Name: 행동을 한 꿀벌 두 신경 처리 단계에서 동시 장기 녹음 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: 학습하세요 꿀벌의 후각 처리 및 기억 형성을 위한 두 뇌 영역 동시 장기 전기생리학 기록 기법. 다채널 전극을 활용하여 행동 중인 개체의 신경 활동을 안정적으로 측정하는 방법을 익히세요.

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저자는 전극 삽입 측을 추적해 준 Isabelle Reus, LabView 프로그래밍을 담당한 Tobias Rosenbaum, 데이터 분석 및 유용한 토론을 제공한 Anneke Meyer에게 감사를 표합니다. 전극 개발의 초기 단계에서 논의와 실질적인 도움을 준 Randolf Menzel에게 감사드립니다. 또한, MS-B에 대한 박사 후 연구원 협회에 대해 Brian Smith에게 감사드립니다. 이 작업은 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2)의 지원을 받았습니다.

1. 전극 건물 (그림 1) <ol><li> 상업적 멀티 채널 앰프 시스템 1,2,25의 전극 인터페이스 보드를 적합하다 전극 어댑터의 제조. <ol><li> 18 핀 커넥터베이스에 붙어있는 작은 플렉시 글라스 판을 사용합니다. </li><li> 플렉시 글라스 판에 나사 3 별도의 납땜 러그에 절연 전선 3 짧은 조각 (그림 1 A1-A3)와베이스를 연결합니다. </li><li> 유리 모세관 쉽게 이동할 수 있으며, 나사에 의해 고정 할 수있는 플렉시 글라스 판에 홈 (그림 1 B1)를 삽입합니다. </li><li> minutien 핀을 사용하여 5mm에 대한 유리 모세관을 확장합니다. </li><li> 안정화 및 지원을 보장하기 위해 minutien 핀과 유리 모세관을 따라 미세 전극 와이어를 연결합니다. </li></ol></li><li> 다중 채널 마이크로 와이어 생산 (Ryuichy 오카다 (32, 33)에서 채택) <ol><li> 스팬 3 마이크로 와이어 (폴리 우레탄 코팅 된 구리 와이어, 15그들은 서로 옆에 배치하는 방법 (그림 1 B2) μm의 직경). </li><li> (전극의 끝) (그림 1 B3)들을 함께 접착제로 부분적으로 전선을 따라 저 융점 치과 왁스의 박막 (50 °의 C)를 확산하기 위해 12 V 납땜 바늘을 사용합니다. 이 섹션이 전극 어댑터 마이크로 와이어를 연결하기 위해 나중에 사용됩니다 같은 것은 unglued 몇 센티미터 (전극의 끝을한다). </li></ol></li><li> 전극 어댑터에 멀티 채널 마이크로 와이어를 연결합니다 <ol><li> 홀더에서 유리 모세관을 제거하고 전극의 끝 부분에 minutien의 핀으로 연결합니다. 마이크로 전극 (그림 1의 B3)에 평행 한 위치로 가져 오십시오. </li><li> 저 융점 치과 왁스를 사용하여 minutien 핀에 전극의 끝 부분을 접착제와 (작은 화살표가 1 B3 그림) minutien 핀에서 전극의 끝 부분 2 ~ 3 센티미터 돌출 끝에 마이크로 전극을 잘라. </li><li> 모세관 SL 슬립ightly 다시 전극 어댑터에. (그림 1 B4) 고정 나사를 사용합니다. </li><li> 절연의 용융 (그림 1 B4)을 보장하기 위해 약 360 ° C의 온도와 납땜 총을 사용하여 납땜 러그에 3 개의 와이어의 느슨한 끝을 납땜. 납땜 한 후, 적절한 전기 접점 (~ 300 옴)이있는 것을 확인합니다. </li><li> headstage의 전극 인터페이스 보드에 전극 (마스터) 중 하나를 장착하고 별도의 어댑터의 다른 멀티 채널 전극 (슬레이브)를 고정합니다. 마스터 전극 (그림 1 C1)에 슬레이브의 채널을 연결합니다. 또한, 마스터 전극베이스에 기준뿐만 아니라 근육 전극 (도 1 C2)를 납땜. </li></ol></li></ol> 2. 비 준비 (그림 2) 이러한 설명 실험에서, 무척추 동물 인 꿀벌 (아피스의 mellifera)따라서 사용에 대한 구체적인 윤리 허가, 사용을 필요로하지 않습니다. <ol><li> 다른 사람 (34, 35)에 의해 그림과 같이 아침에 벌집 입구에서 꿀벌 일벌 (A.의 mellifera)을 잡아라. </li><li> 고정 (5 ~ 10 분)까지 짓 눌린 된 얼음에 꿀벌을 차리고 머리가 노출되는 방법 (그림 2)에서 표준 플렉시 유리 홀더 또는 금속 튜브를 고정합니다. 최소화하기위한 머리의 움직임은 저 융점 치과 왁스 (~ 50 ℃) 사용 및 그 화합물 눈과 목의 기초 주위의 홀더에 조심스럽게 머리를 고정합니다. </li><li> 편모를 건드리지 않고 머리 캡슐 (그림 2 B)에 안테나의 SCAPI을 흥분하는 저 융점 왁스를 사용합니다. 안테나의 편모는 앞으로 지적 할 필요가있다. 꿀벌 자유롭게 그것의 코를 이동할 수 있는지 확인합니다. </li><li> 방해받지 않고보기와 머리의 정상에 접근을 보장하기 위해 머리 캡슐을 면도. </li><li> saturati까지 30 % 자당 용액을 벌 피드뇌 조직과 동물의 좋은 생존 (그림 2 C)의 충분한 가습을 보장하기에. </li><li> 수직 복합 눈의 국경을 따라 수평으로 더듬이 기초 위에뿐만 아니라 ocelli 아래주의 절개를 확인하고 표피의 느슨해 조각 (그림 2 D)를 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 인후 분비를 따로 설정하고 밝은 전망 그리고 삽입 (그림 2E, 2F)를 전극 이전에 뇌에 대한 접근을 보장하기 위해 기관을 제거합니다. </li></ol> 3. 전극 삽입 도 2에 도시 된 예시적인 경우에서, 하나의 전극은 L-ALT, m-ALT 2에 조준되는 다른 하나의 목표 위치된다. 특정 마크를 사용하여, 다른 대상 영역은 예를 AL 및 MB 출력 영역 1,도 가능하다. <ol><li> (관심 영역에 미세 조작기를 이용하여 전극의 위치를 <stroNG&gt; 그림 2G 및 3A). M-ALT 장소에게 AL 및 내측 MB의 수직 로브에서의 전극을 대상으로. 내 외측 ALT PN의의 분기점 이상되는 삽입 부위를 확인합니다. 약 180 μm의 (그림 2E)의 깊이와 뇌에 전극을 돌출. 전극 수직 로브와 AL의 중간의 측면 사이에 가상의 선을 중간에 가로 protocerebrum (LH) 아래 L-ALT PN 기록 장소. 약 300 μm의 (그림 2E)의 깊이에 전극을 삽입 </li><li> 표피에 작은 상처를 통해 동측 화합물 눈에 참조 (실버 와이어, 약 25 μm의 직경)를 삽입합니다. 측면 ocelli 아래의 근육 투사 영역에 다른 실버 와이어를 삽입합니다. 참고 : 필요한 경우 꿀벌의 학습 행동은 나는 관여하는 근육 M17을 기록하여 높은 시간 정밀도로 모니터링 할 수 있습니다N 꿀벌 (36)의 코 확장 응답 (PER)은 같은 25에 설명. </li><li> 단단하게, 뇌와 머리 캡슐 내에서 전극을 고정 건조에서 머리를 방지 할 두 개의 구성 요소 실리콘 (그림 2H)와 두뇌 위의 전체 공간을 커버합니다. 참고 : 녹음이 일까지 시간 동안 지속 할 수 있으며, 꿀벌, 예를 들어 고전적인 조절 절차 (그림 2H) 동안 기록 할 수 또는 다른 냄새의 큰 패널을 자극 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 데이터 수집 및 전처리 <ol><li> 다음과 같은 요구 사항을 충족하는 적절한 수집 소프트웨어 사용 분 25 kHz에서의 샘플링 속도를; 아날로그 1.25 또는 전극 채널 간의 디지털 2 교차 분화; 밴드는 스파이크 이벤트를 추출하는 8,000 Hz로 300 Hz에서에서 필터를 통과한다. </li><li> 관음사 예를 들어, 하나의 단위 활동을 추출하기 위해 사용 가능한 스파이크 정렬 소프트웨어를 사용하여Spike2 소프트웨어 (그림 3)에 포함되어있는 매칭 기술을 먹었다. </li><li> 추가 분석을 위해 (그림 4) 또는 주성분 분석 (PCA)에 인구 벡터를 계산하기 위해 (그림 5) 상용 소프트웨어를 사용하여 냄새의 응답을 평균 한 단위를 계산하기 위해 추출 단위의 타임 스탬프를 사용합니다. 또한 하나의 단위 인구 응답 지연을 분석하는 것은 최근의 간행물에게 1,2,25을 비교한다. </li></ol> 5. 상대 전극 위치의 시각화 (그림 4) <ol><li> 알렉사 568 또는 알렉사 전에 기록 실험 0.5 M 염화 칼륨 용액에 용해되어 488 드라 자이드 5 %를 하이 드라 자이드 5 % 하나의 용액 중에 전극 팁을 찍어. </li><li> 꿀벌 링거액과 함께 뇌를 씻어, 실험 후 조심스럽게 전극과 커버 실리콘을 제거, 동맥 및 기관을 제거하고 tetramethylrhodami의 작은 결정을 삽입N 덱스 트란 또는 anterogradely 알츠 레이블을 AL에 1.0 M 칼륨 아세테이트에 해결 5 % 용액을 삽입합니다. 어둠 속에서 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 염료가 흡수하고 또 다른 30 ~ 45 분 동안 벌 링거 용액으로 3 회 뇌를 세척하기 전에, 자신의 축삭 책자 (30 ~ 45 분) (그림 4A)를 따라 투영 뉴런에 의해 수송 될 수 있습니다. </li><li> 고정 될 때까지 얼음에 꿀벌을 차리고 조심스럽게 머리 캡슐에서 뇌를 제거합니다. 4 %의 포름 알데히드를 함유하는 0.1 M PBS 용액으로 세척하여 뇌를 흥분하고 4 ℃에서 하룻밤 보관 </li><li> 0.1 M PBS (10 분마다)으로 뇌를 두 번 세척하기 전에 최소한 12 시간을 기다립니다. </li><li> 0.2 %의 20 분 동안 뇌 3X 흘려 트리톤 오름차순 주류 시리즈 (30 %, 50 %, 70 %, 90 %, 95 %, 3 X 100 % 에탄올, 20 분에 탈수 전에 0.1 M PBS에 희석 X-100 각 단계). </li><li> 현미경 슬라이드와 s에 Methylsalicylate의 탈수 뇌를 포함커버를 슬라이드로 평가 보증 등급 (EAL). </li><li> 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 고조파 화합물 계획 고차 색지움 목표 (10X 0.4 NA 침수)를 사용하여 모든 2-5 μm의 광 섹션으로 뇌를 스캔 할 수 있습니다. 568 nm의 tetramethylrhodamin 덱스 트란에 대한 파장과 전극의 위치에 대한 488 ㎚의 파장을 이용하여 조직을 자극. </li><li> 복원 소프트웨어 (예. AMIRA 또는 피지) (그림 4)와 3 차원 이미지 스택에서 스테인드 뇌 구조와 전극 경로를 재구성. </li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

이 문서는 생산 및 맞춤 설계 다중 채널 마이크로 와이어 전극의 사용 방법을 보여줍니다. 설명 전극을 하나의 단위 및 (자세한 내용은 1,2,25 참조를 위해) 하나의 표본 내에서 지연 시간 측정과 다른 뉴런과 다른 neuropils의 다른 시간 응답 특성에 특히 유용 인구 활동을 모두 기록하기에 적합하다. 또한 우리는 영구적 일까지 시간 동안 지속 꿀벌을 행동에 안정적인 장기 녹음을 할 수 있도록 마이크로 와이어 전극을 구현하는 방법을 보여 주었다. 세포 외 멀티 유닛 녹음은 공간 정보와 결합 된 높은 시간 해상도를 달성하기 위해 유리한 도구가되었다. 우리의 경우에, 이러한 병렬 신경원 소책자 또는 2 개의 상이한 neuropils 어느 하나이다. 다수의 뉴런 병렬 단일 뉴런 수준 및 높은 시간 해상도로 기록하고 분석 할 수있다. 다중 단위 기록41 - INGS 먼저 곤충 39 나중에 포유 동물 (38)에 적용 하였다. 실질적인 진전은 세포 외 멀티 채널 기록하는 기술 42,43의 개발 및 개선을 달성 하였다. 이것은, 예를 들어, 새로운 전극 (44) 또는 신규 스파이크 정렬 및 클러스터링 알고리즘 (45)의 개발을 포함한다. 48 - 세포 외 여러 장치에 기록하는 기술의 일반적인 방법이 아니라 46에 설명되어 있습니다. 이 비디오에 표시된 자체 내장 된 전극을 추가로 더 전극 당 microwires 또는 마이크로 와이어가 팁 사이에 측정 가능한 일정한 거리를 얻기 위해 트위스트 수를 추가하여 적용 할 수 있습니다. 두 절차는, 그러나, 유연성을 감소시키고, 전극의 두께를 증가로 이어질 것이다. 일반적으로 매 나방, 메뚜기와 바퀴벌레 40,49 같은 훨씬 더 큰 곤충 세포 레코딩에 사용되는 실리콘 프로브에 비해 - </SUP&gt; (51) 기술 마이크로 와이어 전극, 유연 작은 잠재적 인 뇌의 움직임에 쉽게 대응할 수 있고, 따라서, 안정적으로 훨씬 광범위한 행동 레퍼토리를 보여 꿀벌과 개미 같은 작은 곤충 사회에서 사용할 수 있습니다. 설명 마이크로 와이어, 라운드 유연하고 작고 목표는 오래 공부하면 분명 장점이 주위 조직에 따라서 덜 해로운 동안 대부분의 실리콘 프로브는, 자신의 삽입 채널을 따라 축삭과 신경 조직을 절단 구조와 같은 날카로운 생크가 손상 및 행동 동물의 장기 소성. 마이크로 와이어 전극의 또 다른 장점은 저비용 제조 및 취급이 용이하다. 대신 정중 비싼 실리콘 프로브 세정 전극 와이어는 갓 그러므로, 혼잡의 결여 문제를 종래의 뇌에 삽입 컷된다. 또한 그것은 하나를 다른 하나 neuropiles O 삽입 동일한 제제에 하나 이상의 마이크로 와이어 전극을 사용하는 것이 가능하다R 책자 2 우리는 여기에서 보여준다. 이 방법은 다른 신경 처리 수준에서 응답 대기 시간 및 상호 작용 같은 시간적 측면을 분석하고 비교하는 것이 특히 바람직하다. 우리는 세포 외 기록 된 신호가 그 자체로 단일 세포 활성을 반영하지 않는다는 사실을 인식하고있다. 항상 전극 팁 주위 전압 활성 화합물이다. 하나의 전극 사이 인접한 두 마이크로 와이어 채널의 차이가 항상 계산 신호의 소스를 정확하게. 따라서 단일 유닛 활동을 추출하는 데 스파이크 신호 소스는 항상 하나 또는 쉽게 구별 스파이크 파형 발생 다른 전극 채널 중 하나에 매우 근접했다. 멀리에서 신호는 이웃 neuropils의 근육 활동 또는 활동과 같이 비슷한 모양과 진폭을 불러 일으키는 동시에 두 전극에 도달하고이 절차에 의해 삭제됩니다. Spike2의 템플릿 정합 기법을 사용우리는 동일하지 않습니다 하나의 유닛 활동을 얻기 위해 매우 확신하지만, 하나의 신경 세포의 활동에 매우 가깝습니다. 그러나, 스파이크의 정렬 문제는 세포 내 레코딩 기술을 사용하여 회피 될 수있다. 날카로운 전극 또는 패치 피펫 하나 단일 세포 기록은 단일 신경 세포의 생리적 특성에 대한 심층적 인 지식을 할 수 있습니다. 그러나, 작은 곤충 뉴런의 크기와 자신의 신경 돌기 (꿀벌 PN이 52 예. 미만 1 μm의)에만 단기 녹음 관리 할 수 있습니다. 또한, 내 휴대 전화 기록은 침략있을 가능성이 시간 제한에 대한 또 다른 이유는 세포에 손상을 줄 수있는. 곤충의 생체 세포 내 기록은 거의 한 시간보다 더 오래 갈 수 없습니다. 단일 식별 신경, 복부 짝 maxilar 신경 # 1 (VUMmx1)에서 세포를 기록 마틴 해머 (53)의 선구적인 작업을위한 충분있는 시간이 길어집니다. 그는 내가 할 수직접 보상 경로에 잉크의 활동. 율리아 Mauelshagen (54)는 세포 내에서 식별 된 버섯 신체 외부의 신경 세포의 활동을 등록, 고전적 조건 중 한 Pedunculus 외인성 신경 # 1 (PE1). 그들은 케년 세포의 전기 자극 후 LTP를 발견했을 때 동일한 신경 세포는 멘젤과 만츠 (55)의 초점이었다. 그러나 오카다와 동료 (56)는 세포 외 녹음하는 동안 PE1의 식별을 위해 세포 내에서 잘 특성화 급상승 패턴 (더블, 트리플 스파이크)를 사용할 수 있습니다. 두 가지 방법을 모두 조합 한 후, 확인 된 신경 세포와 세포 외 장기 녹음에서 세포 내 기록은 미래의 연구를위한 강력한 도구가 될 수 있습니다. 그러나, 그들의 시간 반응 관계 및 / 또는 플라스틱의 변화를 분석하는 일까지 많은 시간 동안 다른 처리 레벨에서 동시에 여러 개의 셀 (단위)를 기록하는 날카로운 전극을 사용하여 전거의 불가능하다. 62 - 제 칼슘 이미징 칼슘 민감 염료를 사용하여 꿀벌에서 57,58 접근과 악취 응답의 공간 패턴의 분석은 59 접근되었습니다. 그러나, 많은 경우에 칼슘 민감 염료 다시 꿀벌의 수명 및 분석 세포의 본질적인 특성을 제한 침습 조작을 통해 뇌 조직에 도입되어야한다. 이 문제는 유전자 도입 칼슘 센서 63, 64을 사용하여 초파리와 같은 다른 모델 생물 극복된다. 그들은 가능​​성 악취 응답의 시간적 특성에 영향을 미치는 칼슘 버퍼로서 작용할 수로하지만, 일반적으로, 칼슘 센서는 다른 제한을 도입 할 수 있습니다. 칼슘 이미징 또는 계산 방법과 함께 동시 세포 내 기록은 영상의 적절한 시간 해상도는 65, 66를 처리 증명할 수 있습니다. 그러나, 화상 형성 공정 자체의 시간 해상도는 신속한이다R 제한. 2 광자 이미징 빠른 시퀀스 (68)를 획득 할 수있을 수도 있지만 광학 수집 시스템은 보통 5 ~ 20 Hz에서 67 시간 분해능으로 CCD 이미징을 사용합니다. 그러나, 증가 샘플링 속도는 항상 공간 해상도의 손실과 함께 간다. 또한 꿀벌에 사용 칼슘 민감 염료는 획득 시간 (69)을 감소 표백을 겪는다. 곤충의 다른 생리 학적 기록 기술에 비해 유연한 멀티 채널 마이크로 와이어 전극을 하나의 단위와 꿀벌 행동 인구의 연결 활동에 오랜 시간 접속을 보장합니다. 우리는 서로 다른 기록 사이트 간의 시간적 부호화 양태의 분석을 용이하게 동일 동물에서 상이한 처리 단계에서 이들 두 전극을 사용하는 방법을 설명했다. 연구 문제와 여기에 설명 전극 건물의 기본 방법 곤충 모델에 따라 쉽게 확장된다수 및 / 또는 적용 할 수 있습니다. 예를 들어 그것은 다 채널 전극을 생성하기 위해 세 번의 와이어 이상을 사용하도록 고려된다. 또한, 기록 위치의 숫자는 연장 이상의 소책자 또는 neuropils의 시간적 측면을 관찰하는 것은 가능하다 할 수있다. 우리의 희망은이 방법은 많은 과학자를 격려하고 작은 두뇌의 복잡한 신경 처리의 이해에 긍정적으로 기여할 것입니다.

꿀벌뿐만 아니라 다른 대부분의 곤충은 주로 후각에 의존하고 있습니다. 다른 사람의 사이에 그들은 방향, 짝짓기, 동종와의 통신 및 채집을 위해 후각 신호를 사용합니다. 그들의 잘 정교 후각 시스템은 꽃 냄새 자극에 관련된 학습 행동의 풍부한 레퍼토리에 기여한다. (- 5 리뷰가 3 참조) 이러한 문제가 쉽게 제어 실험실 조건에서 공부하실 수 있습니다. 뉴런의 상대적으로 작은 숫자와 그들의 &quot;미니 두뇌&quot;(info 참조 6) 꿀벌의 후각 코딩을 공부하고 신경 활동의 모니터링 기간 동안 학습을위한 적합 모델 생물한다. 곤충뿐만 아니라 포유 동물의 후각 시스템 (검토를 위해 7,8 참조) 훌륭한 정도 유사한 구성을 보여줍니다. 꿀벌의 안테나 (10, 11)을 따라 sensillae에 위치한 약 80,000 수용체 뉴런 9 neur에 환경 냄새 자극을 번역ONAL 신호. 후각 수용체 뉴런의 축색 돌기는 척추 동물의 후각 망울에 비해 사구체 조직이 더듬이 로브 (AL)를 신경을 분포시키다. AL은 약 4,000 지역의 interneurons (LN)에 의해 서로 상호 연결에 대한 164 사구체를 포함한다 (검토를 위해 12 참조). 특히 꿀벌로는 림프절 누덕 누덕 기운 측면 연결을 제공하고 다른 모집단이 원소와 configural 후각 코딩 특성 (13, 14)을 가지고 있다는 것이 최근에 밝혀졌다. AL은 내측과 외측 더듬이 로브 기관 (M-및 L-ALT 상승을주는 복부와 지느러미 헤미 로브로 분할되는 것으로 도시되었다 이전에 M-및 내측 및 외측 더듬이 로브 protocerebral에 대한 L-APT 되나 ) 17 - 15 기관. 여기에 곤충 뇌의 통합 명칭에 대한 최근의 노력에 의해 도입 된 새로운 기관 용어 (18)이 사용됩니다. 두 ALTS는 (L-및 m-ALT) 410 (L-ALT) 또는 510 (M-ALT) uniglomerular proje 하나를 결합ction의 뉴런 (PN), 각각 15,16,19. 두 책자의 PN이 최근 (검토를 위해 17, 20 참조) 병렬 2의 코드 냄새로 표시되었습니다, 두 책자는 시냅스 케년 세포 (KC), 버섯 몸 (MB)가 교장 뉴런 분기 연결을 형성한다. 23 - 각 MB는 약 172,000 관세청 (21)를 포함하고 있습니다. 매크로 블럭은 자극 통합, 학습 및 기억 형성에 관여하는 것으로 알려져있다. Vertica의 또는 알파 - 로브 수평 또는 베타 - 로브 (22, 24) : 관세청의 AXO의 수상 돌기는 두 가지 출력 영역이 꽃자루 (버섯의 줄기)를 형성한다. MB의 출력은 약 400 외인성 뉴런 (EN) (24)에 수렴한다. 후각 정보 처리에 대해 책임이 대부분 수직 돌출부 (22)의 복부 측면에 분포 ENS. 최근에는이 지역에서 기록 EN들이 냄새 보상 협회 (25)를 인코딩하는 것으로 나타났습니다. 같은 시간29 - 곤충뿐만 아니라 척추 동물의 후각 시스템 내에서 pects는 잠재적 인 코딩의 원리 (26)와 같은 중요하고 중요한 부분이되었다. 동시에 높은 시간 해상도에서 다른 사이트에서 여러 개의 뉴런을 기록 할 수 있으려면, 우리는 꿀벌과, 후각 시스템에서 다른 대상 지역에 도입 된 사용자 정의 멀티 채널 와이어 전극을 사용하여 이중 멀티 유닛에 기록하는 기술을 설립했다. 이 방법은 하나의 뉴런과 평행선 후각, 이중 후각 통로 2 또는 다른 후속 neuropils 1 사이 신경 세포의 집단의 수준에서 꿀벌의 후각 시스템에서 시간 처리를 분석하고 비교하는 가능하게한다. 최근 전극의 다른 구성을 사용하는 로커스트 후각 시스템 (30)에서와 유사한 방식으로 실험 배경 불변 악취 인식 (31)을위한 시공간 부호화 메커니즘을 분석 할 수 있었다. 일우리, 기존 듀얼 레코딩 동시 연결 활동 프로파일에 대한 공간 정보를 수집 수 있습니다. 칼슘 이미징에서 얻은 넓은 공간 샘플링에 비해이 방법은 두 가지 지점에서 녹음을 할 수 있습니다. 그러나, 칼슘 이미징 기술에 비해 장점은 종래의 CCD 촬상 또는 2 광자 촬상 취득 하나에 의해 제공 될 수없는 활동 전위 기록의 높은 시간 정밀도이다. 여기에 설명 된 세포 전극은 영구적으로 이식 된 전극 드리프트를 방지 뇌와 머리 캡슐에 상대적으로 고정되어 있습니다. 이것은 날카로운 세포 내 전극의 사용에 비해 명확한 이점이다. 세포 내 기록과 칼슘 이미징에 비해 또 다른 장점은 많은 시간의 일에 이르는 확장 된 신경 관측 시간입니다. 이것은 학습과 기억 형성의 신경 상관 관계를 조사하는 중요한 전제 조건입니다. 다중의 추가 혜택단위 기록은 더 토론 섹션에 설명되어 있습니다. 이 방법론 개요에서는 사용자 정의 디자인 와이어 전극의 제조 과정이 표시됩니다 (32, 33)에서 적응과 꿀벌의 뇌의 장기 멀티 유닛 녹음에 적합. 또한, 전극의 이러한 유형은 영구적 동시에 기록하는 꿀벌 후각 시스템 내의 두 개의 다른 기록 사이트에서 주입되는 방법 예 L-많은 자극 프로토콜을 허용하는 긴 기간 동안 m-ALT는 2를 나타낸다. 기록 위치의 확인을 위해 기록 사이트의 염색 및 후 기록 시각화에 대한 예제 및 프로토콜이 제공된다.

<table><tbody><tr><td>파라핀 오일</td><td>Fluka</td><td>76235</td><td></td></tr><tr><td>오더스</td><td>시그마 알드리치&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>4% 포름알데히드</td><td>ThermoScientific</td><td>28908</td><td>메탄올 무함유</td></tr><tr><td>Triton X</td><td>BioChemica</td><td>A1388</td><td></td></tr><tr><td>메틸살리실레이트</td><td>Roth</td><td>4529.1</td><td></td></tr><tr><td>테트라메틸로다민 덱스트란, 10,000MW(마이크로루비)</td><td>Invitrogen</td><td>D7162</td><td>keep</td></tr><tr><td>dark Alexa 488 히드라지드</td><td>Invitrogen</td><td>A-10436</td><td>keep dark</td></tr><tr><td>Alexa 568 hydrazide</td><td>Invitrogen</td><td>A-10437</td><td>keep</td></tr><tr><td>dark Bee Ringer Solution</td><td>Brill et al.2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polyurethane-coated copper wire</td><td>Elektrisola</td><td>15 &micro 참조; M 직경 & P155 단열재</td><td></td></tr><tr><td>치과 왁스&nbsp;</td><td>Densply Detrey</td><td>64103015S1</td><td>중간 용해점</td></tr><tr><td>치과 왁스</td><td>Flexaponal&nbsp;</td><td>124-202-00</td><td>저융분 왁스</td></tr><tr><td>KWIK SIl</td><td>WPI</td><td>03L</td><td></td></tr><tr><td>18 핀 소켓</td><td>Conrad Electronic</td><td>189634-62</td><td></td></tr><tr><td>핫 멜팅 글루</td><td>Conrad Electronic</td><td>827673</td><td></td></tr><tr><td>납땜 바늘</td><td>Conrad Electronics</td><td>830283</td><td>12 V</td></tr><tr><td>납땜 단자 러그&nbsp;</td><td>Conrad Electronic</td><td>531901</td><td></td></tr><tr><td>Glaselectrodes</td><td>WPI</td><td>1B100F-3</td><td></td></tr><tr><td>Minutien 핀</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>V2A 0.2 x 12 mm</td></tr><tr><td>전환 가능한 헤드 스테이지</td><td>Tucer Davis Technologies</td><td>SH16</td><td></td></tr><tr><td>헤드 스테이지 연결 모듈</td><td>NPI</td><td>INT-03M</td><td></td></tr><tr><td>증폭기 모듈</td><td>NPI</td><td>PDA-2F</td><td></td></tr><tr><td>데이터 수집 보드</td><td>National Instruments</td><td>NI-6123, Ni-6143</td><td></td></tr><tr><td>수집 소프트웨어</td><td>National Instruments</td><td>Lab View 8.2</td><td>맞춤 설계</td></tr><tr><td>스파이크 정렬&nbsp;</td><td>양도하다&nbsp;</td><td>Spike 2 v7.11</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>R2008B</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Leitz</td><td></td><td>수동</td></tr><tr><td>AG-와이어</td><td>WPI</td><td>AGT05100</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Leica</td><td>TCS SP2 AOBS</td><td></td></tr><tr><td>AMIRA</td><td>Mercury Computer Systems&nbsp;</td><td>2000</td><td></td>년 2월 5</tr></tbody></table>일

행동을 한 꿀벌 두 신경 처리 단계에서 동시 장기 녹음

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

포유 동물과 곤충 모두에서 신경 세포의 정보는 다른 더 낮은 순서 뇌 센터에서 처리됩니다. 이 센터는 수렴 및 피드 포워드와 피드백 배선을 포함하여 분기 해부학 적 연결을 통해 연결되어있다. 또한, 같은 기원의 정보는 부분적으로 다른 때로는 같은 뇌 영역에 평행 경로를 통해 전송됩니다. 이러한 배선 전략과 서로에 대한, 특히 자신의 시간 종속성의 진화 혜택뿐만 아니라 전산 장점을 이해하기 위해서는 높은 시간 해상도에서 같은 준비에 다른 책자 또는 neuropiles의 단일 신경 세포에 대한 동시 접근이 필요하다. 여기에서 우리는 두 개의 연속 neuropiles 1, 더듬이 로브 (AL), 제 후각 처리 단계와 버섯 몸 (MB), 고차 통합 센터 invo에 멀티 유닛 활동을 기록하기 위해 고유의 세포 장기 접근을 보여줌으로써 꿀벌에 집중학습 및 기억 형성 또는 MB와 AL 연결이 병렬의 연결이 책자에 lved. 후자의 예로서 선택하고, 완전하게 설명 될 것이다. 지원 비디오에서 건설 및 유연한 멀티 채널 와이어 전극의 영구 삽입을 보여줍니다. 마이크로 와이어 전극 채널의 인접 쌍 차동 증폭 비약적 노이즈를 감소시키고 신호의 소스가 밀접 전극 팁의 위치와 관련되어 있음을 확인한다. 사용 와이어 전극의 기계적 유연성을 허용 안정적인 침략 장기 녹음 많은 시간 동안 기존에있는 여분의 세포 내 생체에 기록하는 기술에 비해 분명한 장점 일까지.

&quot;이 의정서는 개별 꿀벌 내에서 두 개의 서로 다른 처리 단계에서 동시 녹음을 할 수 있으며 또한 예를 통해 학습과 기억의 기본 메커니즘을 테스트 할 수 있습니다., 구속 꿀벌 내 에어컨 PER.&quot; 이것은 신경 처리의 시간적 측면을 분석하기위한 필수 조건이다. 다른 과학적인 접근 방식은 꿀벌의 후각 시스템의 신경 네트워크를 해명하는 방법은 쉽게 적응할 수있다. 예를 들어이 방법은 꿀벌의 이중 후각 경로, L과 M-ALT PN을 (그림 5)에서 PN에의 시간 처리를 분석하기 위해 (i)를 사용합니다. 그림 (a)에 동시에 M-ALT의 PN로 기록 된 L-ALT PN의 한 예는 열 시험 평균으로 제공되며 색상 코드 열 플롯과 같은 다섯 가지의 악취 농도에 대한 자신의 반응 강도와 대기 시간을 보여줍니다된다. 11리터-13 엄마와 함께 일곱 벌의 평균LT 개의 PN (도 5B, 5C)는 응답의 강도뿐만 아니라, 응답 지연이 모두, 어느 정도, 악취 물질 농도를 반영하는 것을 나타낸다. 증가하는 악취 물질 농도가 자신의 응답 대기 시간 (그림 5B, 5C)를 거부하면서 이에이 예에서 PN에 자신의 반응 강도를 증가시킨다. 이 결과는 다소 제한 및 분석 악취 물질에 대해서만 유효하지만, 여전히 AL (37)의 최근 계산 모델과 일치한다. 꿀벌의 AL의 악취 농도 코딩은 비선형 계산의 기초가 다른 코딩 특성이 여전히 미래에 분석 할 필요가 기초 여부. 또한 방법 (II)이 후속 처리 단계, 및 AL-MB - 출력 (도 6)에서 인구 활동에 시간적 측면과 비교하는데 사용될 수있다. 주성분 분석 (PCA)는 악취 연산이 장기화와 PN 수준에서 전체 악취 프레젠테이션보다 더 오래되었는지 나타낸다 반면 EN 소재세트 온 오프 만의 냄새가 인구 활동 (그림 6)으로 표현 하였다들. PN 활동 정지 (info 참조 영화 1)을 현상 할 때 이에 EN 인구 시점에서 이미 최대 활성에 도달. <img alt="그림 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig1highres.jpg" width="400" /> ... 그림 1과 3 채널 마이크로 와이어 전극을 제조 A1) 3 개의 와이어의 끝은 위치에 11, 13, 16 A2) 네 납땜 러그는 플렉시 유리, 플라스틱 기판에 나사 결합 IC 핀 커넥터에 납땜; minutien 핀이어서 플라스틱 판. A3) 플라스틱 판은 IC 핀 커넥터와 각각의 와이어의 자유 단부의 상부에 접착되어 부착되어 유리 모세관의 끝 부분에 삽입은 베스트 납땜 중 하나에 납땜 러그. &lt;미세 구리 철사를 가진 전극 홀더의 장착을 위해 강한&gt; B1), 모세관 홀더의베이스는 다음 장치를 정렬 주문품에 고정) 한 번 더. B2를 수행해야합니다. . 세 구리 마이크로 와이어 B3) 병렬 마이크로 와이어가 치과 왁스로 접착하고 모세 혈관이 장소 (긴 화살표)에 다시 넣어 각 끝 부분에있는 홈을 따라 정렬 및 접착 테이프로 고정; 접착 마이크로 와이어는 다음 구리 와이어의 세 느슨한 끝이 따라서 전기적 접촉을 데리고 3 대 납땜 러그에 납땜 치과 왁스의 끝이 (짧은 화살표)가 차단됩니다. B4)와 모세관에 연결되어 IC 핀 커넥터. C1) 개의 완전히 조립 된 전극은, 이러한 목적을위한 단일 headstage. C2)와 함께 사용 하나의 전극 (왼쪽, 슬레이브)의 핀이 오른쪽 (다른 쪽의 전극에 절연 전선을 통해 연결되어 서로 연결될 수있다 마스트) ER, 이는 헤드 스테이지에 접속되고; headstage 연결된 전극은 근육 (M17)과 기준 전극 (참조)에서 입력을 수집 할 수 있습니다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig2highres.jpg" width="500" /> 그림 2. 준비 및 꿀벌의 뇌에 영구적 인 전극 삽입.) 꿀벌은 얼음에 고정 후 플렉시 글라스 홀더에 삽입됩니다. 편모 (FL) 및 Scapus (SC)와 안테나는 머리는) B. 표시되며, 안테나는 치과 왁스를 사용하여 고정되어 있습니다. C) 헤드 캡슐 면도 및 꿀벌) 설탕 물. D가 공급되는 헤드 캡슐이 열립니다. E) 뇌의 상부로부터 분비 및 기관지를 제거한 후, 다른 neuropiles 주요 마크 쉽게 구별 될 수있다. ALTS의 궤적은 서로와 함께 표시됩니다전극이 삽입 된 마크. (MB : 버섯 몸, AL : 더듬이 로브, OL : 광 엽, α : 알파 엽 또는 수직 로브, ALT : 더듬이 로브 기관, E1 : M-ALT의 레코딩을위한 전극 삽입 측, E2 : L-ALT에 대한 전극 삽입 측 녹음). F) 참조 (참조)와 근육 전극 (M17)는 후 표피 또는 복안. G) 와이어 전극이 해당 사이트. H의 뇌에 삽입)에있는 작은 구멍을 통해 머리 캡슐에 삽입 두 개의 구성 요소 실리콘을 사용하는 장소에 전극을 고정, 꿀벌은 여전히 PER을 보여주고 가동 할 수있다 (예를 들면., 설탕 물을 사용). <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" width="500" /> 두 신경 책자 및 하나의 단위 추출 (스파이크 정렬).에서 그림 3. 세포 외 기록 </str사연&gt; 실험 장치의) 도식 그림. 꿀벌은 플렉시 유리 홀더에 집착한다. 냄새 자극 유리관을 통해 제공된다. 두 개의 전극 정강이가 노출 된 벌의 뇌에서 기록된다. B) 농도의 수용액에 꿀 500 밀리 냄새 자극에 모두 책자에 흥분 반응을 나타내는 L과 M-ALT PN을 (녹색과 보라색 흔적)에서 동시 녹음 1:100에서 33 ° C 각 플롯 라인은 A. 바에서 전극의 납땜 러그의 색상 코드 레이블과 차별화 된 채널을 나타냅니다 : 하나의 활동 전위가 정렬과 색상 코딩 된 50 μV C) 스파이크 정렬 절차 후.. 정렬 단위의 오버레이 파형의 분리를 보여줍니다. D) 스파이크 간격 히스토그램은 적절한 스파이크 정렬의 증거로 정렬 단위의 분리의 품질을 나타냅니다. 기기의 내화물 기간 내에 스파이크가없는합니다. E) 두 가지보기 (E1, E2)에서서로 정렬 된 단위의 거리를 나타내는 주성분 분석으로 정렬 된 단위의 3 차원 클러스터링. 원형 공간에서 SD를 닮아) 색상으로 구분 단위가 하나의 기관 녹화에서 세 채널의 확대에 보이는 활동 전위를 묘사 주성분 공간 F에서 클러스터의 중요한 차별화를 나타내는 2.5 배 마할 라 노비스 거리를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" target="_blank">여기를 클릭하세요 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.</a> <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" width="500" /> 도 4. 포스트 레코딩 시각화 및 기록 위치의 3D 재구성. 전후면의 최대 강도의 정렬 된 Z-축을 따라 오르토 - 조각) 프로젝션보기그리고 MB와 LH에 AL에서 돌출 uniglomerular 투사 뉴런의 역행 메우기. 세포 내 트레이서 Microruby (tetramethylrhodamin 덱스 트란)을 기록 실험 후에 AL에 삽입 하였다. 알렉사와 두 전극의 염색에서 최대 강도의 정렬 된 Z-축을 따라 오르 조각의 AL 증거 적절한 PN 염색. B) 프로젝션 내부보기 스테인드 사구체는 M-ALT (E1, 화살표의 전극 위치를 나타내는 488 하이 드라 지드 ) 및 L-ALT (E2, 화살표). 트레이서 알렉사 하이 드라 지드 488은 전극 주변 조직에 마이그레이션 및 전극 삽입 부위 얼룩. AL에서 눈에 띄는 얼룩이 함께 꿀벌의 후각 시스템 (의 개략적 인 개요와 표면 가공품 스테인드 표적 세포 (PN)로 중. C) 3D 재건 및 A, B (오른쪽에서 전극 삽입 부위)이며, 주 왼쪽 L과 M-ALT 궤적의 표시로 측). 만 uniglomer, 주신경근 PN 책자가 표시됩니다. : 더듬이 신경, AL : 더듬이 로브, LH : 측면 경적, MB : 버섯 몸, E1, E2 : 전극 삽입 사이트, M-ALT : 중간 더듬이 로브 기관, L-ALT : 측면 더듬이 로브 기관, C : 꼬리, R : 주동이, M : 중간, L :. 측면 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig5highres.jpg" width="300" /> 악취 농도 코딩의 그림 5. 예 이중 후각 통로에서.) 열 그래프는 하나의 L-ALT (녹색의 반응을 설명) 및 단일 M-ALT PN은 (보라색) 악취 물질에 대한 응답으로 개별 꿀벌에서 동시에 취득 (: 10-6 1 내지 1:100) 악취 농도 증가시 헥산. 각 행 10 시험 STIM의 평균입니다ulation. 발사 속도는 7 기록 꿀벌 11 L-13 M-ALT PN의의. B) 인구 응답 대기 시간을 뺀 자발적인 활동과 관련하여 발사 속도입니다 상대 강도의 변화로 표시됩니다. 각 꿀벌의 두 책자의 PN을 동시에 기록했다. 인구 응답 지연은 모두 책자에서 PN의 악취 농도가 증가함에 따라 감소하는 대기 시간을 나타낸다. 99 밀리 초에서 안테나의 냄새 응답 발병은 electroantennograms를 통해 기록하고 PN 응답 대기 시간에서 차감됩니다. 응답 지연 시간 측정을 위해 너무 약하고, 따라서 반응 강도가 증가하고 증가하는 악취 농도 B.와 동일한의 PN 속도를 발사. C) 인구 응답이 제외 된 가장 낮은 농도에서 그합니다. L-ALT는 강한 반응 강도를 보여줍니다. B에서 C 평균과 SD가 제공됩니다. <img alt="그림 6" fo:contenT 폭 = &quot;5 인치&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/51750/51750fig6highres.jpg&quot;폭 = &quot;500&quot;/&gt; 그림 6. 꿀벌의 후각 통로를 따라 두 개의 후속 처리 단계에서 인구의 활동을 비교. 데이터는 1 - 헥산 올, 2 - 옥타.)로 자극 된 20 마리의 동물에 기록 된 각 행은 거짓 색으로 구분 한 투사의 평균 발사 속도를 나타냅니다 신경 세포 (PN)은 1 - 헥산 올 10 냄​​새 반복을 통해 계산. 냄새 프리젠 테이션 시간이 0에서 시작 3 초. B를 지속)에서와 동일하게 표시)하지만 버섯 몸 외부의 뉴런 (EN)에 대한. 에 나타낸 매트릭스) -1 - 헥산 올과 악취 자극 동안 PN 인구 벡터로 볼 수있다. 우리는 2 - 옥타 논으로 악취 자극 중에 인구 벡터의 동일한 종류를 계산하여 시간적 차원. C 유지 주성분 분석에서 두 벡터 (PCA)를 사용) 처음 세 개의 주요 구성 요소 (PC1, 2, 3)이었다더듬이 로브 출력에서​​ PN 앙상블 활동 악취 분리를 설명하기 위해 서로에 대하여 플롯. 냄새의 발병하기 전에 시간은 검은 색으로 표시됩니다. 1 - 헥산 올과 자극의 3 초 동안에는 활동은 파란색으로 표시됩니다. 2-옥탄 올과 자극 동안 활동이 빨간색으로 표시됩니다. 또한, 우리는 1 - 헥산 올 (밝은 파란색)과 (핑크) 2 octanonen 세트의 냄새 후 활동의 1.5 초 (포스트)를 보여줍니다. PN 앙상블 수준에서 매우 독특한 궤적을 불러 일으키는 두 냄새가 &quot;고정 점&quot;보다 오래 지속 전체 냄새 자극의 기간에 정착합니다. 냄새 오프셋 후에 만 궤적은 냄새 자극없이 기본 활동으로 이동합니다. D) 같은 분석은 버섯 몸의 출력에서의 활동을 나타내는 EN 앙상블 수준에서 이루어졌다. PN 활동에 비해 냄새가 덜 별개의 궤도를 보여주고 있습니다. 또한 &quot;고정 점&quot;는 관찰되지 않습니다. 처음에 냄새를 유발 궤적 INTE냄새가 여전히 존재하지만, 기본 활동과 rmingle. 오프셋 만 냄새는 추가 궤도를 유발. <a href="/files/ftp_upload/51750/Movie_R3_Brill_et_al._JoVE.avi" target="_blank">. 영화 1</a> 시간 PN-인구 벡터 (왼쪽)와 EN 인구 벡터의 주성분 분석 후 냄새 유도 궤도의 평가를 해결했습니다. (. 권리를, CP 그림 6) 상부는 처음 세 개의 주요 구성 요소 (PC1을 포함 2, 3)은 서로에 대해 도시. 하부 패널은 한동안 PC1, 2 및 3의 평가를 나타낸다. 냄새의 자극은 회색 막대로 표시됩니다. 모든 패널은 동기화되었다. EN 인구 활동이 PN 인구 활동하기 전에 약간 시작합니다, contraintuitive 것 같다하지만 현상은 연결 및 이전 버전의 경우 1 설명하는 참여 층의 속성에 의해 설명 될 수있다.

두 개의 서로 다른 뇌 neuropiles 또는 두 개의 서로 다른 해부학 책자에서 동시 세포 장기 기록은 꿀벌에 설립되었다. 이 기록은 다른 뇌 영역 하나의 신경 세포에서뿐만 아니라 행동 동물의 앙상블 수준에서 신경 세포의 처리 시간 측면의 조사를 할 수 있습니다.

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 행동하는 꿀벌 내의 두 가지 독립적인 신경 처리 단계에 장기간 접근함으로써 후각 코딩과 기억 형성을 연구하는 것입니다. 이를 위해 우선 절연 구리 미세 와이어와 맞춤 제작된 홀더를 사용하여 저비용 다채널 전극을 조립합니다. 다음 단계로는 꿀벌의 머리 캡슐 일부를 제거하여 살아있는 꿀벌을 준비하고, 형광 염료로 처리된 두 개의 전극을 노출된 뇌에 삽입합니다.세 번째 단계는 꽃 향기와 페로몬으로 자극을 주는 동안 후각 경로에 있는 두 개의 독립적인 신경 핌플(neuro pills) 또는 신경삭(tracts)에서 기록하는 것입니다. 이후 뇌를 해부한 뒤, 표적 뉴런을 역추적하여 채우기 위해 다른 형광 추적자를 촉각엽(antenna lobe)에 주입합니다. 그런 다음 역추적된 경로와 전극 추적선을 시각화하여 뉴런 구조의 3차원 재구성물을 제작합니다.궁극적으로, 이러한 기술을 사용하면 촉각엽(antenna lobe)과 버섯체(mushroom body)와 같이 서로 다른 처리 단계에 있는 두 뉴런 집단 사이의 후각 코딩 관계를 더 잘 이해할 수 있습니다. 따라서 기존 방법 대비 이 기술의 주요 장점은 다채널 전극의 크기가 매우 작아 결합하여 사용할 수 있다는 것이며, 이는 전극을 고정한 후 뇌의 서로 다른 영역에서 동시에 기록할 수 있음을 의미합니다. 유연한 와이어 덕분에 행동하는 동물에서 수 시간 동안 안정적인 기록이 가능합니다.이 방법은 동물이 환경으로부터 후각 정보를 어떻게 수신하고 인지하며, 최종적으로 계산하는지를 이해하는 것과 같이 신경병리학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 이중 기록 기술은 후각 코딩의 기저 메커니즘과 전반적인 신경망에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 무척추동물이나 신경생물학의 다른 모델 생물체에도 적용될 수 있습니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자들은 벌집버섯체(mushroom body)의 내엽(internal lobe)이나 수직엽(vertical lobe)과 같은 형태학적 지표만으로 꿀벌의 뉴런을 식별하는 데 많은 훈련이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 본 프로토콜을 위해 표준 전극 인터페이스 보드에 맞는 전극 어댑터를 제작하십시오. 먼저 절연 전선 짧은 조각 3개를 18핀 커넥터에 납땜합니다.그 후 플렉시글라스 판을 절단하고 가장 긴 쪽을 따라 얕은 홈을 파냅니다. 다음으로, 플렉시글라스 판에 솔더링 러그를 나사로 고정하고 판을 커넥터 상단에 접착하여 붙입니다. 그런 다음 세 개의 짧은 전선을 사용하여 베이스를 러그에 연결합니다.다음으로 유리 모세관을 플렉시글라스 플레이트의 홈에 배치합니다. 모세관은 슬라이드 방식으로 움직일 수 있어야 하며 나사로 고정되어야 합니다. 미세 핀을 사용하여 유리 모세관을 바깥쪽으로 약 5mm 정도 확장합니다. 이 모세관과 핀은 전극 마이크로와이어를 지지하고 안정화하는 데 사용됩니다.다음으로, 세 개의 마이크로와이어를 배치합니다. 더 원활한 접근을 위해 접착 테이프를 사용하여, 12V 솔더링 니들 글루를 이용해 유리 모세관을 제거할 수 있습니다. LMP 치과용 왁스를 사용하여 와이어를 고정하되, 와이어의 마지막 3분의 1 지점까지는 접착하지 않습니다.이제 이 다채널 마이크로 와이어 어셈블리를 전극 어댑터에 연결하십시오. 연장된 유리 모세관을 마이크로 와이어와 평행하게 배치합니다. 겹쳐진 유리 모세관과 미뉴션 핀(minutian pin)을 따라 치과용 왁스로 이 부착 부위를 고정하십시오.그런 다음 전극 와이어를 미뉴티안 핀(minutian pin)에서 2~3cm, 전극 끝단에서 2~3cm 정도 남기고 절단합니다. 다음으로 모세관을 전극 어댑터에 고정하고 나사를 사용하여 전체적으로 안정되게 고정합니다. 온도는 360 °C로 설정합니다.전선의 끝부분을 러그에 수직으로 납땜하십시오. 그런 다음 1kHz에서 임피던스가 약 300kΩ인지 확인하여 전기적 접촉이 충분히 강한지 확인하십시오. 이제 두 번째 전극 어댑터의 채널을 마스터 전극에 연결하고, 기준 전극과 근전도 전극을 마스터 전극 베이스에 납땜하십시오.마지막으로, 마스터 전극을 헤드 스테이지의 인터페이스 보드에 장착합니다. 꿀벌을 확보한 후 얼음 위에서 냉각시켜 움직이지 않을 때까지 고정시킨 다음, 두 번째 전극을 별도의 어댑터에 고정합니다. 그다음, 머리가 노출되도록 꿀벌을 표준 플렉시글라스 홀더에 고정합니다.가열된 치과용 왁스를 눈의 기부와 머리와 가슴의 연결 부위에 도포하여 머리를 고정합니다. 왁스를 계속 사용하여 머리 캡슐에 있는 촉각의 scape eye를 고정합니다. 앞방향을 향해야 하는 flagellum에는 왁스를 도포하지 않도록 주의하십시오.Pro Bois에 충돌이나 걸림이 없어야 합니다. 움직임이 원활한지 확인하십시오. 이제 접근성을 높이기 위해 머리 캡슐(head capsule) 부위를 면도하십시오.그 다음 벌이 섭취할 수 있을 만큼의 30%sucrose를 충분히 먹입니다. 이는 적절한 준비 상태, 생존율 및 조직 수분도를 보장하기 위함입니다. 이제 마이크로 메스를 사용하여 눈 가장자리를 따라 수직으로, 그리고 안테나 기부 위쪽을 따라 수평으로 절개합니다.O-cell eye 아래쪽을 계속해서 절개하고 느슨한 큐티클을 제거합니다. 전두하선(hypopharyngeal glands)과 기관(trachea)은 옆으로 밀어두어야 합니다. 이렇게 하면 전극을 삽입할 수 있는 경로가 확보됩니다.35 micron 은선인 기준 전극을 삽입하는 것으로 시작합니다. 먼저, 동측 겹눈에 작은 절개창을 냅니다. 그런 다음 그 틈으로 전극을 밀어 넣습니다.다음으로, 외측 O cell eye 아래의 근육 투사 영역에 두 번째 전극을 삽입합니다. 나중에 전극의 위치를 시각화하기 위해, 전극을 0.5 molar potassium chloride와 5%Alexa Hydrocyte 4 88 용액에 3분 동안 담급니다. 그 후, 마이크로 조절기를 사용하여 두 전극을 뇌 속에 배치합니다.버섯체(mushroom body)의 안테나엽(antenna lobe)과 수직엽(vertical lobe)을 확인하여 방향을 잡습니다. 여기서 한 전극은 외측 안테나엽 경로(lateral antenna lobe tract) 180 µm 깊이에, 다른 전극은 내측 안테나엽 경로(medial antenna lobe tract) 약 300 µm 깊이에 삽입합니다.두 가지 구성 요소를 사용하여 전극을 고정함으로써 전극 배치를 완료합니다. 실리콘으로 뇌 상단의 전체 공간을 덮어 조직이 건조해지는 것을 방지합니다. 그런 다음 기록을 진행하여 세포외 기록 신호로부터 유닛 활성(unit activity)을 추출합니다.사용 가능한 스파이크 소팅(spike sorting) 소프트웨어를 사용하십시오. 분리된 전극 채널을 이용하십시오. 세 개의 전극 채널 모두에 템플릿 매칭 기술을 동시에 적용하여, 단일 스파이크 이벤트를 설명하는 다양한 파형 조합을 검출하십시오.마지막으로, 적절한 단위 분리가 이루어졌는지 확인합니다. 기록된 3개의 차등 전극 채널에서 단일 스파이크 이벤트에 대해 주성분 분석(principle component analysis)을 수행합니다. 기록을 마친 후, 벌에서 실리콘과 전극을 조심스럽게 제거하십시오.다음으로, 뇌를 벌 링거 용액(bee ringer solution)으로 헹구고 신경절과 기관을 제거합니다. 그런 다음 마이크로 피펫을 사용하여 안테나 엽(antenna lobe)에 1 M potassium acetate에 용해된 5% micro ruby를 주입합니다. 이를 통해 엽의 경로에 순방향 표지를 제공하게 됩니다.이후 모든 단계는 최대한 어두운 환경에서 수행하십시오. 뇌를 Bee Ringer 용액으로 다시 세 번 헹구고, 염색약이 30~45분 동안 반응하도록 둡니다. 벌을 냉장고에서 냉각시켜 움직이지 않게 고정하십시오.그런 다음 뇌를 분리합니다. 4°C에서 완만하게 교반하며 0.1 M PBS에 희석된 4% Para aldehyde로 뇌를 하룻밤 동안 고정합니다. 이후 표준 탈수 및 투명화 프로토콜을 수행합니다. 안테나 엽의 투사 뉴런에 micro ruby tracer를 역충전한 후, Z축을 따라 정교하게 절단된 ortho slice들로부터 이 뉴런들의 투사 뷰를 조립하였습니다.두 전극의 Alexa Hydrocyte 4 88 염색은 각각 내측 촉각엽 경로(medial antenna lobe tract)와 외측 촉각엽 경로(lateral antenna lobe tract)에 삽입되었음을 보여줍니다. 염색된 표적 세포와 전극 삽입 위치의 3D 재구성 모델을 사용하여 두 촉각엽 경로 궤적에 대한 모식도를 작성하였습니다. 벌에게 서로 다른 농도의 냄새 자극을 주는 동안 두 촉각엽 경로에서 동시에 기록을 수행하여 시간적 처리 과정을 조사하였습니다. 이후의 처리 단계에서 활동성을 평가하였습니다.안테나 로브 투사 뉴런(antenna lobe projection neurons)과 외재성 뉴런(extrinsic neurons)의 집단 벡터에 대한 주성분 분석 결과, 투사 뉴런에서의 냄새 반응은 연장되어 자극이 끝난 후에도 지속됨을 보여줍니다. 이와 대조적으로 외재성 뉴런 집단에서는 odor on 및 odor off 유형만이 나타났습니다. 따라서 시간에 따른 활성도를 살펴보면, 오른쪽의 외재성 뉴런 집단은 투사 뉴런 집단이 냄새 유발 활성을 발달시키기 직전에 냄새 분리 활성을 나타냅니다.냄새 자극은 회색으로 표시되어 있습니다. 숙련된 경우 전극 제작에 약 30분이 소요됩니다. 적절하게 수행한다면 벌을 준비하고 대상 영역에 전극을 삽입하는 과정은 추가로 30분 정도 내에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도할 때, 모든 단계는 숙달될 때까지 많은 연습과 인내심이 필요하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 특히 전극 와이어를 연결 지점에 고정하고 원하는 뇌 영역에서 기록할 때 각별히 주의하십시오. 이를 위해서는 꿀벌 뇌의 발달 후 해부학적 구조에 대한 확고한 지식이 필요합니다.이 기술을 통해 신경병리학 및 곤충 후각 분야의 연구자들은 행동하는 꿀벌의 서로 다른 신경 경로와 뇌 중심부 활동 사이의 정확한 시간적 관계를 탐구할 수 있게 되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 행동하는 꿀벌의 두 뇌 영역에서 동시에 기록하기 위한 다채널 마이크로와이어 전극의 제작 및 사용 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 또한, 기록 전극의 정확한 위치를 시각화하는 방법도 익힐 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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코 확장 응답 곤충의 행동 소성을 조사하기위한 프로토콜 : 기본, 바이오 메디컬에 응용 프로그램, 및 농업 연구

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자유롭게 학습의 세 단계에 걸쳐 비둘기를 이동에서 단일 신경 세포 &#39;활동 전위를 기록

이 비디오는 호박벌의 선택 행동을 모니터링하기 위한 RFID(Radio-Frequency Identification) 및 동작 감지 비디오 녹화 방법에 대해 설명합니다.

무선 주파수 식별하고 효율적으로 모션에 민감한 비디오 땅벌에 의해 무보수 선택 행동의 기록을 자동화

이 원고는 자유 비행 꿀벌에 대한 간단한 비 침습적 방법뿐만 아니라 억제 꿀벌의 정확한 지역화 된 처리 수 있도록 더 많은 침략 변종을 포함, 꿀벌에 약리 에이전트를 관리하기위한 여러 프로토콜을 설명합니다.

절제된 자유 비행 꿀 꿀벌의 Neuropharmacological 조작,<em&gt; API를 mellifera이</em

여기에 제시된 프로토콜은 동시 뇌파 검사(EEG) 및 행동 평가에 대한 정보를 실시간으로 제공합니다. 우리는 이 프로토콜과 관련된 모든 단계를 신경과학의 많은 분야, 특히 학습 및 기억 분야의 연구자들에게 매력적인 솔루션으로 논의했습니다.

해마 신경 발생을 연구하기 위한 도구로서의 무선 전기생리학 및 기억 행동 테스트의 동시 모니터링

학습하세요 꿀벌의 후각 처리 및 기억 형성을 위한 두 뇌 영역 동시 장기 전기생리학 기록 기법. 다채널 전극을 활용하여 행동 중인 개체의 신경 활동을 안정적으로 측정하는 방법을 익히세요.

행동을 한 꿀벌 두 신경 처리 단계에서 동시 장기 녹음

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