+of+GABA+release+at+cholecystokinin-positive+basket+cell+to+pyramidal+cell+synapses+in+the+CA1+region+of+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus.</a> Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).</li>
<li>Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoreactivity+for+the+GABAA+receptor+alpha1+subunit%2C+somatostatin+and+Connexin36+distinguishes+axoaxonic%2C+basket%2C+and+bistratified+interneurons+of+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus.</a> Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).</li>
</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

우리는 기능적으로 시험 관내 및 morphologically- neurochemically 식별 된 신경 세포의 특성을 전기 생리 학적 및 해부학 적 기법을 결합하는 방법을 설명; 특히 대뇌 피질의 억제 기능의 다양한 종류. 절차의 주요 측면은 다음과 같습니다 잠재적 인 (1) 사전 선택; (2) 세포와 뉴런 기록 시각화; 그리고 마지막으로 (3) 기록 기능의 형태 학적 및 면역 조직 화학적 분석. 이러한 연구는 특히 PV 인을 해결 하였지만, 기재된 프로토콜은 최소한의 변형으로 또는 다른 어떤 interneuron 신경 유형에서 유사 레코딩에 사용될 수있다. 대뇌 피질의 영역에서의 interneurons의 상대적으로 낮은 수는 매우 비효율적이 세포에서 임의로 선택과 녹음을합니다. 발산 현지화 및 형태 학적 특징을 구분하고 정기적으로 일부 interneuron 유형에서 기록하는 연구자를 사용할 수있다. 인턴 그러나 조각에서, 식별및 세포체 층 근처 eurons는 FS 기능에서...

해마 신경 회로 긴 인해 인간 및 설치류 모두에서 학습 및 기억에 중요한 역할뿐만 아니라 공간적 내비게이션으로 해부학 및 생리학, 모두에 대하여, 강한 조사의 대상이되어왔다. 마찬가지로, 해마의 눈에 띄는하지만, 간단한 층류 조직이 지역 대뇌 피질 네트워크의 구조 및 기능적 특성을 다루는 연구가 선호 될 수 있습니다. 해마 회로는 흥분성 주요 세포 (&gt; 80 %)와 작은 (10 ~ 20 %) 만 억제의 interneurons 1-3의 매우 다양한 집단으로 구성되어있다. 의 interneurons 빠른 이온 성 GABA 수용체에 역할을 자신의 축삭 터미널에서 γ-아미노 낙산 (GABA) (GABA 루피) 느린 대사 GABA의 B 수용체 (GABA B의 R을) 발표 4. 이러한 억제 자극 메커니즘을 상쇄하고 주체 세포의 흥분성을 조절하고, 따라서적외선 타이밍과 방전의 패턴입니다. 그러나,의 interneurons에서 방출 GABA는 주요 세포뿐만 아니라, 자신의 interneurons 5,6에뿐만 아니라 역할을합니다. 사전 및 시냅스 후 수용체는 interneuron의 여러 유형 중 피드백 규제와 억제 상호 작용을 중재. interneuron 네트워크에서 선택된 억제 메커니즘은 다른 주파수 7에 특히 진동의 발생 및 인구 활동 패턴의 형성에 중심이 될 것으로 믿어진다. 전체 세포 패치 - 클램프 녹음은 고유 특성과 신경 세포의 시냅스 상호 작용의 시험에 대한 잘 확립 된 방법이다. 그러나, interneuron 유형의 높은 다양성으로 인해, 억제의 interneurons의 조사가 기록 된 세포의 엄격한 확인이 필요합니다. 해마 interneuron 유형은 별개의 형태 학적 특징 및 신경 화학적 마커의 발현, 결합 해부학 적 및 면역 조직 화학적 전자에 의해 특징으로xamination 정확한 interneuron 6,8,9 아이덴티티를 결정하는 수단을 제공 할 수있다. 본 논문에서는 느린 GABA B의 특성을 허용 단일 신경 세포 나 시냅스 결합 쌍에서 전체 세포 패치 - 클램프 녹음이 사후 형태 학적 및 면역 조직 화학적 분석 한 후, 세포 내 라벨과 결합 된 실험적인 접근 방식을 설명 수용체가 확인의 interneurons의 억제 효과를 중재. 예로서, 우리는 시냅스 대상 소마 근위 수지상 innervates 및 &quot;빠른 스파이크&quot;(FS)에 의해 특징된다 interneuron의 하나의 주요 유형, 소위 &quot;바구니 세포&quot;(BC)의 서브 세트, 초점 칼슘 결합 단백질 parvalbumin (PV) 10, 11의 패턴 밀도가 세포체 층을 포함 축삭, 표현을 방전 시키십시오. 이들의 interneurons 큰 시냅스 억제 전류뿐만 아니라, 눈에 띄는 사전을 표시GABA B R 활성화 (12)에 응답하여 자신의 시냅스 출력의 시냅스 변조. 여기에 설명 된 기술들의 조합이 다른 식별 된 신경 세포 유형의 다양한 극한 또는 시냅스 메카니즘을 조사하기 위해 동일하게 잘 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>형질전환 vGAT-venus 랫드</td><td></td><td></td><td>Uematsu 등을 참조하십시오. &lt;em&gt;외 0명&lt;/em&gt;, 2008</td></tr><tr><td>Venus (515 nm) 고글</td><td>BLS Ltd., 헝가리</td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 도구</td><td>&lt;em&gt;즉&lt;/em&gt; FST</td><td></td><td>뇌 적출을 위해</td></tr><tr><td>바이브라톰(Vibratome)</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td>또는 수직 진동이 최소화된 다른 고급 진동 절편기(vibratome)</td></tr><tr><td>슬라이스 고정 챔버</td><td></td><td></td><td>실험실 자체 제작</td></tr><tr><td>정립형 IR-DIC 현미경</td><td>Olympus, 일본</td><td>BX50WI</td><td>마이크로매니퓰레이터 시스템을 사용하여; &lt;em&gt;즉&lt;/em&gt; Luigs and Neumann, Kleindiek &lt;em&gt;등.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Till Photonics</td><td>VX55</td><td></td></tr><tr><td>505 nm LED 시스템</td><td>Cairn Research</td><td>OptiLED 시스템</td><td>또는 수은 램프 또는 기타 LED 시스템 &lt;em&gt;즉&lt;/em&gt; CooLED.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B&amp;nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>또는 Axopatch 200B 증폭기 2대&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>WinWCP 데이터 수집 소프트웨어</td><td>John Dempster, 스트라스클라이드 대학교</td><td></td><td>모든 품질의 데이터 획득 소프트웨어를 사용할 수 있으며, &lt;em&gt;즉&lt;/em&gt; EPHUS, pClamp, Igor 등&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>전극 인출기</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td>박스-필라멘트(box-filament)와 함께 사용함</td></tr><tr><td>붕규산 유리 피펫</td><td>힐겐베르크, 독일</td><td>1405020</td><td>외경 2 mm, 내경 1 mm, 필라멘트 없음</td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Gilson</td><td>Minipuls</td><td>대신 다른 펌프나 중력 공급 방식을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>디지털 온도계</td><td></td><td></td><td>맞춤 제작</td></tr><tr><td>디지털 압력계</td><td>Supertech, 헝가리</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://digitimer.com/products/research/stimulators/&quot; 대상=&quot;제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 내용을 입력해 주세요.&quot;&gt;절연 정전압 자극기&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.digitimer.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Digitimer Ltd.</a></td><td>&lt;a href=&quot;http://digitimer.com/products/research/stimulators/ds2a-isolated-constant-voltage-stimulatorstimulus-isolator/&quot; 제공된 텍스트가 없습니다. 번역할 소스 텍스트를 입력해 주세요.&quot;제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 텍스트를 입력해 주시기 바랍니다.&quot;&gt;DS-2A&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>바이오사이틴</td><td>Invitrogen</td><td>B1592</td><td>~로도 알려진 &amp;epsilon;-비오티노일-L-라이신&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DL-AP5(V) 이나트륨염</td><td>Abcam 생화학 제품</td><td>ab120271</td><td></td></tr><tr><td>DNQX 이나트륨염</td><td>Abcam 생화학 제품</td><td>ab120169</td><td>또는 NBQX 또는 CNQX</td></tr><tr><td>가바진 (Gabazine, SR95531)</td><td>Abcam 생화학 제품</td><td>ab120042</td><td>또는 bicuculline methiodide</td></tr><tr><td>R-Baclofen</td><td>Abcam 생화학 제품</td><td>ab120325</td><td></td></tr><tr><td>CGP-55,845 hydrochloride</td><td>Tocris</td><td>1248</td><td></td></tr><tr><td>스트렙타비딘 647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357</td><td></td></tr><tr><td>항-PV 마우스 단클론 항체</td><td>스완트, 스위스</td><td>235</td><td>작업 농도 1:5,000-1:10,000</td></tr><tr><td>항마우스 2차 항체&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td>Venus 또는 GFP 형광 발현 설치류를 사용하면서 적색 채널을 사용하는 경우 (&lt;em&gt;즉&lt;/em&gt; 546 nm)를 사용하는 것이 권장됩니다.</td></tr><tr><td>정상 염소 혈청</td><td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td></td><td></td><td>고품질의 모든 브랜드</td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td></td><td></td><td>통상적으로 22 x 22 mm</td></tr><tr><td>아가로스 스페이서</td><td></td><td></td><td>한천 블록을 바이브라톰(vibratome)으로 300μm 두께로 절단함 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>레이저 주사 공초점 현미경</td><td>Olympus, 일본</td><td>Fluoview FV1000</td><td>또는 그와 유사한 다른 시스템</td></tr><tr><td>Fiji (Fiji는 ImageJ의 확장 버전입니다)</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td><td>Schindelin 참조 &lt;em&gt;등.&lt;/em&gt;, 2012</td></tr></tbody></table>

morphologically- 및 neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABA 성 억제의 interneurons은 뇌의 신경 회로 내에서 중심 역할을한다. 의 interneurons는 신경 세포의 인구 (10 ~ 20 %)의 작은 부분 집합을 포함하지만, 자신의 다양한 기능을 반영, 생리 학적 및 신경 화학적 이질성의 높은 수준을 보여줍니다. 따라서,의 interneurons의 조사가 중요한 조직 원리에 대한 통찰력과 신경 회로의 기능을 제공합니다. 그러나, 이것은 개별 interneuron 종류의 선택 및 식별을위한 통합 및 해부학 적 생리 학적 접근을 요구한다. interneuron 특정 마커의 발기인에서 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 동물의 급성 뇌 조각에서 기록 전체 세포 패치 클램프, 대상 및 electrophysiologically 특정 interneuron 유형의 고유 및 시냅스 속성을 특성화 할 수있는 효율적인 방법을 제공한다. 세포 내 색소 표지와 결합이 방법은 사후 MO로 확장 될 수있다rphological 및 면역 조직 화학적 분석, 기록 된 신경 세포의 체계적인 식별을 가능하게한다. 이러한 방법은 피질 뉴런의 다양한 유형의 기능성에 관한 과학적인 문제의 넓은 범위에 맞게 맞춤화 될 수있다.

제공되는 슬라이스 품질이 모두 CA1 PC와 FS 인 최소한의 어려움을 달성 할 수에서 기록, 상당히 좋은 것입니다. vGAT 발기인 13에서 비너스 / YFP을 표현 형질 전환 쥐 라인은 명백하게 FS-INS, 또는 실제로 수익 증권을 식별하지 않습니다. 그러나 및 STR 주변 기능에서 녹음. pyramidale, FS 인의 농도는 일반적으로 높은 일이고, FS 기능 (도 2B)를 선택할 확률이 높은 결과. FS - 인 CA1 PC 및 RS 기능 모두에 대하여 다른 특성들은 생리적 특성에 의해 구별 될 수있다. 그들은 상대적으로 분극이 휴식 잠재적 인 멤브레인 (-58.9 ± 1.5 MV, 15 세포, 대 CA1의 PC 26 세포에서 -62.6 ± 1.1 MV), 낮은 입력 저항을 (92 ± 12 MΩ 대 103의 PC에서 ± 14 MΩ) 빠른 명백 막 시상수 (15.4 ± 2.6 대 밀리의 PC에서 22.0 ± 2.7 밀리...

대뇌 피질의 네트워크는 억제의 interneurons의 작지만 다양한 설정에 의해 제어된다. 의 interneurons의 기능 조사 그러므로 표적으로 기록하고 엄격한 확인이 필요합니다. 세포 내 라벨, 사후 형태 학적 및 면역 조직 화학적 분석 신경 세포의 단일 또는 시냅스 결합 쌍에서 전체 셀 녹음을 포함하는 통합 접근 방식은 여기에 설명한다.

Morphologically- 및 Neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

본 절차의 전반적인 목적은 식별된 해마 파발부민(parvalbumin) 양성 인터뉴런에서 GABA B 수용체 매개 효과를 규명하는 것입니다. 이는 먼저 고품질의 급성 해마 슬라이스를 제작함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계로는 비디오 현미경을 사용하여 정맥 YFP 발현과 파발부민 양성 뉴런의 알려진 특성을 바탕으로 뉴런을 선택하는 것입니다.다음으로 전체 세포 패치 클램프 기록을 얻으며, 세포 외 자극 또는 쌍 기록(paired recordings)을 사용하여 GABA B 수용체 매개 효과를 조사합니다. 마지막 단계는 뉴런을 시각화하여 기록된 뉴런이 실제로 par albumin 양성이며, 세포체 주위 또는 수지상 돌기 억제성 뉴런임을 확인하는 것입니다. 궁극적으로, 이 방법은 GABA B 수용체 매개 억제 효과의 특성 분석을 가능하게 하며, 기록된 중간 뉴런의 명확한 분류를 가능하게 합니다.이 방법은 중간 뉴런(inter neuron) 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 제시할 수 있습니다. 예를 들어, 중간 뉴런들이 서로 어떻게 소통하는지, 그리고 이들의 흥분성과 시냅스 출력이 신경조절 시스템에 의해 어떻게 제어되는지 등이 있습니다. 본 방법은 해마 중간 뉴런의 GABA성 제어에 대한 통찰을 제공하지만, 다른 뇌 영역, 신경조절 시스템 또는 세포 유형에도 적용될 수 있습니다.반냉동 상태의 carbogen sucrose-A CSF에 보관된, 형광 정맥 YFP를 발현하는 17~24일령 형질전환 쥐의 뇌를 꺼냅니다. 메스를 사용하여 피질의 앞쪽 1/3과 소뇌를 제거하고, 양쪽 반구를 분리합니다. 절편 제작을 위해 뇌를 고정할 수 있는 평평한 면을 만들기 위해 피질의 등쪽 표면을 제거합니다. rozen carbogen native sucrose가 채워진 viome bath가 있는 viome stage 위에 반구를 접착하여 고정합니다.A CSF를 사용하여 해마 형성체의 300 µm 두께 횡단 절편을 제작합니다. 각 절편을 35 °C의 carbogen sucrose A CSF가 담긴 침지 보관 챔버로 옮깁니다. 마지막 절편을 가온된 sucrose A CSF에 넣은 후 30분 뒤에, 보관을 위해 절편들을 상온으로 옮깁니다.유리 모세관에서 패치 피펫을 뽑아 2~4 MΩ의 피펫 저항을 확보합니다. 피펫을 채운 후, 단일 실크 섬유로 고정된 백금 링을 사용하여 해마 절편을 기록 챔버로 옮겨 고정합니다. 챔버를 기록 장치에 설치하고

whole-cell-patch-clamp-recordings-from-morphologically

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 Mauthner 뉴런 및 기타 망상 척수 세포의 전기적 특성을 연구하는 방법인 전체 세포 패치 클램프 전기생리학이라는 기술을 설명합니다.

Whole-Cell Patch Clamp 전기생리학: 뉴런의 전기적 특성을 연구하는 방법

이 비디오는 수지상 멤브레인 표면에서 패치 클램프 기록 기술을 보여줍니다. 이는 도파민 뉴런에서 수상돌기와 그 아래에 있는 전위의존성 이온 채널의 전기적 특성을 직접 조사하는 데 도움이 됩니다.

Patch-Clamp Recordings from the Dendrite of a Dopaminergic Neuron in a Brain Slice

이 비디오는 형질주입된 쥐 해마 뇌 절편에서 시냅스 상호 작용 및 신경 반응을 연구하는 프로토콜을 보여줍니다. 여기에는 활동 전위를 트리거하기 위해 장거리 감각 뉴런을 조명하고 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 기록된 뉴런에서 결과로 발생하는 흥분성 시냅스 후 전위를 기록하는 것이 포함됩니다.

Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

이 비디오는 뉴런 발화 패턴을 분석하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 척수 절편의 SG(substantia gelatinosa) 뉴런에서 전기생리학적 기록을 수행하는 절차를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 척수의 SG 뉴런의 자극에 대한 신경 반응을 연구할 수 있습니다.

척수 절편의 실질체 젤라티노사 뉴런에서 기록하는 전체 세포 패치 클램프

이 비디오는 뇌 절편을 고정하고, 전체 세포 구성을 달성하기 위해 피펫을 배치하고, 시냅스후 반응을 기록하도록 시냅스전 뉴런을 자극하여 뉴런 연결을 매핑하는 절차를 보여줍니다.

Paired Patch Clamp Recording of the Neuronal Connections in Acute Brain Slices(급성 뇌 절편에서 뉴런 연결의 쌍을 이룬 패치 클램프 기록)

여기에 설명하는 세포 부착 된 패치 클램프 기술로 하나의 이온 채널에서 현재 기록의 장기 복역을 얻기위한 절차입니다. 이 방법은 실시간으로 관찰을 허용, 생물학적 신호를 기초 개폐 채널 입체 형태의 패턴. 이 데이터는 그대로 생체막의 채널 특성에 대해 알려 드리겠습니다.

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

쌍 기록은 시냅스로 연결된 두 개의 뉴런에서 동시에 전체 세포 패치 클램프 기록으로, 개별 뉴런 사이의 시냅스에 대한 정확한 전기생리학적 및 약리학적 특성화를 가능하게 합니다. 여기에서는 전기생리학을 위한 모든 실험실에서 유기형 해마 절편 배양에서 이 기술을 확립하기 위한 자세한 방법론과 요구 사항에 대해 설명합니다.

해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

급성 뇌 절편에서 시냅스로 결합된 뉴런의 패치 클램프 기록 및 동시 세포 내 바이오사이틴 충전을 통해 구조적 및 기능적 특성의 상관 분석을 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목적은 뉴런 미세 회로에서 전기생리학적 기록의 필수 기술 단계와 후속 형태학적 분석을 설명하는 것입니다.

급성 뇌 조각에서 신경 세포의 미세 회로의 전기 생리 및 형태 학적 특성은 페어 패치 클램프 녹음을 사용하여

이 프로토콜은 전체 셀 패치 클램프 녹음을 수행하기위한 기본 절차 단계를 설명합니다. 이 기술은 신경 세포의 전기적 동작의 연구를 허용하고, 뇌 조각에서 수행하는 경우, 여전히 상대적으로 잘 보존 된 뇌 회로에 통합되어 신경 세포에서 다양한 신경 기능의 평가를 할 수 있습니다.

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

Subcellular patch-clamp recordings는 수상돌기의 기능적 특성을 조사할 수 있는 가능성을 제공합니다. 그러나 이러한 미세한 구조는 직경이 작기 때문에 쉽게 접근할 수 없습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 in vitro에서 도파민 뉴런의 수상돌기로부터 안정적이고 신뢰할 수 있는 기록 수집을 용이하게 하는 것을 목표로 합니다.

흑색질 도파민 뉴런의 Somatodendritic 도메인에서 세포 내 패치 클램프 녹음

본 프로토콜은 성체 마우스에서 1차 해마 미세아교세포를 분리 및 정제하는 방법을 설명한 다음, 이러한 급성으로 분리된 세포에서 전체 세포 패치 클램프 기록을 수행하기 위한 지침을 설명합니다.

성체 마우스에서 해마 미세아교세포의 분리 및 전체 세포 패치-클램프 기록

학습하세요 해마 parvalbumin 양성 interneuron에서 GABA B 수용체 매개 효과를 특성화하는 전체 세포 패치 클램프 기법을. 이 방법은 신경생물학 연구에 필수적인 정밀한 기능 분석을 가능하게 합니다.

Morphologically- 및 Neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음

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