행동을 한 꿀벌 두 신경 처리 단계에서 동시 장기 녹음

이 절차의 전반적인 목표는 행동하는 꿀벌 내에서 두 개의 독립적인 신경 처리 단계에 대한 장기적인 접근을 사용하여 후각 코팅과 기억 형성을 연구하는 것입니다. 이것은 먼저 절연 구리 마이크로 와이어와 맞춤형 홀더에서 저렴한 다중 채널 전극을 조립하여 수행됩니다. 다음 단계는 살아 있는 꿀벌의 머리 캡슐 부분을 제거하고 노출된 뇌에 형광 염료로 처리된 두 개의 전극을 삽입하여 꿀벌을 준비하는 것입니다.

세 번째 단계는 후각 경로에 있는 두 개의 독립적인 신경 알약 또는 요로를 기록하면서 꽃 냄새와 페로몬으로 자극하는 것입니다. 나중에, 뇌를 해부한 후, 다른 형광 추적자를 안테나 엽에 주입하여 표적 뉴런을 다시 채웁니다. 그런 다음 되메워진 트랙과 전극 추적을 시각화하여 뉴런 구조의 3차원 재구성을 생성합니다.

궁극적으로, 안테나 엽과 버섯 몸체와 같은 서로 다른 처리 수준에서 두 뉴런 집단 사이의 냄새 코팅의 관계는 이러한 기술을 사용하여 더 잘 이해할 수 있습니다. 따라서 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 다중 채널 전극이 매우 작고 조합하여 사용할 수 있다는 것인데, 이는 고정 후 뇌의 다른 영역에서 동시에 기록할 수 있다는 것을 의미합니다. 유연한 와이어를 통해 행동하는 동물을 몇 시간 동안 안정적으로 불러올 수 있습니다.

이 방법은 동물이 환경에서 생명체의 olf factory를 어떻게 받아들이고, 인식하고, 최종적으로 계산하는지 이해하는 것과 같은 신경 병리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 이중 기록 기술은 일반적으로 냄새 코딩 및 신경 네트워크의 기본 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그것은 또한 무척추 동물 또는 애정 및 신경 생물학에 있는 다른 모형 유기체에 적용될 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 버섯 몸체의 내부 엽 또는 수직 엽과 같은 형태학적 랜드마크만 사용하여 꿀벌 뉴런을 식별하기 위해 많은 훈련이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 프로토콜의 경우 표준 전극 인터페이스 보드에 맞는 전극 어댑터를 구축합니다. 먼저 세 개의 짧은 절연 전선 조각을 18핀 커넥터에 납땜합니다.

그런 다음 플렉시 유리 판 조각을 자르고 가장 긴 면을 따라 얕은 홈을 삽입합니다. 그런 다음 납땜 러그를 플렉시 유리 플레이트에 나사로 고정하고 플레이트를 커넥터 상단에 붙입니다. 그런 다음 세 개의 짧은 와이어를 사용하여 베이스를 러그에 연결합니다.

다음으로 유리 모세관을 플렉시 유리 플레이트의 홈에 배치합니다. 모세관은 미끄러질 수 있어야 하며 나사로 고정할 수 있어야 합니다.작은 핀을 사용하여 유리 모세관을 바깥쪽으로 약 5mm 연장합니다. 모세관과 핀은 전극 마이크로와이어를 지지하고 안정화하는 데 사용됩니다.

다음으로 3개의 마이크로와이어를 배치합니다. 더 나은 접근을 위한 접착 테이프의 도움으로 12볼트 납땜 바늘 접착제를 사용하여 유리 모세관을 제거할 수 있습니다. LMP 치과용 왁스와 함께 와이어는 와이어의 마지막 1/3을 접착하지 않습니다.

이제 이 다중 채널 마이크로 와이어 어셈블리를 전극 어댑터에 연결합니다. 확장된 유리 모세관을 마이크로 와이어와 평행하게 배치합니다. 겹치는 유리 모세관과 minutian 핀을 따라 치과 왁스로 이 부착물을 고정합니다.

그런 다음 전극 와이어를 다듬어 minutian 핀에서 2-3 센티미터, 전극 끝에서 2-3 센티미터를 남겨 둡니다. 그런 다음 모세관을 전극 어댑터에 고정하고 나사를 사용하여 모든 것을 제자리에 고정합니다. 섭씨 360도에서.

와이어의 끝을 러그에 수직으로 납땜합니다. 그런 다음 임피던스가 1킬로헤르츠에서 약 300킬로옴인지 확인하여 충분히 강한 전기 접촉이 있는지 확인합니다. 이제 두 번째 전극 어댑터의 채널을 마스터 전극에 연결하고 기준 전극과 근육 전극을 마스터 전극 베이스에 납땜합니다.

마지막으로 마스터 전극을 헤드 스테이지의 인터페이스 보드에 장착합니다. 꿀벌을 얻은 후 두 번째 전극을 별도의 어댑터에 고정하고 고정될 때까지 얼음 위에서 하나를 식힙니다. 다음으로, 머리가 노출된 상태로 표준 플렉시 글라스 홀더에 꿀벌을 고정합니다.

가열된 치과용 왁스를 눈 기저부와 머리와 흉부 사이의 접합부에 바르고 머리를 고정합니다. 왁스를 계속 사용하여 헤드 캡슐에 있는 더듬이의 눈동자를 고정시킵니다. 앞을 향해야 하는 fagel에 왁스를 바르지 마십시오.

Pro Bois는 충돌이 없어야 합니다. 움직일 수 있는지 확인하십시오. 이제 접근성을 높이기 위해 헤드 캡슐을 면도하십시오.

그런 다음 꿀벌에게 소비할 30%의 자당을 모두 먹입니다. 이것은 좋은 준비, 생존력 및 조직 수분을 보장합니다. 이제 마이크로 메스를 사용하여 눈 테두리를 따라 수직으로 자르고 안테나 베이스 위에서 수평으로 자릅니다.

O 세포 눈 아래를 계속 자르고 느슨한 큐티클을 제거합니다. 하인두선은 기관과 마찬가지로 옆으로 옮겨야 합니다. 이렇게 하면 전극 삽입 경로가 지워집니다.

기준 전극인 35미크론 은선을 삽입하는 것으로 시작합니다. 먼저 동측 겹눈을 작게 자릅니다. 그런 다음 전극을 밀어 넣습니다.

다음으로, 두 번째 와이어를 외측 O 세포 눈 아래의 근육 투영 영역에 삽입합니다. 나중에 전극 위치를 시각화하려면 전극을 0.5몰 염화칼륨과 5%Alexa Hydrocyte 4 88 용액에 3분 동안 담그십시오. 다음으로, 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 두 전극을 뇌에 배치합니다.

버섯 몸체의 안테나 엽(antenna lobe)과 수직 엽(vertical lobe)을 식별하여 방향을 잡습니다. 여기서 하나의 전극은 180미크론 깊이의 측면 안테나 로브 관에 있고 다른 전극은 내측 안테나 로브 관에 있습니다. 약 300미크론 깊이를 삽입했습니다.

두 가지 구성 요소를 사용하여 전극을 고정하여 전극 배치를 완료합니다. 실리콘은 뇌 위의 전체 공간을 덮고 있어 조직이 건조해지는 것을 방지합니다. 그런 다음 녹음을 진행하여 녹음된 세포 외 신호에서 단위 활동을 추출합니다.

사용 가능한 스파이크 분류 소프트웨어를 사용하십시오. 차별화된 전극 채널을 사용합니다. 3개의 전극 채널 모두에 템플릿 매칭 기술을 동시에 적용하여 단일 스파이크 이벤트를 설명하는 다양한 파형 조합을 검출할 수 있습니다.

마지막으로 적절한 단위 분리를 위한 제어입니다. 기록된 3개의 차별화된 전극 채널의 단일 스파이크 이벤트에 대한 주요 구성 요소 분석을 사용합니다. 녹음을 한 후 꿀벌에서 실리콘과 전극을 조심스럽게 제거하십시오.

다음으로 꿀벌 링거 용액으로 뇌를 헹구고 땀샘과 기관을 제거합니다. 그런 다음 마이크로 피펫을 사용하여 안테나 엽에 5 % 마이크로 루비를 1 몰 초산 칼륨에 용해시킵니다. 이것은 엽의 트랙에 선행성 레이블을 제공합니다.

여기서부터 최대한의 어둠 속에서 모든 단계를 수행하십시오. 꿀벌 링거로 뇌를 다시 세 번 헹구고 염료가 30-45분 동안 배양되도록 합니다. 냉장고에서 식혀서 꿀벌을 움직이지 못하게 하십시오.

그런 다음 뇌를 분리하십시오. 0.1 어금니 PBS의 4 % 파라 알데히드로 뇌를 섭씨 4도에서 밤새 부드러운 교반으로 고정하십시오. 탈수 및 세척을 위한 표준 프로토콜을 따르십시오.마이크로 루비 추적자로 안테나 엽의 투영 뉴런을 다시 채운 후, 이러한 뉴런의 투영 보기는 Z축을 따라 직교 슬라이스에서 조립되었습니다.

두 전극의 Alexa Hydrocyte 4 88 염료는 견인된 내측 안테나 엽과 측면 안테나 엽관에 삽입된 것을 보여줍니다. 염색된 표적 세포와 전극 삽입 부위를 3D로 재구성하여 두 개의 안테나 엽 견인 궤적의 개략도를 만들고, 서로 다른 냄새 농도로 꿀벌을 자극하면서 두 개의 안테나 엽 트랙에서 동시에 기록하는 것을 사용하여 시간 처리를 조사했습니다. 활동은 후속 처리 단계에서 평가되었습니다.

모집단 벡터의 안테나 엽 투영 뉴런과 외적 뉴런 원리 성분 분석은 투영 뉴런의 냄새가 자극보다 길고 오래 지속되었음을 보여줍니다. 대조적으로, 외적 뉴런 집단에서는 냄새가 켜진 유형과 냄새가 꺼진 유형만 표시되었습니다. 따라서 시간에 따른 활동을 관찰할 때, 오른쪽의 외적 뉴런 집단은 투영 뉴런 집단이 냄새 유발 활동을 발달시키기 시작하기 약간 전에 냄새 분리 활동을 보여줍니다.

냄새 자극은 회색으로 표시됩니다. 마스터하면 전극을 만드는 데 약 30분이 걸립니다. 꿀벌을 준비하고 전극을 대상 영역에 삽입하는 것은 적절하게 수행되면 30 분 안에 완료 할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 모든 단계에는 마스터할 때까지 많은 연습과 인내가 필요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 전극선을 연결 지점으로 치솟게 하고 원하는 뇌 도달 범위에서 녹음할 때 특히 주의하십시오. 개발 후 꿀벌 뇌 해부학에 대한 확실한 지식이 필요합니다.

이 기술을 통해 신경 병리학 및 곤충 후각 분야의 연구자들은 행동하는 꿀벌에서 다양한 신경 경로와 뇌 중추의 활동 사이의 정확한 시간적 관계를 탐구할 수 있었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 다채널 마이크로와이어 전극을 구성하고 사용하여 두 개의 뇌 영역과 행동하는 꿀벌을 동시에 기록하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또한 기록 전극의 정확한 위치를 시각화할 수 있어야 합니다.