격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

이 절차의 전반적인 목표는 흉선 상피 세포 또는 기술을 분리, 식별 및 정제하는 것입니다. 이것은 먼저 효소를 통해 흉선을 소화하고 기계적으로 파괴하여 기술을 단일 세포 현탁액으로 해리함으로써 달성됩니다. 다음으로, 이 기술은 유세포 분석법으로 분석하거나 패닝 전략을 통해 강화할 수 있습니다.

궁극적으로, 흉선 상피 부분 집합은 형광 활성화 세포 분류에 의해 정제될 수 있습니다. 이 방법은 흉선 상피 세포가 어떻게 흉선 선택을 촉진하는지와 같은 T 세포 발달 분야의 많은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 노화 동물의 흉선 기능 장애의 원인은 무엇이며 체외에서 T 세포 재구성을 달성하려면 어떻게

이 기술의 주요 장점은 다양한 emmic 생식 세포의 높은 회수율, emmic 상피 세포의 편향되지 않은 농축 및 세포 분류를 통해 궁극적으로 달성할 수 있는 높은 순도입니다. 흉선 기질 세포를 분리하려면 먼저 갈비뼈 바로 아래에 있고 심장 위에 있는 두 개의 얇은 흰색 엽처럼 보이는 흉선을 식별해야 합니다. 그런 다음 흉선을 둘러싼 결합 조직을 분리하고 구부러진 톱니 모양의 집게를 사용하여 흉선엽을 부드럽게 당기고 제거합니다.

엽을 5ml의 배지가 들어 있는 6개의 웰 플레이트에 넣고 주변 지방과 결합 조직을 다듬습니다. 그런 다음 잘라낸 엽을 5밀리리터의 갓 준비한 효소 용액이 들어 있는 새 우물로 옮기고 가는 가위를 사용하여 조직을 작게 절개합니다. 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다.

20분 후 5ml 피펫으로 조직을 위아래로 여러 번 부드럽게 피펫팅하여 슬러리를 단일 세포 현탁액으로 해리합니다. 효소를 중화하기 위해 얼음 위에 10ml의 차가운 알부민이 풍부한 완충액이 들어 있는 50ml 튜브에 상등액 분획을 수집합니다. 그런 다음 나머지 조직에 2.5ml의 효소 용액을 추가합니다.

플레이트를 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 18 유전자 바늘이 장착된 3ml 주사기로 조직을 부드럽게 교반하여 응집체를 분해합니다. 그런 다음 수집 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 나머지 조직에 2.5ml의 효소 용액을 추가합니다. 플레이트를 15분 동안 배양합니다. 세 번째 배양 후 20 5G 바늘로 기계적 교반을 반복합니다.

마지막 5-10분 동안 조직을 배양한 후, 유세포 분석으로 회수된 기술을 식별하기 위해 원심분리를 위해 상등액을 수집 튜브로 옮깁니다.표준 항체 염색 절차에 따라 다중 매개변수 유세포 분석기에서 샘플을 실행하고 적절한 팩스 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하여 패닝 방법으로 기술을 더욱 강화합니다. 먼저, 농축에 적합한 항체로 세포를 배양합니다. 다음으로, 사전 코딩된 패닝 플레이트에 세포 현탁액을 추가한 다음 플레이트를 소용돌이치고 실온에서 배양합니다.

30분 후, 플레이트를 세게 휘젓고 상등액을 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 접시를 신선한 중간 크기로 두 번 헹구고 수집 튜브에 세척물을 모읍니다. 그런 다음 세포를 회전시킨 후 펠릿을 5ml의 신선, 배지에 재현탁하고 세포 현탁액을 새로운 패닝 플레이트로 옮기고 소용돌이치고 배양한 후 세포를 수집하여 방금 시연된 것처럼 농축 기술을 흉선 세포 하위 집합으로 더욱 정제합니다.

적절한 항체로 라벨링한 후 형광 활성화 세포 분류를 통해 100마이크로미터 노즐을 통해 기술을 분류하고 배지에서 부피당 30% 부피의 FBS로 세포를 수집합니다. 유세포 분석으로 기술을 식별하기 위한 이 대표적인 게이팅 전략에서는 기술에 의한 CD 45가 아닌 epca의 발현을 관찰할 수 있습니다. 따라서, 기술은 ep, camm 및 CD 45 발현에 따라 게이트화될 수 있으며, 기술은 피질 또는 CEC와 수질 또는 mtech 흉선 상피 부분 집합으로 구성됩니다.

이러한 subset은 ctec에 의해 발현된 G 글루타밀 아미노 펩티다아제와 ctech와 Mtech가 표면에서 MHC Class 2를 발현하는 mtech에 결합하는 lectin UEA one을 인식하는 live 51 항체에 의해 구별될 수 있습니다. mtech는 mtech low와 mtech high 집단으로 더 분류할 수 있지만, MHC 2 발현 수준에 따라 콜라겐 분해 효소 및 디스크 공간을 가진 프로토콜에 비해 방금 시연된 liase 효소 기반 프로토콜을 사용하여 약 8배 더 많은 기술을 회수할 수 있으며, 10에서 5까지의 약 9배의 콜라겐 분해 효소 공간을 가진 프로토콜에 비해 분류 시간을 단축하고 생존력을 높이기 위해 단 하나의 마우스 흉선에서 회수할 수 있습니다. 기질 세포가 회복되었습니다. 패닝은 방금 시연된 바와 같이 준비된 전체 흉선 세포와 비교하여 흉선 세포 부위를 고갈시키는 데 사용할 수 있습니다.

기술의 비율은 0.5% 미만에서 15% 이상으로 증가합니다. 패닝 후에는 기술 하위 집합의 비율이 변경되지 않으며, 이는 패닝 중에 두 하위 집합 모두 선택적으로 손실되지 않음을 시사합니다. preen 농축 샘플과 비교하여 기술의 회수율은 약 85%입니다.이 비디오를 본 후에는 당황하여 더 많은 themic 생식 세포를 농축하는 방법과 유세포 분석으로 더 많은 themic 상피 가라앉는 방법을 잘 이해해야 합니다.