높은 처리량의 사용 체외 미세 유체 시스템 구강 다중 종의 바이오 필름을 개발하는

이 절차의 전반적인 목표는 구성적으로 대표적인 다종 치태 생물막을 만드는 것입니다. 분석을 병행하여 먼저 대표적인 배지와 접종물을 만들어 이를 달성합니다. 접종물은 하룻밤 배양 후에 microfluidic 칩에 그 때 소개됩니다, biofilm는 마이크로 수로 안쪽에 형성합니다.

마지막으로, 생물막을 세척하고 염색하여 현장에서 2개의 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 검사 또는 에피 형광 현미경을 사용합니다. 플로우 셀과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 더 적은 재료를 사용하고 인공 실험실 배지가 필요하지 않으면서 여러 실험을 병렬로 수행할 수 있는 고처리량 시스템이라는 것입니다. 시작하려면 5명 이상의 지원자 코호트에서 개별 50ml 플라스틱 튜브에 타액 샘플을 수집합니다.

타액 샘플을 얼음 위에 놓인 하나의 플라스틱 비커로 끌어당깁니다. 타액 바이오폴리머는 유리 표면에 달라붙는 경향이 있으므로 이 설정에서 유리 비커를 사용하지 마십시오. 다음으로, 최종 농도가 2.5밀리몰이 될 때까지 샘플에 디 티오 3 구멍을 추가합니다.

얼음 위에서 10분 동안 저어줍니다. 모든 내용물을 여러 개의 플라스틱 튜브에 넣습니다. 섭씨 4도의 냉각 원심분리기에서 30분 동안 고속 스핀다운을 수행하여 샘플에서 미립자를 분리합니다.

타액 세이트를 신선하고 멸균된 용기로 옮기고 펠릿 분획을 폐기하여 샘플에서 박테리아가 없는 성장 배지를 준비합니다. 먼저, 당일 파편이 없는 샘플을 3가지 부피의 탈이온수로 희석합니다. 그런 다음 0.22 마이크로 저단백질 결합 멤브레인 필터를 사용합니다.

타액을 살균하면서 여과 후 분획을 얼음 위에서 차갑게 유지하십시오. 멸균된 용액을 웅변하고 필요할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 5명 이상의 지원자 코호트에서 50ml 이상의 멸균 플라스틱 튜브에 타액 샘플을 수집합니다.

타액 샘플을 실온의 사전 멸균 플라스틱 비커 또는 50ml 튜브로 끌어옵니다. 25%글리세롤이 될 때까지 멸균된 글리세롤을 추가합니다. 75%타액 혼합물에 도달합니다.

여과 단계로 오염 물질을 제거하는 성장 배지 프로토콜과 달리, 여기서는 비구강 특이적 박테리아 또는 곰팡이로 인한 오염을 방지하기 위해 멸균 기술이 중요합니다. 타액 글리세롤 용액을 섞습니다. 타액 글리세롤 혼합물을 분취하고 시작할 때까지 섭씨 영하 80도에서 샘플을 보관하십시오.

실온의 벤치에서 박테리아 음성 성장 배지와 박테리아 양성 접종물 모두에 대해 마이크로칩에 샘플을 접종하기 전에 여기에 표시된 것과 유사한 마이크로채널이 있는 마이크로유체 칩을 구입하거나 제작합니다. 주요 실험을 진행하기 전에 각 튜브를 5초 동안 소용돌이치며 혼합하고 마이크로칩 배출구 저장소에 100마이크로리터의 성장 배지를 추가하는 것으로 시작합니다. 컴퓨터 제어 펌프를 사용하여 2 분 동안 마이크로 채널을 통해 매체 깎아 지른 듯한 흐름을 시작합니다.

실온에서 각 채널을 육안으로 검사하여 유체가 적절하게 채워졌는지 확인하십시오. 마이크로칩을 실온에서 20분 동안 배양합니다. 이것은 마이크로 채널 측벽을 생체 고분자 골격으로 코팅하여 성장 중에 생물막이 고정됩니다.

그런 다음 배출구 저장소에서 수동으로 흡입하거나 남아 있는 매체를 전달하고 이 분획을 전송하면 이제 유체역학적 균형 부하 역할을 하여 입구 저장소로 이동합니다. 생체 고분자 골격 증착 후 100마이크로리터의 박테리아 양성 접종물을 배출구 저장소에 추가합니다. 마이크로칩을 섭씨 37도의 열판에 놓고 매체 전단 역류를 시작합니다.

배출구에서 흡입구 저장소까지 정확히 6초 동안 이동합니다. 그런 다음 펌프를 끄고 섭씨 37도의 정적 조건에서 40분 동안 칩을 배양하여 박테리아 또는 곰팡이가 마이크로 채널 측벽에 쉽게 부착할 수 있도록 합니다. 다음으로, 피펫으로 배출구 저장소에서 모든 접종물을 제거하고 버리고 1ml의 박테리아가 없는 성장 배지를 추가하여 동일한 저장소를 다시 채웁니다.

낮은 순류 하에서 약 20시간 동안 섭씨 37도에서 마이크로칩을 배양하여 하룻밤 동안 성장할 때 채널 내 생물막 성장을 촉진합니다. 입구와 출구 저장소 모두에서 모든 용액을 피펫으로 추출합니다. Inlet Reservoir에 100마이크로리터의 PBS를 바르고 마이크로 채널을 20분 동안 세척합니다.

입구에서 출구로의 낮은 순방향 흐름 아래에서 생물막은 이제 살아있는 데드 염색을 할 준비가 되었습니다. 생물막 염색 직전에 염색할 모든 채널에 대해 텍스트 프로토콜에 있는 생존도 염색 혼합물 100마이크로리터를 준비합니다. 바이오필름을 염색해야 할 때까지 이 용액을 빛에 노출되지 않도록 보호하고, 주입구에 남아 있는 모든 액체를 흡인하고, 동일한 저장소에 100마이크로리터의 생존력 염색 혼합물을 다시 채웁니다.

그런 다음 염색 용액을 마이크로 채널을 통해 45분 동안 밀어 넣습니다. 실온에서 낮은 점유율 흐름에서는 칩을 빛에 노출되지 않도록 보호하십시오. 입구 저장소에서 남아 있는 모든 액체를 흡입하고 100마이크로리터의 PBS로 다시 채웁니다.

과도한 결합되지 않은 염료를 제거하기 위해 실온에서 낮은 점유율 흐름으로 마이크로 채널을 20분 동안 세척합니다. 염색된 생물막은 이제 형광 현미경으로 생물막의 3차원 구조를 분석할 준비가 되었습니다. 컨포칼 현미경을 사용한 수평 스캔을 사용한 디지털 재구성을 사용하여 모든 경사각에서 전체 필름 구조를 볼 수 있습니다.

또한 살아있는 데드 염색 분석을 동일한 데이터 데이터 세트에 적용하여 다양한 화학 처리의 함수로 생물막 내부의 세포 생존율의 공간적 의존성을 연구할 수 있습니다. 생물막이 이미징되면 염색되지 않은 채널에서 세포를 추출할 수 있습니다. 높은 전단 흐름에서 작동하는 증류수를 사용하여 4 5 4 파이로 염기서열분석을 통해 게놈 DNA에서 생물막 식물군을 식별할 수 있습니다.

이 절차를 따릅니다. 다른 종 또는 화합물 추가 같이 다른 방법은 각종 조건 하에서 multi-species biofilms에 무슨 일이 일어나는지와 같은 다른 질문에 응답하기 위하여 실행될 수 있습니다.