마이크로 기둥 미세 유체 장치에서 바이오 필름 보리 형성을위한 프로토콜

다공성 매체를 모방한 미세유체 장치에서 생물막 형성 연구를 위한 프로토콜에 대해 논의합니다. microfluidic 장치는 마이크로 기둥의 배열로 이루어져 있고 이 장치에 있는 Pseudomonas fluorescens에 의하여 biofilm 대형은 조사됩니다.

이 절차의 전반적인 목표는 마이크로 기둥이 있는 미세유체 장치에서 박테리아 스트리머의 형성을 입증하는 것입니다. 이것은 먼저 미세유체 칩을 제작함으로써 달성됩니다. 절차의 두 번째 단계는 테스트된 박테리아(이 경우 슈도모나스 형광)를 배양하는 것입니다.

마지막 단계는 실험 설정을 조립하고 박테리아를 미세유체 칩에 주입하고 데이터를 수집하는 것입니다. 궁극적으로 결과는 독감 형광 현미경 이미지를 통해 스트리머의 시간 변화를 보여줄 수 있습니다. 이 금속의 시각적 시연은 다양한 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.

실험의 학제 간 특성으로 인해 이 절차에는 깊은 반응성 이온 에칭이 있는 실리콘 웨이퍼가 필요합니다. 웨이퍼의 포토레지스트는 씻어내야 합니다. 마스터 몰드를 조용히 시작하는 것입니다.

바이알에 트리클로로에틸렌 두세 방울을 떨어뜨리고 그 옆에 있는 곰팡이 디자인과 함께 건조제에 넣습니다. 2-3 시간 안에 금형이 사일로화됩니다. 사일로화하는 동안 PDMS 믹스 시가 1 8 4 실리콘 베이스와 경화제를 10:1 비율로 준비합니다.

그런 다음 약 2시간 동안 진공 상태에서 PDMS의 가스를 제거합니다. 이제 사일로화된 웨이퍼를 홀더로 옮기고 그 위에 PDMS를 부어 기포가 형성되지 않도록 합니다. PDMS가 섭씨 80도의 웨이퍼에서 2시간 동안 경화되도록 합니다.

이것은 크기가 조정된 실리콘 주형에서 A-P-D-M-S 스탬프를 제작합니다. 경화가 완료되면 커터를 사용하여 PDMS 스탬프를 벗겨냅니다. 그런 다음 커터를 사용하여 스탬프를 미세 유체 칩으로 자릅니다.

이제 절단 코어를 사용하여 스탬프의 입구 및 아웃라이브 위치에 구멍을 뚫습니다. 다음 단계는 스탬프를 유리에 접착하는 것입니다. 24mm 커버 슬립과 PDMS 스탬프를 산소 플라즈마에 30초 동안 노출시킵니다.

노출 후 PDMS 스탬프의 바닥면에 커버 슬립을 부착하면 본드가 형성됩니다. 어셈블리를 섭씨 70도의 오븐에 10분 동안 넣습니다. 이 프로토콜에 대한 프로세스를 완료하려면 초순수로 만들고 섭씨 50-55도에서 테트라사이클린을 1밀리리터당 50마이크로그램으로 투여한 LB 플레이트를 준비합니다.

접시를 따를 때 불을 붙이면 거품이 터질 수 있습니다. 냉각되고 응고된 플레이트는 날짜를 측정하고 은박지 랩에 섭씨 4도에서 보관해야 합니다. 또한 초순수로 만든 LB 육수를 준비하고 테트라사이클린 밀리리터당 50마이크로그램을 투여했습니다.

육수는 섭씨 4도에서 보관하고 호일로 싸서 보관하십시오. 이제 LB 플레이트에 섭씨 영하 80도의 온도에 저장된 슈도모나스 형광의 배양 스톡은 플레이트를 지그재그 패턴으로 줄무늬를 만들고 어둠 속에서 섭씨 30도에서 밤새 배양합니다. 다음 날, 플레이트에서 콜로니를 선택하고 갓 준비한 S 플라스크를 섭씨 30도에서 150RPM의 쉐이킹으로 밤새 배양합니다.

배양 후 배양의 광학 밀도를 측정합니다. 그런 다음 S 두 솔루션을 만듭니다. 플라스틱 튜브에 LB 5밀리리터를 추가한 다음 생물막 실험에 일반적인 0.1의 600나노미터에서 OD에 대한 S 1 용액을 충분히 추가합니다.

먼저 핀셋을 사용하여 실험을 설정하고 내경이 0.20인치인 플라스틱 튜브를 준비된 칩의 입구와 출구에 연결합니다. 튜브는 유연하고 충분히 길어야 합니다. 여기서는 약 20인치입니다.

그런 다음 주사기에 S 두 용액을 채웁니다. 30 게이지의 뭉툭한 바늘을 부착하고 거품을 제거합니다. 기포가 채널로 유입되는 것을 방지하는 것은 특히 실험의 라인 시간으로 인해 중요한 단계입니다.

기포는 박테리아에 의해 형성된 부드러운 구조를 손상시킬 수 있습니다. 그런 다음 주사기를 입구 튜브에 연결하고 출구 튜브를 폐기물 용기에 연결합니다. 이제 주사기를 주사기 펌프에 배치하고 배양 온도로 설정된 세포 챔버가 장착된 현미경에서 펌프를 원하는 유속(예: 시간당 8마이크로리터)으로 설정합니다.

40 x 대물렌즈를 사용하여 미세유체 칩을 볼 수 있습니다. 이제 펌프를 시작하십시오. 박테리아가 챔버에 도입되면 생물막 형성도 시작됩니다.

생물막은 몇 시간, 며칠 동안 형성되고 성숙하며 진행 상황을 추적하기 위해 이미지를 촬영합니다. SEMA를 사용하여 제작된 미세유체 칩을 이미지화하였다. 입구와 같은 포크는 장치 전체의 압력 헤드를 균등화하기 위해 만들어졌습니다.

기둥 벽이 거의 수직에 가까운 것도 볼 수 있습니다. 생물막 형성을 조사하기 위해 형광을 시간당 8 마이크로 리터로 장치에 주입했습니다. 생물막 형성은 희석된 박테리아 배양물을 몇 분 동안 주입한 후 시작되었습니다.

그러나 몇 시간 후 중간 부분 근처에서 마이크로 기둥 사이로 뻗어 있는 필라멘트 구조의 출현이 관찰되었습니다. 점선 타원은 형성되는 스트리머 스트리머를 구분하며, 한쪽 끝이 마이크로 기둥 중 하나의 극 영역에 묶여 형성됩니다. 깃발은 또한 두 개의 마이크로 기둥 사이의 대각선을 따라 보였다.

깃발의 두께는 세포 분열과 플랑크톤 박테리아의 통합으로 인해 시간이 지남에 따라 증가했습니다. 그들은 또한 장치에서 많은 부피를 차지하는 시간 스트리머로 증식하여 장치를 막을 수 있는 성숙한 생물막을 형성했습니다. 장치를 통한 흐름의 기계적 시뮬레이션은 스트리머가 처음에 유체 유선을 따라 방향을 잡는다는 것을 보여줍니다.

또한 초기 단계에서 스트리머는 유속이 가장 높은 위치에서 발생합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 미세유체 환경에서 생물막 스트리머가 어떻게 형성되고 진화하는지 잘 이해하게 될 것입니다. 박테리아와 함께 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 생물 안전 프로토콜과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.