Name: 마이크로 기둥 미세 유체 장치에서 바이오 필름 보리 형성을위한 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: 배우세요 미세 유체 칩에서 Pseudomonas fluorescens 바이오필름 스트리머 형성을 관찰하는 방법을. 형광 현미경으로 시간 경과에 따른 동역학을 시각화하여 다공성 매질 환경에서 세균 거동을 연구합니다.

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저자는 박테리아 균주를 제공한 캘거리 대학의 생물학과의 Howard Ceri 교수에게 감사를 표합니다. A. Kumar는 NSERC의 지원을 인정합니다. T. Thundat은 CERC(Canada Excellence Research Chair) 프로그램의 재정적 지원을 인정합니다. 저자는 또한 비디오 촬영에 도움을 준 Zahra Nikakhtari 씨의 도움에 감사를 표합니다.

아래에서 설명한 순서에 따라 여기에 실험 프로토콜을 수행합니다. 미세 유체 플랫폼을 만들기위한 미세 프로토콜은 1 단계 2는 세균 배양 프로토콜 (그림 2)에 대해 설명하고, 3 단계 실험 장치 (그림 3)의 조립에 관한 단계에서 설명합니다. 마지막으로, 실제의 실험 공정은 단계 4에서 설명한다. 1 칩 제조 절차 참고 : 적절한 안전 절차는 아래에 설명 된 프로세스에 따라야합니다. 자세한 내용은 제도적 안전 요원에게 문의하십시오. <ol><li> 적절한 소프트웨어 (예를 들면, L-편집)와 마스크를 디자인합니다. 채널 디자인은 폭 625 μm의의 주요 마이크로 채널로 구성되어 있습니다. 채널의 중심 영역의 직경은 50 μm의가 (보조 파일 참조) 떨어져 25 μm의 간격 마이크로 게시물의 배열을 포함합니다. </li><li> 유리에이 디자인을 인쇄 (5 &quot;× 5&quot;소다 석회 유리), &quot;0.09의 두께를 가지며, 포토 마스크를 제조하기 위해서 마스킹하여, 크롬 (크롬)의 약 70 nm 두께의 층으로 코팅된다. 사용 AZ400K 현상 제 1 분간 어느. 후, 크롬 에칭 제를 이용하여 크롬 층을 에칭 약 1 분간 레지스트 차가운 피라냐 용액으로 닦아 제거하는 아세톤을 사용한다. (H 2 SO 4, H 2 (3)의 비율이 O : 1). </li><li> 포토 리소그래피 <ol><li> 20 분 동안 피라나 용액으로 화학적으로 표준 4 &quot;실리콘 웨이퍼를 청소합니다. </li><li> DI 워터와 웨이퍼를 헹구고 건조. </li><li> 핫 플레이트 (15 분 동안 200 ° C)에 웨이퍼를 가열. </li><li> 코팅 된 포토 레지스트와 실리콘 웨이퍼. 여기서, 포지티브 포토 레지스트 AZ4620는 12.5 μm의 두꺼운 층을 얻기 위해 25 초 동안 2000 rpm으로 실리콘 웨이퍼 상에 스핀 - 코팅 하였다. </li><li> 100 ° C에서 질소 흐름에 90 초 동안 웨이퍼를 부동으로 핫 플레이트에 웨이퍼의 소프트 베이킹의 모든 용매를 제거합니다. 이어서, t 진공에 유지60 초 동안 그는 같은 온도. </li><li> 탈수 24 시간 동안 어두운 상자에 웨이퍼를 놓습니다. </li><li> 포토 레지스트로 설계된 패턴을 전사하기 위해 UV 광에 웨이퍼를 노출. </li><li> 240 초 동안 포토 레지스트 현상액 (AZ400K)에서 웨이퍼를 담근다. 이어서, 이소 프로필 알코올로 웨이퍼를 헹구고 질소 가스의 스트림에 배치하여 건조. </li></ol></li><li> ICP-DRIE (유도 결합 플라즈마 - 딥 반응성 이온 에칭) 공정 <ol><li> DRIE 에칭을 적용합니다. 장치에 필요한 최종 깊이 (이 조사에서 50 μm의)에 따라 적절한 식각 깊이를 선택합니다. 포토 레지스트는 이러한 프로세스 동안 마스크 층으로서 작용한다. </li><li> 아세톤 남아있는 포토 레지스트를 제거하고 웨이퍼를 청소합니다. </li></ol></li><li> PDMS (폴리 디메틸 실록산) 주조 <ol><li> 실리콘 마스터 금형을 silanizing에 대한 trichloromethylsilane (TCMS)를 사용합니다. 유리 병에 trichloromethylsilane 2 ~ 3 방울을 붓고 옆에 데시 케이 터에 배치실리콘 마스터 몰드. silanizing 프로세스가 완료 될 때까지 2 ~ 3 시간을 허용합니다. </li><li> PDMS를 제조 1 : 별도의 용기에서, 10의 중량비로 경화제와 실 가드 184 실리콘베이스를 혼합한다. 조건 (약 2 시간)를 진공 청소기로 청소하는 데 쓰는하여 PDMS를 가스를 제거한다. </li><li> 홀더 실리콘 마스터 주형을 넣어. 이어서, PDMS 스탬프를 형성하는 실리콘 마스터 주형에 부어 PDMS. 거품이 과정에서 PDMS에 형성하지 않도록해야합니다. </li><li> 80 ° C에서 2 시간 동안 PDMS를 치료. </li><li> 필 마스터 금형에서 PDMS 스탬프 끕니다. 이어서, 별도의 마이크로 PDMS 스탬프로 자른다. 마지막으로, 입구 (들)와 출구 (들)에 구멍을 드릴 절단 코어를 사용합니다. </li></ol></li><li> 유리에 PDMS의 본딩 <ol><li> 30 초 동안 산소 플라즈마에 커버 슬립과 PDMS 스탬프를 노출. 커버 슬립에 본드 PDMS 스탬프입니다. </li><li> PDMS 스탬프 및 커버 슬립 사이에 적당한 밀봉을 달성하기 위하여, 10 분 동안 70 ° C에서 오븐에 넣어 어닐링 장치. </리&gt; </ol></li></ol> 2 세균성 문화 참고 : 적절한 바이오 안전성 프로토콜 단계 2-4에 따라야합니다. 자세한 내용은 제도적 안전 요원에게 문의하십시오. <ol><li> LB 한천 플레이트를 준비 <ol><li> 1 L 플라스크에 20g 루리아 - 베르 타니 (LB) 한천 (밀러) 분말 및 초순수의 500 ML을 추가합니다. 분말을 용해 약동하십시오. </li><li> 15 PSI, 15 분 동안 121 ° C에서 고압 증기 멸균에 의해 소독. </li><li> 플라스크 벤치에 또는 바이오 안전성 후드에서 물을 욕조에 50 ~ 55 ° C까지 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 50 μg / ML의 최종 농도를 달성하기 위해 항생제 테트라 사이클린을 추가한다. 잘 저어 섞는다. </li><li> 접시에 혼합물을 부어. 전체 2/3 - 2까지 각 판을 채 웁니다. </li><li> 불꽃 공기가 형성하는 경우를 나타 짧게 거품. 응고 된 기포 위에 박테리아 배양을 전파하기 어렵다. </li><li> 판 하룻밤 실온에서 냉각시킵니다. </li><li> 그들은 멋진 때,자신의 소매로 다시 접시를 넣어 4 ℃에서 가방, 라벨 (항생제와 날짜) 및 저장을 봉인. 참고 : 빛이 많은 항생제를 비활성화로, 주석 호일 접시의 주식을 커버. </li></ol></li><li> LB 국물 준비 <ol><li> 20g 루리아 - 베르 타니 (LB) 배지 (밀러) 분말 및 플라스크에 초순수의 1 L를 추가합니다. 분말을 용해 약동하십시오. </li><li> 15 PSI, 15 분 동안 121 ° C에서 고압 증기 멸균에 의해 소독. </li><li> 플라스크 벤치에 또는 바이오 안전성 후드에서 물을 욕조에 50 ~ 55 ° C까지 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 50 μg / ML의 최종 농도를 달성하기 위해 항생제 테트라 사이클린 (tetracycline)을 추가한다. 잘 저어 섞는다. </li><li> 때 멋진, 4 ° C에서 레이블 병을 배치합니다. 참고 : 빛이 많은 항생제를 비활성화로, 주석 호일로 병을 커버. </li></ol></li><li> LB 한천 접시에 문화 박테리아 (이 프로토콜을 사용하는 슈도모나스 fluorescens) <ol><li> (냉장고에서 -80 °를 박테리아의 주식을 가지고; C)과 얼음에 놓습니다. </li><li> -80 ° C 세균 주식 및 바이오 안전성 후드 내부 LB 한천 플레이트를 놓습니다. </li><li> 킬 지그재그 패턴 LB 한천 플레이트 상에 균주. 한천 플레이트를 덮고 하룻밤 30 ºC 그것을 품어. 마지막으로, 4 ° C에서 냉장고에 접시를 저장합니다. </li></ol></li><li> 박테리아 용액을 제조 (S1) <ol><li> 멸균 플라스크에 50 ㎖의 LB 국물 미디어를 붓고. 바이오 안전성 후드 내부에서이 작업을 수행합니다. </li><li> 플라스크에 LB 아가 플레이트로부터 박테리아 단일 콜로니를 전송합니다. 이 조작은 생물 안전성 후드 안쪽 수행되어야한다. </li><li> 30 ° C 및 충분한 시간 (4 시간) 150 rpm에서 진탕 배양기에서 플라스크를 넣습니다. </li></ol></li><li> 희석 세균 솔루션 (S2)를 준비 <ol><li> 멸균 플라스틱 튜브에 5 ㎖의 LB 국물 미디어를 붓고. </li><li> LB 국물 매체와 혼합하여 S1을 희석. 그런 다음 솔루션을 소용돌이. 용액은 목적하는 광학 달성 희석알 밀도 (OD 600 nm의 0.1에서 측정). 참고 : 바이오 필름 실험은 일반적으로이 부근에서 OD 값을 사용한다. </li></ol></li></ol> 3 실험 설치 준비 <ol><li> 핀셋은 마이크로 칩의 입구 (들)와 출구 (들)에 유연한 플라스틱 튜브 (0.20 &quot;ID)를 연결합니다. 입구와 출구가 이전에 마이크로 칩 (스텝 1.5.5)의 PDMS 부분에 드릴되었다.이 조사에서 마이크로 칩은 두 개의 입구와 하나의 출구로 구성되어 있습니다. </li><li> 박테리아 용액 (S2 용액) 주사기 (들)을 입력하고 주사기 (들)의 모든 거품을 제거합니다. </li><li> 입구 관 (들)에 주사기 팁 (들) (30 G 0.5 &quot;무딘 바늘)을 연결합니다. 그런 다음 컨테이너를 낭비 출구 관 (들)을 연결합니다. </li></ol> (4) 실험을 실행 <ol><li> 주사기 팁 (들) 주사기 (들)을 연결합니다. </li><li> 주사기 펌프 위에 장소 및 수정 주사기 (들). 그런 desir의 대물 렌즈와 광학 현미경 마이크로 칩을 배치에드 배율 (예를 들어, 40 배). 박테리아 증식 (P. 30 °의 C는 fluorescens) 동안 일정한 온도 환경을 유지하기 생균 챔버기구와 마이크로 칩을 포함한다. </li><li> 원하는 유량 레벨로 펌프 (예를 들어 10 μL / 시간)를 설정하고 유체 펌핑을 시작합니다. </li><li> 박테리아가 챔버 내로 도입되면, 바이오 필름 형성이 또한 개시된다. 바이오 필름 형성 및 성숙은 일반적으로 몇 시간 또는 며칠의 기간에 걸쳐 발생한다. 관찰하고 현미경을 통해 생물막 성장의 이미지를 가져 가라. </li></ol>

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우리는 복잡한 서식지에서 바이오 필름 개발 연구를위한 다공성 미디어를 모방하는 간단한 미세 유체 장치를 보여 주었다. 실험의 결과를 지시 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 그들은 장치의 형상을 포함한다. 포스트 형상은 다를 수 있지만, 깃발은 형성하기위한 적절한 기공 공간이 필요합니다. 더욱이 Valiei 외. 1 트리머 형성 할수 특정 유량 범위에서 발생 것을 증명했다. 임계 값보다 낮은 유속에서, 깃발에 바이오 필름의 변형이 관찰되지 않을 수 있습니다. 그러나 어떤 다른 임계 유량 값 이상, 생물막 골절 지배하고 깃발의 형성을 허용 할 수 없습니다. 이 실험을 괴롭히는 또 다른 문제는 마이크로 기둥 배열에 갇혀 될 수 있습니다 기포이다. 보통 이러한 기포가 원하는 값으로 점차적으로 감소하는 후 초기 유속의 증가에 의해 제거 할 수있다. 미세 유체 플랫폼등 이러한 여러 가지 장점과 몇 가지 제한을 제공합니다. 이 플랫폼은 작은 문화 볼...

최근에, 우리는 다공질 일을 모방 한 미세 유체 장치에서 세균 biofilm 형성의 역 동성을 보여 주었다. 세균 바이오 필름은 기본적으로 세포 외 고분자 물질 (EPS) 2-4으로 쌌다 아르 표면 집계 박테리아의 식민지입니다. 세균이 박막은 부드러운 표면을 다공성 매체의 훨씬 더 복잡 서식지에 이르기까지 거의 모든 생각할 수있는 틈새 시장이 형성 될 수 있기 때문이다. Valiei 외. 1 다공질 구조를 시뮬레이션하기 위해 마이크로 - 기둥 배열을 미세 유체 소자를 사용 및 액체 유량의 함수로서이 장치에서 바이오 필름 ​​형성을 연구 하였다. 그들은 특정 흐름 정권, 깃발로 알려진 사상 바이오 필름은 다른 기둥 사이에 등장하기 시작 것을 발견했다. 깃발에 닿는 일 수 있거나 둘 고체 표면에 끝나지만 구조의 나머지는 액체 중에 현탁된다. 보리 형성은 일반적으로 시작하는 바이오 필름의 초기 층 형성과 그 형식 후이온은 복잡한 서식지에서 바이오 필름의 장기적인 발전을 지시 할 수 있습니다. 최근 여러 연구자들은 유영 형성의 역학을 조사 하였다. 야 즈디 등. 5는 깃발이 진동 거품에서 발생하는 와류 흐름에 형성 할 수있는 것으로 나타났다. 또 다른 실험에서, Rusconi가 외. 6 깃발의 형성에 채널 곡률 및 채널 형상의 효과를 조사 하였다. 그들은 깃발이 마이크로의 굴곡 부분에 형성 할 수있는 것을 발견하고, 유영 형태는 운동과 관련이있다. 최근의 연구에 깃발들이 다공성 인터페이스에서 성숙 구조의 형성에 선구자 역할을 할 수 있습니다로, 다양한 자연과 인공 시나리오에서 폭 넓은 영향을 생물 의학 시스템에서 신속하고 치명적인 바이오 필름의 증식으로 이어질, 또한 상당한 플로우 기반을 일으킬 수 있다는 것을 보여 주었다 구조의 상호 작용 등 1,7-9. 바이오 필름의 깃발은 자주를 형성다공성 매체와 같은 N 복잡한 서식지. 다공성 미디어 환경의 이해 생물막 성장은 같은 CO 2 포집 11로 상황에서 잘 보어의 무결성을 유지하고 토양 12 모공의 막힘 생물학적 폐수 처리 (10)로 여러 가지 환경 및 산업 공정에 관련이있다. 복잡한 서식지에서 바이오 필름의 형성을 관찰하는 것은 종종 의한 다공질의 불투명도에 도전 할 수 있습니다. 그들이 실시간 인 시츄 모니터링을 허용하는 이러한 상황에서, 마이크로 유체 기반 다공성 미디어 플랫폼은 매우 유리한 증명할 수있다. 마이크로 유체의 또 다른 장점은 단일 바이오 마이크로 유체 플랫폼에서 여러 생물 반응기를 구축하고 동시에 온라인으로 모니터링 및 / 또는 센서의 통합을 허용하는 능력이다. 하나의 장치 및 정확한 통계적 분석을 위해 상당한 관련 데이터를 수집하는 기능이 여러 실험실 실험을 구현하는 유연성 중요하다 ADV미세 유체 시스템 (13, 14)의 ANTAGE. 위 설명의 문맥에서, 다공성 매체 환경에서 이해 유영 형성 역학은 여러 응용에 유익 할 것이다. 본 연구에서는 본뜬 다공성 매체 장치에서 스 트리머 형성을 조사하는 프로토콜을 개발한다. 미세 유체 플랫폼의 제조는, 세포 배양과 실험에 필요한 단계가 설명되어 있습니다. 실험에서는, 슈도모나스 fluorescens의 야생형 균주 사용 하였다. P. 토양에서 자연적으로 fluorescens는 토양 생태 (15)을 유지에 중요한 역할을합니다. 사용 된 균주는 유전자 구성 적으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하기 위해 설계되었다.

<table><tbody><tr><td>형광 현미경</td><td>니콘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB 한천</td><td>Fisher</td><td>BP1425-500</td><td>40g 정제수 1L 매달아</td></tr><tr><td>LB 육수</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td>20g 정제수 1L 중 20g</td></tr><tr><td>생물 안전 후드</td><td>마이크로 존 주식회사</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher</td><td>875712</td><td>멸균 100mm×15mm 폴리스티렌 페트리 접시</td></tr><tr><td>인큐베이터 쉐이커</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Excella E24 인큐베이터 쉐이커 시리즈</td></tr><tr><td>50ml 멸균 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>폴리프로필렌 RNase-/DNase-free</td></tr><tr><td>테트라사이클린 프리 베이스</td><td>MP Biomedicals</td><td>103012</td><td>50 &#956; g/ml</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 실리콘</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>68037-59-2</td><td>엘라스토머 베이스 및 경화제</td></tr><tr><td>포지티브 포토레지스트(AZ4620)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>플라스틱 튜브</td><td>콜-파머</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마이크로 기둥 미세 유체 장치에서 바이오 필름 보리 형성을위한 프로토콜

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

몇몇 세균 종은 표면에 부착 생물막 불리는 박막의 형태로 이들을 정착 할 수있는 능력을 갖는다. 다공성 매체에서 성장 바이오 필름은 폐수 처리 및 CO 2 격리 등의 여러 산업 및 환경 프로세스에 적합하다. 우리는 모방 다공성 지지체를 미세 유체 장치에서 biofilm 형성을 조사하기 위해, 슈도모나스 fluorescens 그람 음성 호기성 세균을 사용했다. 미세 유체 장치는 소프트 리소그래피를 사용하여 제조 된 마이크로 게시물의 배열로 구성되어 있습니다. 그 후, 흐름이 장치에서 biofilm 형성을 조사하고, 우리는 우리의 장치 깃발로 알려진 사상 바이오 필름의 형성을 보여줍니다. 제조 및 미세 유체 장치의 조립을위한 상세한 프로토콜은 세균 배양 프로토콜과 함께 여기에 제공됩니다. 마이크로 유체 장치와 실험에 대한 자세한 절차는 담당자와 함께 제공됩니다결과.

상술 한 미세 프로토콜을 이용하여 PDMS 기반의 미세 유체 소자를 제작 하였다. 1 주 사형 전자 현미경 (SEM) PDMS의 이미지를 보여준다 장치.도 1a는 상기 장치의 입구 부분을 나타낸다. 포크 모양의 입구는 장치에서 압력 헤드를 동일하게 만들어집니다. 또한 SEM 영상은 기둥 벽 (그림 1b) 거의 수직 것으로 나타났다. 배양 균액 (도 2)로 희석시키고, 그것의 광학 밀도가 0.1의 값으로 조정 하였다. 우리는 유입 흐름 속도의 함수로서 미세 유동 장치에 바이오 필름 형성을 조사 하였다. 때 P. fluorescens 0.8 μL / 시간, 세균성 부착 낮은 유량으로 장치에 주입하고, 바이오 필름 ​​형성 장치의 벽에서 발생. 심지어 장기간 (&gt; 20 시간) 후, 표면 포옹 생물막 이외 다른 박테리아 구조 없음 우리다시 관찰했다. 다음으로, 동일한 실험 8 μL / hr의 ...

다공성 매체를 모방한 미세유체 장치에서 생물막 형성 연구를 위한 프로토콜에 대해 논의합니다. microfluidic 장치는 마이크로 기둥의 배열로 이루어져 있고 이 장치에 있는 Pseudomonas fluorescens에 의하여 biofilm 대형은 조사됩니다.

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

본 절차의 전반적인 목표는 마이크로 필라(micro pillars)가 있는 미세유체 장치 내에서 박테리아 스트리머(bacterial streamers)의 형성을 입증하는 것입니다. 이는 먼저 미세유체 칩을 제작함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 테스트 대상 박테리아인 *Pseudomonas fluorescence*를 배양하는 것입니다.마지막 단계는 실험 장치를 조립하고, 미세유체 칩에 박테리아를 주입하며, 데이터를 수집하는 것입니다. 최종적으로, 형광 현미경 이미지를 통해 스트리머의 시간적 진화 과정을 결과로 보여줄 수 있습니다. 각 단계가 학습하기 까다롭기 때문에, 본 방법의 시각적 시연은 매우 중요합니다.본 실험의 학제적 특성으로 인해, 이 절차에는 심층 반응성 이온 식각(deep reactive ion etching)이 적용된 실리콘 웨이퍼가 필요합니다. 웨이퍼 상의 포토레지스트는 세척하여 제거해야 합니다. 마스터 몰드를 준비하는 것부터 시작하십시오.바이알에 트리클로로에틸렌 두 세 방울을 넣고, 몰드 디자인이 위를 향하도록 배치하여 데시케이터에 함께 넣습니다. 2~3시간이 지나면 몰드가 실로화(siloized)됩니다. 실로화가 진행되는 동안, PDMS 혼합물을 실리콘 베이스와 경화제를 10:1 비율로 준비합니다.그 다음 진공 상태에서 PDMS를 약 2시간 동안 탈기합니다. 이제 실란화 처리된 웨이퍼를 홀더로 옮기고, 기포가 생기지 않도록 주의하며 그 위에 PDMS를 붓습니다. 80 °C에서 2시간 동안 웨이퍼 위에서 PDMS가 경화되도록 둡니다.크기가 조절된 실리콘 몰드를 사용하여 A-P-D-M-S 스탬프를 제작합니다. 경화가 완료되면 커터를 사용하여 PDMS 스탬프를 떼어냅니다. 그런 다음 커터로 스탬프를 잘라 미세유체 칩으로 만듭니다.이제 코어 드릴을 사용하여 스탬프의 입구와 출구 위치에 구멍을 뚫습니다. 다음 단계는 스탬프를 유리에 접합하는 것입니다. 24 millimeter 커버슬립과 PDMS 스탬프를 30초 동안 산소 플라스마에 노출시킵니다.노광 후, 커버 슬립을 PDMS 스탬프의 바닥면에 부착하여 결합을 형성합니다. 이 조립체를 70 °C 오븐에 10분 동안 둡니다. 본 프로토콜의 과정을 완료하기 위해, 초순수로 제조하고 50 ~ 55 °C에서 50 µg/mL의 tetracycline을 첨가한 LB 플레이트를 준비합니다.플레이트를 부을 때, 화염 멸균을 통해 기포를 제거할 수 있습니다. 냉각 및 고체화된 플레이트는 날짜를 기입한 후 알루미늄 호일로 감싸 4 °C에서 보관해야 합니다. 또한, 초순수로 제조하고 50 µg/mL의 tetracycline을 첨가한 LB broth를 미리 준비하십시오.배지를 4°C에서 보관하고 알루미늄 호일로 감쌉니다. -80°C에 보관된 Pseudomonas fluorescence 배양 스톡을 LB 플레이트에 지그재그 패턴으로 스트리킹한 후, 30°C의 암소에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하여 갓 제조한 S1 배지가 담긴 플라스크에 접종하고, 150 RPM으로 진탕하며 30°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.배양 후 배양액의 광학 밀도를 측정하십시오. 그런 다음 S two 용액을 조제합니다. 플라스틱 튜브에 LB 5 mL를 넣고, 바이오필름 실험의 일반적인 값인 600 nm에서의 OD가 0.1이 되도록 S one 용액을 충분히 첨가하십시오.먼저, 핀셋을 사용하여 실험 장치를 설정합니다. 내경이 0.20 inches인 플라스틱 튜브를 준비된 칩의 입구와 출구에 연결합니다. 튜브는 유연해야 하며 길이가 충분히 길어야 합니다. 여기서는 약 20 inches의 튜브를 사용합니다.그런 다음 주사기에 S two 용액을 채웁니다. 30 gauge 뭉툭한 바늘을 장착하고 기포를 제거합니다. 특히 실험 시간이 길기 때문에 채널 내로 공기 방울이 유입되지 않도록 하는 것이 매우 중요한 단계입니다.기포는 박테리아에 의해 형성된 부드러운 구조를 손상시킬 수 있습니다. 그런 다음 주사기를 유입관에 연결하고 유출관을 폐기물 용기에 연결하십시오. 이제 주사기를 주사기 펌프에 장착하고, 배양 온도로 설정된 세포 챔버가 장착된 현미경에서 8 µL/h와 같이 원하는 유속으로 펌프를 설정하십시오.미세유체 칩을 관찰하기 위해 40x 대물렌즈를 사용하십시오. 이제 펌프를 작동시킵니다. 박테리아가 챔버로 유입되면 바이오필름 형성이 함께 시작됩니다.바이오필름은 수 시간에서 수일 동안 형성 및 성숙하며, 이미지 촬영을 통해 그 진행 과정을 추적합니다. SEMA로 제작된 미세유체 칩을 사용하여 이미징을 수행하였습니다. 장치 전체의 압력 수두를 균일하게 하기 위해 포크 형태의 입구가 만들어졌습니다.또한 기둥 벽면이 거의 수직임을 확인할 수 있습니다. 바이오필름 형성을 조사하기 위해 8 µL/h의 속도로 형광 물질을 장치에 주입하였습니다. 희석된 박테리아 배양액을 주입한 후 몇 분 뒤부터 바이오필름 형성이 시작되었습니다.하지만 몇 시간 후, 마이크로 필라 사이로 뻗어 나가는 filamentous 구조가 중간 부분 근처에서 관찰되었습니다. 점선 타원은 형성 중인 streamer를 표시하며, 이 streamer들은 한쪽 끝이 마이크로 필라 중 하나의 극 영역에 고정된 형태로 형성되었습니다. 또한 두 마이크로 필라 사이의 대각선을 따라 streamer가 관찰되었습니다.세포 분열뿐만 아니라 부유 세균의 유입으로 인해 스트리머의 두께가 시간에 따라 증가했습니다. 또한 시간이 지남에 따라 스트리머가 증식하여 장치 내의 많은 부피를 차지하게 되었으며, 이는 장치를 막을 수 있는 성숙한 바이오필름의 형성으로 이어졌습니다. 장치를 통한 흐름의 기계적 시뮬레이션 결과, 스트리머는 초기에 유선 방향으로 배열되는 것으로 나타났습니다.또한, 초기 단계에서는 유속이 가장 빠른 지점에서 스트리머(streamer)가 발생합니다. 이 영상을 시청한 후에는 미세유체 환경에서 바이오필름 스트리머가 어떻게 형성되고 진화하는지에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 박테리아를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 생물안전 프로토콜과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 세포 캡처 및 문화를 활성화할 수 있습니다 microfluidic 장치의 제조를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는 이러한 microfluidic 채널 내에서 홈과 같은 패턴 microstructures는 셀 수있는 부두 내에서 낮은 전단 응력 영역을 작성하는 데 사용됩니다.

세포 행동 유학을위한 그루브 패턴 Microfluidic 장치

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Microfluidic 가용성식이 중재 신호의 상호 작용을 조사하는 상피 세포 박테리아의 공동 문화

출처: Kurz, D. L. 외 다공성 매질에서 생체 클로깅을 연구하기 위한 마이크로플루이딕 플랫폼. J. Vis. 경험 (2022)이 영상은 바이오필름 형성을 연구하기 위해 마이크로플루이딕 장치를 사용하는 방법을 시연합니다. 박테리아 현탁액이 마이크로채널에 주입된 후 바이오필름 현상을 위해 배양합니다. 그 후 유동을 재개하고, 압력 모니터링과 영상을 사용하여 시간에 따른 바이오필름 형성과 기공 폐쇄를 감지합니다.

바이오필름 형성 중 실시간 영상 및 압력 추적을 위한 마이크로유체 장치

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높은 처리량의 사용<em&gt; 체외</em&gt; 미세 유체 시스템 구강 다중 종의 바이오 필름을 개발하는

생물막은 주변 환경과 복잡한 상호 작용을 합니다. 생물막-환경 상호 작용을 종합적으로 조사하기 위해 여기서는 생물막 개발을 위한 이질적인 화학적 환경을 조성하고, 국소 유속을 정량화하고, 생물막 군집 내부 및 주변의 질량 수송을 분석하는 일련의 방법을 제시합니다.

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유체 장치를 현미경 검사법과 유동 세포측정과 결합하여 공간 저울을 가로지르는 다공성 미디어에서 미생물 수송을 연구합니다.

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순차모세혈관 보조 어셈블리를 통한 미생물 및 미생물 입자의 패터닝

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다공성 매체의 생물 막힘을 연구하기 위한 미세유체 플랫폼

배우세요 미세 유체 칩에서 Pseudomonas fluorescens 바이오필름 스트리머 형성을 관찰하는 방법을. 형광 현미경으로 시간 경과에 따른 동역학을 시각화하여 다공성 매질 환경에서 세균 거동을 연구합니다.

마이크로 기둥 미세 유체 장치에서 바이오 필름 보리 형성을위한 프로토콜

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