높은 처리량의 사용

본 절차의 전반적인 목적은 성분 면에서 대표성을 갖는 다종 치태 바이오필름을 생성하는 것입니다. 분석을 위해 병행하여, 먼저 대표 배지와 접종액을 생성함으로써 이를 달성합니다. 하룻밤 동안 배양한 후 접종액을 미세유체 칩에 주입하면, 미세 채널 내부에 바이오필름이 형성됩니다.

마지막으로, 바이오필름을 세척하고 in situ 공초점 레이저 주사 현미경 또는 에피 형광 현미경 관찰을 위해 염색합니다. 유동 세포(flow cells)와 같은 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 적은 재료를 사용하고 인공 실험실 배지가 필요하지 않으면서도, 여러 실험을 병렬로 수행할 수 있는 고처리량 시스템이라는 점입니다. 우선, 5명 이상의 자원봉사자 그룹으로부터 각각 50 milliliter 플라스틱 튜브에 타액 샘플을 수집하십시오.

얼음 위에 놓인 단일 플라스틱 비커에 타액 샘플을 모읍니다. 타액 바이오폴리머는 유리 표면에 부착되는 경향이 있으므로, 이 과정에서 유리 비커의 사용은 피하십시오. 다음으로, 최종 농도가 2.5 mM이 되도록 샘플에 dithiothreitol을 첨가합니다.

혼합물을 얼음 위에서 10분 동안 교반합니다. 모든 내용물을 여러 개의 플라스틱 튜브에 옮깁니다. 4°C로 냉각된 원심분리기에서 30분 동안 고속 원심분리를 수행하여 시료에서 입자들을 분리합니다.

샘플로부터 박테리아가 없는 배양액을 준비하기 위해, 타액 상층액을 새 멸균 용기에 옮기고 펠렛 분획은 폐기합니다. 먼저, 잔해물이 제거된 샘플을 탈이온수로 3배 부피만큼 희석합니다. 그 다음 0.22 µm 저단백 결합 멤브레인 필터를 사용합니다.

여과 후 분획물을 얼음 위에 올려 냉각 상태로 유지하면서 타액을 멸균합니다. 멸균된 용액을 분주하여 필요할 때까지 -80°C에서 보관합니다. 5명 이상의 자원봉사자 집단으로부터 멸균된 50 mL 플라스틱 튜브에 타액 샘플을 수집합니다.

타액 시료를 실온의 멸균된 플라스틱 비커 또는 50 milliliter 튜브에 옮깁니다. 25% glycerol과 75% 타액의 혼합 비율이 될 때까지 멸균된 glycerol을 첨가합니다.

여과 단계로 오염물을 제거했던 배지 프로토콜과 달리, 여기서는 구강 특이적이지 않은 박테리아나 진균으로 인한 오염을 방지하기 위해 멸균 기술이 중요합니다. 타액 글리세롤 용액을 혼합하십시오. 타액 글리세롤 혼합물을 적절히 분주하고, 사용하기 전까지 샘플을 -80 °C에서 보관하십시오.

박테리아 음성 성장 배지와 박테리아 양성 접종액을 상온의 벤치 위에서 마이크로칩에 접종하기 전, 여기에 표시된 것과 유사한 마이크로채널이 있는 마이크로플루이딕 칩을 구매하거나 제작하십시오. 본 실험을 진행하기 전 각 튜브를 5초 동안 볼텍싱하여 혼합하십시오. 먼저 마이크로칩의 유출 리저버에 100 µL의 성장 배지를 첨가합니다. 컴퓨터 제어 펌프를 사용하여 2분 동안 마이크로채널을 통해 배지의 전단 흐름을 개시하십시오.

실온에서 각 채널을 육안으로 검사하여 유체가 제대로 채워졌는지 확인합니다. 마이크로칩을 실온에서 20분 동안 배양합니다. 이 과정을 통해 마이크로채널의 측벽에 바이오폴리머 스캐폴드가 코팅되며, 바이오필름이 성장하는 동안 이곳에 고정됩니다.

그런 다음 배출 리저버(outlet reservoir)에서 남은 배지를 수동으로 흡입하여, 이를 유체역학적 균형 부하(hydrodynamic balancing load) 역할을 할 유입 리저버(inlet reservoir)로 옮깁니다. 바이오폴리머 스캐폴드 증착 후, 박테리아 양성 접종액 100 µL를 배출 리저버에 추가합니다. 마이크로칩을 37 °C 핫플레이트에 올리고 배지 전단 역류(medium shear reverse flow)를 시작합니다.

배출구에서 유입구 저장조까지 정확히 6초 동안 이동시킵니다. 그 후 펌프를 끄고 37 °C의 정적 조건에서 40분 동안 칩을 배양하여 박테리아 또는 진균이 미세채널 측벽에 부착되도록 합니다. 다음으로, 피펫을 사용하여 배출구 저장조에서 모든 접종물을 제거하여 버리고, 동일한 저장조에 박테리아가 없는 성장 배지 1 mL를 추가하여 다시 채웁니다.

하룻밤 동안의 배양을 통해 채널 내 바이오필름 성장을 촉진하기 위해, 마이크로칩을 37 °C에서 저전단 흐름 하에 약 20시간 동안 배양합니다. 유입구 및 유출구 리저버에서 모든 용액을 피펫으로 제거합니다. 유입구 리저버에 100 µL의 PBS를 넣고 20분 동안 마이크로 채널을 세척합니다.

입구에서 출구 방향으로 낮은 전단 전방 흐름을 유지하는 상태에서, 바이오필름은 이제 생사 염색(live dead staining) 준비가 완료되었습니다. 바이오필름 염색 직전에, 염색할 각 채널당 텍스트 프로토콜에 명시된 생존능 염색 혼합물 100 µL를 준비하십시오. 이 용액은 바이오필름을 염색할 때까지 빛에 노출되지 않도록 보호하십시오. 입구에서 남은 모든 액체를 흡입하여 제거한 후, 동일한 저장조에 생존능 염색 혼합물 100 µL를 다시 채우십시오.

그다음 염색 용액을 마이크로채널로 45분 동안 흘려줍니다. 실온에서 낮은 전단 유량(shear flow)으로 진행하며, 이때 칩이 빛에 노출되지 않도록 주의하십시오. 입구 저장소(inlet reservoir)에 남은 모든 액체를 흡입하여 제거하고 100 µL의 PBS로 다시 채웁니다.

결합되지 않은 과잉 염료를 제거하기 위해 실온에서 낮은 전단 흐름 하에 마이크로채널을 20분 동안 세척합니다. 이제 염색된 바이오필름은 바이오필름의 3차원 구조를 분석하기 위한 형광 현미경 관찰 준비가 완료되었습니다. 공초점 현미경을 이용한 수평 스캔 기반의 디지털 재구성을 통해 임의의 사선 각도에서 필름의 전체적인 구조를 관찰할 수 있습니다.

또한, 동일한 데이터 세트에 생사 염색 분석(live dead staining analysis)을 적용하여 서로 다른 화학적 처리에 따른 바이오필름 내부 세포 생존력의 공간적 의존성을 연구할 수 있습니다. 바이오필름의 이미징이 완료되면, 염색되지 않은 채널에서 세포를 추출할 수 있습니다. 높은 전단 유량으로 작동하는 증류수를 사용하여, 4 5 4 pyro sequencing을 통해 게놈 DNA로부터 바이오필름 미생물군을 식별할 수 있습니다.

이 절차를 따르십시오. 다양한 조건 하에서 다종 바이오필름에 어떤 현상이 발생하는지와 같은 다른 질문에 답하기 위해, 서로 다른 종이나 화합물을 추가하는 것과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.