Name: 수질 흉선 상피 세포의 증식, 분화 및 무차별 유전자 발현을 지원하는 3D의 Organotypic 공동 문화 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 배우세요 수질 흉선 상피 세포(mTEC)의 3D 오가노타이픽 공동 배양법을. 섬유질 스캐폴드와 피브리노겔을 활용하여 증식, 분화 및 무차별 유전자 발현을 효과적으로 유지하는 이 방법은 면역학 연구에 필수적입니다.

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이 연구는 독일 암 연구 센터(DKFZ), EU 컨소시엄 "Tolerage", Deutsche Forschungsgemeinschaft(SFB 938) 및 Landesstiftung Baden-Württemberg의 지원을 받았습니다.

본 연구는 Regierungspräsidium 카를 스루에의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 동물은 독일 암 연구 센터 (DKFZ)에서 무균 조건 하에서 보관 하였다. 생후 1~7일 이르는 모든 배양 실험 마우스 새끼 사용 하였다. 흉선에서 mTECs 1. 분리 참고 : 다음과 같은 몇 가지 수정을 무균 상태에서 이전에 한 바와 같이 다음과 같은 소화 단계를 수행 하였다. <ol><li> 마우스 새끼 목을 벨과 흉선을 제거합니다. RPMI 1640 배지를 (5 % FCS를 포함)를 포함하는 페트리 접시에 얼음에 thymi를 놓습니다. </li><li> ~ 5-30 ml의 RPMI 매체와 둥근 바닥 튜브에 좋은, 작은 조각과 장소에 thymi을 절감하고 실온에서 10 분 동안 자석을 사용하여 저어 부드럽게. </li><li> 그 후, 주로 흉선 세포를 포함 뜨는을 가만히 따르다 및 collagena의 한 라운드에 남아있는 조직을 순차적으로 소화37 ℃에서 25 분마다 콜라게나 제 / 디스 파제 (0.2 ㎎ / ㎖ 및 1.2 U / mL의 최종 농도)이어서 37 ° C에서 각각 (0.2 ㎎ / ㎖ 최종 concentartion 57 U / ㎖) 15 분 동안 SE 타입 IV, thymi까지 자기 교반 수욕 C 완전히 분해된다. 세 thymi 두 당 1 ml의 효소를 사용합니다. </li><li> 조직에게 파스퇴르 피펫마다 7-10 분 선동. 콜라게나 / 디스 파제의 분수를 수영장과 70 μm의 거즈를 통해 필터링합니다. </li><li> 자기 세포 분류 (MACS)에 의해 mTECs을 풍부. 앞서 설명한도 11,도 1에 도시 된 바와 같이 자기 정렬 셀 mTECs의 정제를 수행한다. 참고 : 안티 CD80-PE (16-10A1, 1에서 사용 : 100 희석)와 (1에서 G8.8, 사용 : 100 희석) 안티는 EpCAM 바이오 12 mTECs의 자기 정렬을 위해 우리는 다음과 같은 항체를 사용 하였다. 맥을 사용 미숙과 성숙 mTECs은 다음과 같이 정의했다 : CD45 -는 EpCAM + CD80 - 그리고 CD45을 - CD80 + respectiv을엘리. </li><li> 아래 (2.3 절) 한 바와 같이 맥 정화 (미성숙 mTECs의 순도 = 83.1 ± 6.3 %와 성숙한 mTECs = 79.23 ± 3.42 %) 이후의 Organotypic 문화에 mTECs 씨앗. </li><li> 또한, CD45 맥 고갈 후 (100 μm의 노즐을 사용하여) FACS 정렬 mTECs 다음 항체를 사용하여 : 안티 CD45-를 PerCP을 (30-F11, 1에서 사용 : 100 희석), 안티 Ly51-FITC (6C3 1에 사용 : 100 희석), 안티는 EpCAM-Alexa647 (G8.8, 1에서 사용 : 500 희석) 1에서 항 CD80-PE (16-10A1, 사용 : 100 희석). (4 일) : 요오드화 프로피 듐 (5,000 일)를 사용하여 죽은 세포를 제외합니다. 각각는 EpCAM + CD80 + - CD45 - - Ly51 -는 EpCAM + CD80 - 및 PI - CD45 - Ly51 PI : FACS를 이용하여 미성숙과 성숙 mTECs과 같이 정의 하였다. </li></ol> 2. 3D의 Organotypic 공동 문화 (OTCs) 참고 : keratinocyt의의 Organotypic 재배 3D-피부 구조앞서 설명한 바와 같이 ES 9, 13을 제조 하였다. 모든 단계에서, 세포는 CO 2, 37 ° C에서 배양 5 %였다. 다음 mTECs를 사용 OTCs은 약간의 수정을 제조 하였다. <ol><li> 인간 섬유 아세포의 준비 참고 : 이전에 9 바와 같이 인간의 피부 섬유 아세포 드 epidermised 진피 이식편 문화에서 얻었다. <ol><li> 간단히 말해서, 인간의 피부 (~ 5cm 길이)의 스트립을 잘라 써모 4 ° C에서 O / N (10 mM의 헤 페스의 pH 7.4와 생리 식염수 0.5 ㎎ / ㎖)로 처리. </li><li> 그 후, 핀셋을 이용하여 진피로부터 상피를 분리한다. </li><li> 미세 10cm 페트리 접시에 작은 조각, 장소에 진피를 잘라 살균 공기 흐름에 따라 1 ~ 2 시간 동안 건조 할 수 있습니다. DMEM 20 % FBS를 포함하는 정기적으로 외식을 보충합니다. </li><li> 밖으로 성장하는 섬유 아세포를 분할 할 때 합류 외식 더 콘의 판에 부착 계속 확인하고 0.1 % 트립신을 사용 (일반적으로 약 3 주)가지의 secutive 라운드. </li><li> 최대 DMEM의 3 배에 10 % FBS에 대해 동일한 외식에서 섬유 아세포를 확장하고 그들에게 14 냉동은-유지. 각각의 실험 시리즈 섬유 아 세포의 동일한 배치를 사용합니다. 참고 : 섬유 아세포는 피부 등가물의 셋업에 대한 조사되지 않았다. </li></ol></li><li> 비계의 준비 <ol><li> 정확히 12 잘 필터 삽입에 맞게 날카로운 11mm 직경의 금속 주먹을 사용하여 잘 경계가 원에 0.4-0.6 mm 두께의 비스코스, 부직포 섬유 재료 (엑셀 시트를 지원하는 제품 내용을) 잘라. 그런 다음 발판으로 12도 필터 인서트 (폴리 에스테르 모세관 기공 막, 3 μm의 기공 크기)에 배치합니다. 멸균 12 웰 플레이트에 전체 필터 설정을 놓습니다. </li><li> 피브리노겐과 트롬빈의 조합으로 구성된 수술 피브린 글루 키트를 사용하여 피브린 겔을 준비한다. fibrinogen-뿐만 아니라 8 ㎎ / ㎖ 및 10 키트의 트롬빈 성분 사전 희석각각 단위 / ㎖,. 다음과 같이 12 웰 플레이트의 단일 잘 들어갑니다. <ol><li> 칼슘 및 마그네슘 2 + 2 +, pH가 7.0없이 100 μL 피브리노겐 100 μL, 인산 완충 식염수 (PBS)와 (8 ㎎ / ㎖)을 희석. 27 섬유 아 세포를 포함하는 100 μL의 FCS 100 μL 트롬빈 (10 단위 / ml)에 희석. </li><li> 2 ㎎ / ㎖ 및 2.5 단위 / ㎖의 트롬빈의 피브리노겐의 최종 농도를 초래한다 : (1 혼합물 1) 200 μL 피브리노겐을 추가 아세포는 지지체 상에 세포 믹스 함유 트롬빈 200 μL에 디스펜스. 잘 혼합 부드러운 피펫 팅 (1 일)에 의해 발판의 전체 영역에 걸쳐 균등하게 배포 할 수 있습니다. 참고 : 37 ° C에서 30 분 후, 섬유 아세포를 둘러싸는 완전히 응고 지지체의 내부 공간을 채우고 매끄러운 상면을 형성 형성한다. </li></ol></li></ol></li><li> mTECs와 공동 문화 <ol><li> 사전 문화에서 기관 배양을 덮어서 가리다매체 변화에 10 % FBS, 50 μg의 / ml의 L- 아스코르브 산 1 NG / ml의 TGF-β1과 DMEM 4-5일 대한 매일. </li><li> mTEC 시딩 당일 rFAD 배지로 배지를 대체 (1 : 1 DMEM + DMEM / F12), 10 % FBS와 10 -10 M 콜레라 독소, 0.4 ㎎ / ㎖의 하이드로 코르티손,를 50㎍ / ㎖ L - 아스코르브 산, RANK 리간드 따라서 섬유 아세포에서 분비되는 세린 프로테아제에 의해 조숙 섬유소 용해를 방지 (는 0.1㎍ / ml) 및 500 단위 / ml의 아프로 티닌. </li><li> 7 ~ 8 시간 후, 25 mTECs 시드에 의해 공동 문화를-설정 (전체 mTECs를, 또는 CD80 LO와 CD80 안녕 부분 집합), 섬유 아세포의 발판 위에 잘 당 100 μL의 볼륨. 노이 바 우어 실 (주 4)를 사용하여 세포를 카운트. 참고 : 흉선 3D의 Organotypic 문화가 공기 해제되어 피부 OTCs 달리 미디어에 잠겨 모든 시간에. </li><li> 24 시간 배양 한 후, 지금 containi (단계 2.3.2) 위에서 언급 한 바와 같이 매체와 문화 (총 매체 교환) 공급NG는 아프로 티닌의 양, 250 단위 / ㎖ (5 일)을 감소시켰다. </li><li> mTECs의 증식 활동을 평가하기 위해, 문화의 종료 전에 4 시간 동안 OTCs에 (즉, 6.7 μM / ㎖, / 웰 10 μm의) EDU를 추가합니다. 각 문화 시편의 또는 흐름에 의해 두 개의 섹션에 하나 카운트 K14 + EDU + 세포에 의해, mTECs의 증식 지수를 결정 각질 (14)의 공동 염색과 결합 된 에듀 이미징 키트에 설명 된대로 장외 냉동 섹션의 염색을 수행 세포 계측법 (EDU 유동 세포 계측법, 제 1.7 대신 Ly51-FITC의는 1 CDR1-PB 15을 사용 : 100 희석 및 2.3.6.4). </li><li> 공동 문화의 4-7일 다음, RNA 분리, 극저온 절편 또는 FACS 분석 (8 ~ 11 일)에 대한 OTCs 및 프로세스를 종료합니다. <ol><li> , 집게를 사용 웰 인서트의 필터에서, 골격 / 진피 동등한 분리 배양을 종료한다. </li><li> 극저온 절편의 경우, 10월 화합물에 전체 OTC를 포함하고 리에서 동결극저온 절편 전에 파운드 질소 증기. 사용할 때까지 -20 ℃에서 저온 유지 및 저장소를 사용하여 5-7 μm의 두께 장외 섹션을 준비합니다. 항체 : (100 희석 1 GP53, 사용), 및 안티 멘틴 : 극저온 구분 OTCs의 면역 조직 화학 안티 - 케라틴 14 (1,000 희석 AF64, 사용 1에서)를 사용합니다. 각각의 이차 항체를 사용하여 간접 면역 조직 화학 염색을 수행합니다. </li><li> RNA 분리를 들어, 용액 2 ㎖의의 RNase 무료 튜브의 나사 캡 (페놀 및 구 아니 디늄 티오 시아 네이트를 포함하는)를 열 변성 1 ml에 추가 할 수 있습니다. 메스와 조각으로 전체 장외을 잘라 변성 솔루션을 포함하는 튜브에 추가 할 수 있습니다. 기계적으로 6.0의 속도로 30 초 동안 두 번 FastPrep 악기와 OTCs 분쇄기, 2 분 (샘플이이 시점 이후 -80 ° C에서 저장 될 수 있습니다) 얼음에 사이에 배치합니다. -80 ° C에서 냉동하면 얼음 위에서 해동. 4 ℃에서 10 분 동안 11,500-13,000 rpm으로 튜브를 원심 분리기. 신선한 튜브에 뜨는을 전송 RT와 F에서 5 분 동안 품어제조자에 의해 설명 된 바와 같이 산성 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 - 페놀 - 클로로포름 추출을 이용 ollow RNA 분리 프로토콜. </li><li> FACS 분석의 경우, 지지체를 제거하고, 피브린 / 섬유 아세포 / mTEC 겔로부터 막 분리. 미세 메스 겔을 잘라 ~ 대한 FACS 튜브에 20 분을 소화 또는 완전히 자기 교반 수조에서 37 ° C에서 콜라게나 제 / 디스 파제 2 ㎖로 분해 할 때까지. 일단 파스퇴르 피펫 5 분마다와 효소 용액을 교반한다. 완전 분해 후, 70 ㎛의 필터를 통해 세포 현탁액을 필터; 1.7에 설명하고 유동 세포 계측법으로 분석하여 항체를 사용하여 단일 세포 현탁액을 염색. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 관심의 재정적 또는 상업적 갈등을 선언하지 않습니다.

RTOCs 외에도, 3D OTCs는 TEC 차별화와 PGE 유지 보수 / 유도 다른 (I)에 비해 (표 1) &#39;단순화 된 3D 문화&#39;는 사용의 측면에서 훨씬 우수하여왔다 - 섬유 아세포를 혼자 발판없이; (II) 2D 시스템을 사용하여 -, (ⅲ) 3T3-J2 세포 TEC 클론 개발에있어서, 열팽창 계수의 차이 (10)와 공동 배양 된 섬유 아세포 / 피더 세포,하지만 PGE가 손실 (IV) 마트 리겔 또는 (V) ECM 구성 요소 (게시되지 않은 데이터). PGE는 3D OTCs 최대 7 일간 유지하고, 그 후 최적의 시간이 포인트 인 사일은, PGE는 감소하기 시작합니다. 다른 형태 TEC 기능은 최대 14 일 동안 유지되었다. 흥미롭게 OTCs는 때때로 형성 Hassall 같은 구조 (10)에 의해 볼 mTEC 분화 말기 지원. 그들이 성인 thymi에 비해 문화에서 살아 남기 위해 더 ...

나머지 2 %는 공동으로 흉선 기질을 구성하는 다양한 세포로 구성되어있는 동안 개발 흉선 세포는 흉선의 약 98 %를 차지 (즉, 상피 세포, 수지상 세포, 대 식세포, B 세포, 섬유 아세포, 내피 세포). 외부 대뇌 피질 상피 세포 (cTECs)는 다 능성 사전 T 세포 및 자기 MHC의 긍정적 인 선택의 골수, T 세포 계보 유도에서 프로 T 세포의 이민을 조달 미성숙 흉선 세포를 제한했다. 내부 수질 흉선 상피 세포 (mTECs)을 유도 부정적인 선택 또는 T 조절 세포 계보에 자신의 편차 중 하나에 의해 자기 펩타이드 / MHC 복합체에 대한 높은 선호도 TCR과 그 흉선 세포의 내성 유도에 참여하고 있습니다. 중앙 관용 유도의 맥락에서, mTECs은 따라서 주변 자체 미러링 조직 제한자가 항원 (TRAS)의 다양한 스펙트럼을 표현하는 점에서 독특합니다. 이 현상은 무차별 유전자 발현이라고 (PGE)1,2. 다양한 단기 2D 문화 시스템은 변함없이 처음 이일 3-6 내에서 MHC 클래스 II, FoxN1과 에르 같은 PGE의 손실과 키 조절 분자의 결과로이 매혹적인 세포 유형에 현재 대부분의 연구는 생체 분리 된 세포에 의존 . 그것은 특정 구성 요소와 흉선의 그대로 3 차원 그물 세공의 기능은 2D 모델에서 누락 된, 그러나 불분명 남아 있었다. 재 응집 흉선 기관 배양 (RTOC)는 그대로 흉선 미세 7에서 원경 한편 만 3D 한편, T 세포 발달의 연구를 허용 시스템, 및 간질 세포 생물학,이었다. 그러나 RTOCs들은 이미 태아 간질 세포의 입력을 필요로 5-10 일 최대 배양 기간을 견딜 세포 복합체를 포함하는, 즉, 특정 제한을 갖는다. 체외 배양 시스템의 환원의 부족의 연구를 방해하고있다T 세포 개발 및 흉선 기관 형성의 여러 측면하지 적어도 분자 PGE의 규제와 mTECs의 발달 생물학의 관계. 피부와 흉선의 상피 세포의 구조 조직의 확대 연관성으로 인해, 우리는 체외에서 각질 세포의 분화를 에뮬레이트함으로써 피부 동등한를 만들 원래 개발되었던 3D의 Organotypic 문화 (OTC) 시스템을 선택했다. OTC 시스템은 각질 세포가 8,9를 접종하는에 섬유소 젤에 갇혀있다 진피 섬유 아세포와 겹쳐 불활성 지지체 매트릭스로 구성되어 있습니다. 여기, 우리는 정제 mTECs와 각질 세포를 대체했다. 이 모델의 기본 기능을 유지하면서, 우리는 특정 매개 변수를 최적화. mTECs가 증식 채택 장외 모델에 따라서 밀접하게 생체 mTECs 개발 모방, 단말 차별화를 시행하고 mTEC ID 및 PGE을 유지 <sup&gt; 10. 이 기술 노트는 흉선 OTCs의 단계적 설정을 허용하는 상세한 프로토콜을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>임산부 C57BL/6 마우스&nbsp;</td><td>찰스 리버 WIGA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS 칼럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MS 칼럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Microbeads, 마우스</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PE Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM (G8.8 -Alexa 647 and -biotin)</td><td>Ref. 12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD80-PE 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>553769</td><td></td></tr><tr><td>CD45-PerCP 항체</td><td>BD Pharmingen 557235</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ly51-FITC 항체</td><td>BD Pharmingen</td><td>553160</td><td></td></tr><tr><td>CDR1-Pacific Blue</td><td>Ref. 15</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratin 14 항체</td><td>Covance</td><td>PRB-155P</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin 항체</td><td>Progen</td><td>GP58</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-conjugated AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp;</td><td>106-546-003</td><td></td></tr><tr><td>염소 anti-Rabbit IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Molecular Probes (Invitrogen GmbH)</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 594 이미징 키트</td><td>Invitrogen</td><td>C10339</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 유세포 분석 분석 키트</td><td>Invitrogen</td><td>C10425</td><td></td></tr><tr><td>12-well filter inserts (thincerts)</td><td>Greiner bio-one</td><td></td><td></td>657631</tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>Greiner</td><td>665180-01</td><td></td></tr><tr><td>Jettex 2005/45</td><td>ORSA, Giorla Minore, 이탈리아</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen TISSUECOL-Kit 면역</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thrombin TISSUECOL-Kit 면역</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Serva</td><td>47302.03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-049&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A11-151</td><td></td></tr><tr><td>아프로티닌 (트라실롤)</td> <td>바이엘</td><td>4032037</td><td></td></tr><tr><td>콜레라 독소</td><td>Biomol</td><td>G117</td><td></td></tr><tr><td>하이드로 코르티손</td><td>세롬 (Biochrom)</td> <td>K3520</td><td></td></tr><tr><td>L- 아스코르브 산</td><td>시그마</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&szlig; 1</td><td>Invitrogen</td><td>PHG9214</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>R & D 시스템</td><td>462-TR-010</td><td></td></tr><tr><td>Thermolysin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp; T-7902</td><td></td></tr><tr><td>OCT 컴파운드</td><td>TissueTek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>트리졸 (일명. 변성 용액 - 산성 guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>FastPrep FP120</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IV&nbsp;</td><td>CellSystems</td>는 <td>0.2 mg/ml 및 57U/ml 최종 농도</td><td>를 LS004189</td></tr>.<tr><td>중성 프로테아제(Dispase)</td><td>CellSystems</td><td>LS002104</td><td>0.2 mg/ml 및 1.2U/ml 최종 농도입니다.</td></tr><tr><td>DNase 나는&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11 284 932 001</td><td>25 &마이크로; g/ml 최종 conc.</td></tr></tbody></table>

수질 흉선 상피 세포의 증식, 분화 및 무차별 유전자 발현을 지원하는 3d의 organotypic 공동 문화 모델

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

인트라 흉선 T 세포의 발달은 각종 간질 세포, 즉, 비 - T 세포로 구성된 복잡한 삼차원 메쉬 작업을 필요로한다. 순차적으로 즉, T 세포 수용체 레퍼토리 생성 및 선택에 따라 T 세포 계보 헌신 전에 주변에 자신의 수출에 필수 체크 포인트를 통과하면서 흉선 세포는 매우 조정 공간적 위해이 발판을 통과. 이 골격을 형성하는 두 가지 주요 상주 세포 유형은 (cTECs) 피질과 수질 흉선 상피 세포 (mTECs에게)입니다. mTECs의 주요 기능은 수많은 조직 제한 항원의 소위 무차별 표현이다. 이 조직 제한 항원은 각각 자기 허용 오차의 결과로, mTECs 또는 흉선 수지상 세포에 의해 직접 또는 간접적으로 흉선 세포를 미숙하기 위해 제공됩니다. cTECs과 mTECs의 발달 경로와 기능을 모방 시험관에 적합한 모델은 현재 락입니다왕. 적절한 실험 모델의 부족은 예를 들면 아직 저조한 세포 및 분자 수준의 이해 난잡한 유전자 발현의 분석을 방해했다. 우리는 생체 고립 mTECs 문화 차원의 Organotypic 공동 문화 모델을 적용. 이 모델은 원래 생체 외 피부 동등 물을 생성하는 방식으로 케 라티노 사이트를 배양하기 위해 고안되었다. , CD80 안녕, 에르 양성 mTECs, RANKL에 (II) 응답 및 FoxN1의 (III) 지속 식으로 (I)의 증식과 CD80 보라, 에르 음성 단자 차별화 : 3D 모델은 mTEC 생물학의 주요 기능 기능을 보존 에르와 CD80 안녕 mTECs에서 조직 제한 유전자.

우리는 원래 각화 세포 9 시험관 장기 배양을 위해 개발되었던 3D의 Organotypic 공동 배양 모델 (3D OTC)를 채택 하였다. 맥 풍부한 mTECs은 (맥 농축 방식의 그림 1 참조) 섬유소 젤 포획 된 섬유 아세포의 포함 발판에 접종 하였다. 섬유 아세포는 시험 관내에서 mTECs지지 필수적인 세포 외 기질 (ECM)을 제공한다. MTECs 공기에 노출 된 자신의 생체 내 환경 (장외 셋업 방식 그림 2 참조) 흉내 있습니다 각질 세포와는 달리 침수 문화에서 RANKL의 존재 4-14일에 대한 OTCs에서 재배되었다. 여기에 분석 두 mTEC 부분 집합 (즉, CD80 및 CD80 보라 하이 mTECs)은 최대 14 일 전체 문화 기간 동안 살아 남았다. MTECs은 각질 (14) 식에 의해 식별과 ...

현재의 2D 배양 시스템이 in vivo 시나리오를 모방하지 않기 때문에 in vitro에서 수질 흉선 상피 세포를 연구하는 것은 대체로 성공적이지 못했습니다. 본 명세서에 기술된 3D 배양 시스템(변형된 피부 유기형 배양 모델)은 mTEC 증식, 분화 및 난잡한 유전자 발현의 유지를 재현하는 데 탁월한 것으로 입증되었습니다.

수질 흉선 상피 세포의 증식, 분화 및 무차별 유전자 발현을 지원하는 3D의 Organotypic 공동 문화 모델

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

이 절차의 전반적인 목표는 흉선 수질 상피 세포(thymic, medullary, epithelial cells) 또는 mtech를 3차원 장기 유사 배양(organotypic culture) 또는 OTC 시스템에서 배양하는 것입니다. 이는 먼저 섬유성 지지체 물질을 12-well 필터 인서트에 배치한 후, 인간 피부 섬유아세포가 포함된 갓 조제된 피브린 겔을 층으로 쌓아 수행합니다. 4~5일간의 사전 배양 후, MTS를 지지체 위에 안착시키고 침전 배양 조건에서 배양합니다.최종적으로, 면역조직화학 염색, RNA 분리 및 분석을 공동 배양물에 수행하여 CED Mtech의 발달 상태를 평가할 수 있습니다. 기존의 2D 배양 시스템과 비교했을 때 3D 기관 유사 공동 배양 시스템의 주요 장점은 Mtech의 분화, 증식 및 다면적 유전자 발현의 유지를 재현하는 능력이 훨씬 뛰어나다는 점입니다. 오늘은 저희 협력 연구소의 기술자인 Iris Martin이 이 기술을 시연하겠습니다.인간 피부 섬유아세포가 합류(confluency)에 도달하면, 0.4에서 0.6 mm 두께의 비스코스 부직포 섬유 조각을 끓이고 건조시킨 후 다림질하여 스캐폴드 섬유를 준비합니다. 금속 펀치를 사용하여 이를 11 mm 원형으로 절단합니다. 절단된 섬유 재료를 두 개의 슬라이드 사이에 놓고, 슬라이드를 호일로 감싼 뒤 오토클레이브로 멸균합니다.멸균이 완료되면 멸균된 12웰 플레이트의 웰에 인서트를 넣고, 각 인서트에 스캐폴드를 넣습니다. 다음으로, 스캐폴드당 100 µL의 신선하게 희석된 thrombin에 100 µL의 fetal calf serum에 현탁된 2.7 × 10⁵개의 fibroblasts를 섞습니다. 이 thrombin-fibroblast 혼합물을 각 스캐폴드 위에 분주한 후, 신선하게 희석된 fibrinogen 200 µL를 이어서 분주합니다.그 다음, 부드럽게 피펫팅하여 각 웰 내의 세포 혼합물을 섞어 용액이 전체 스캐폴드에 고르게 분포되도록 합니다. 이미지는 배양 1일 차와 4일 차의 피브린 겔과 함께 성장하는 인간 진피 섬유아세포의 모습을 보여줍니다. 이때 응고물의 형성 시간과 상태를 추적하기 위해 스캐폴드가 없는 대조군 웰에 테스트 겔을 함께 준비하십시오.피펫 팁을 사용하거나 플레이트를 뒤집어 섬유아세포의 응고 여부를 확인하십시오. 섬유아세포가 응고되면 소르빈산(sorbic acid)과 TGF beta one이 보충된 배지에 장기 배양물을 4~5일 동안 담가 둡니다. MTE 파종 당일에는 조기 피브린 용해를 방지하기 위해 이 배지를 500 units/mL의 aprotinin이 포함된 RFAD 배지로 교체하십시오. 7~8시간 후, 100 µL의 RFAD에 현탁된 2.5 × 10⁵개의 MTE를 각 스캐폴드 상단에 파종하고, 공동 배양물을 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 배지를 250 units/mL의 aprotinin이 포함된 신선한 배지로 교체하여 4~7일 더 배양하십시오.배양 종료 시 면역조직화학 염색을 통해 m Texs의 발달 정도를 평가하려면, 핀셋을 사용하여 각 웰의 필터로부터 스캐폴드 진피 동등물을 분리하십시오. OTC를 OCT 화합물에 삽입하여 매립하십시오. O-T-C-R-N-A를 분리하기 위해 액체 질소 상단의 기체상에서 OTC를 동결시키십시오.필터에서 지지체 조직을 분리한 후, 메스를 사용하여 OTC를 조각내어 1 mL의 변성 용액이 들어 있는 2 mL RNA-free 튜브로 옮깁니다. FastPrep 장비를 사용하여 OTC를 6.0 속도로 각 30초씩 두 번 기계적으로 분쇄하며, 분쇄 단계 사이에는 얼음 위에서 2분간 휴지기를 둡니다. 그런 다음 제조사의 지침에 따라 acid guanidinium thiocyanate phenyl chloroform 추출법을 사용하여 RNA를 분리합니다.유세포 분석기로 OTC를 분석하려면, 막을 제거하고 스캐폴드를 피브린 섬유아세포 mtech 겔에서 분리합니다. 그런 다음, 방금 시연한 것처럼 메스로 겔을 자릅니다. 이후 조직을 팩스 튜브로 옮깁니다.콜라게나제 현탁액 2 mL를 계속해서 첨가하십시오. 그 다음, 튜브를 37 °C의 항온수조에 넣고 마그네틱 스터러로 20분 동안 교반하십시오. 조직이 완전히 분해될 때까지 5분마다 한 번씩 피펫으로 섞어 주십시오.결과물인 세포 현탁액을 70 µm 스트레이너로 여과하고, 설명된 대로 적절한 항체를 사용하여 세포를 염색합니다. MTS는 keratin 14 발현을 통해 식별할 수 있어 menton 양성 섬유아세포와 쉽게 구분됩니다. 흥미롭게도, 미성숙 및 성숙 M Tex는 배양 시 서로 다르지만 재현성이 매우 높은 성장 패턴을 보입니다.예를 들어, 미성숙 CD 80 D low M Texs는 일반적으로 섬유아세포와 밀접하게 접촉하여 이층 구조를 형성합니다. CD 80 D high MTS가 섬유아세포로 둘러싸인 조밀한 세포 응집체를 형성하는 경향이 있는 반면, mtech 하위 집단은 입증된 3D OTC 조건 하에서 단순히 생존하는 것에 그치지 않고 EDU 통합으로 확인된 바와 같이 증식합니다. 흥미롭게도, CD 80 low MT techs는 rankl이 존재하는 환경에서 더 높은 비율로 증식합니다.CD 80 고발현 MT tech의 경우에는 그 반대가 성립하지만, 이 영상을 시청하고 나면 3D OTC를 사용하여 MT tech를 배양하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 방법은 tech 분화와 PGE 유지 및 유도 측면에서 2D 배양 시스템보다 훨씬 우수하며, 여러 가지 파라미터를 연구하거나 조절할 수 있는 가능성을 제공합니다.

3d-organotypic-co-culture-model-supporting-medullary-thymic

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오에의 준비 2 dGuo - 처리 증명 thymus 문화를 reaggregate.

Thymus 문화 Reaggregate

이 동영상은 절개와 태아 thymus의 제거뿐만 아니라 2 dGuo - 처리 thymus의 전 생체내 문화의 준비를 보여줍니다.

2 dGuo - 치료 Thymus 오르간 문화의 준비

이 동영상은 3차원 흉선 배양 시스템을 사용하여 iPSC 유래 미성숙 T 세포에서 기능적 항원 특이적 T 세포를 생성하는 프로토콜을 보여줍니다. iPSC 유래 미성숙 T 세포를 내인성 림프구가 고갈된 마우스 태아 흉선엽과 함께 배양한 결과, T 세포가 성공적으로 성숙하여 CD8αβ+ MHC 클래스 I+ iPSC 유래 흉선 이민자(iTE)를 형성했습니다.

iPSC 유래 흉선 이민자를 생성하기 위한 3차원 흉선 배양 시스템

이 원고는 3 차원 (3D)의 균일 한 배열 세포 외 기질에 둘러싸여 정의 형상의 상피 조직을 설계 할 수있는 소프트 리소그래피 기반 기술을 설명합니다. 이 방법은 세포 형태 및 실험 문맥 다양한 의무가 있고 동일한 복제의 높은 처리량의 선별을 허용한다.

세포 외 매트릭스 내에서 임베디드 공학 3 차원 상피 조직

우리는 유동 세포 계측법와 함께, T 세포 현상의 양 및 음의 선택을 모델링하는데 사용될 수 있고, 흉선 조각의 제조를 설명한다. 흉선 조각은 또한 흉선 세포 마이그레이션, 현지화의 현장에서 분석하도록하고, 면역 및 두 광자 현미경을 통해 시그널링 할 수있다.

준비 및의 Organotypic 흉선 슬라이스 문화의 응용 프로그램

본 문서에서는 3차원(3D) 흉선 배양 시스템에 의해 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 흉선 이주자(iTE)를 생성하는 새로운 방법을 설명한다. iTE는 증식, 기억 형성 및 종양 억제 능력을 가진 순진한 T 세포와 밀접하게 관련된 T 세포의 균질한 서브세트이다.

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

여기서, 1차 신생아 골린 고환 세포로부터 고환 오르가노이드를 발생시키는 네 가지 방법은 즉, 세포외 매트릭스(ECM) 및 ECM-없는 2D 및 3D 배양 환경으로 기술된다. 이러한 기술은 여러 연구 응용 프로그램을 가지고 있으며 시험관 내고 발달 및 생리학을 연구하는 데 특히 유용합니다.

추가 세포 매트릭스 기반 및 추가 세포 매트릭스 -Murine 고환 오르가노이드의 추가 세포 매트릭스 없는 생성

이 프로토콜은 뮤린 소장 오가노이드를 확립하고, 뮤린 소장 라미나 프로프리아로부터 유형 1 선천성 림프성 세포를 분리하고, 장 상피 세포와 유형 1 선천성 림프 세포 간의 양방향 상호 작용을 연구하기 위해 두 세포 유형 간의 3 차원 (3D) 공동 배양을 수립하기위한 자세한 지침을 제공합니다.

뮤린 소장 상피 오가노이드와 선천적 림프성 세포의 공동 배양

이 프로토콜은 추가 기능 분석을 위해 델타와 같은 4-발현 골수 기질 세포주 공동 배양 시스템(OP9-DL4)에서 레트로바이러스 형질도입 및 공동 배양에 이어 마우스 흉선에서 이중 음성 흉선 세포를 분리하는 것을 설명합니다.

T 세포 백혈병에서 종양 유전자를 연구하기 위해 델타와 같은 4-발현 간질 세포에서 쥐 흉선세포의 공동 배양 및 형질도입

여기에서는 흉선 상피 세포(TEC) 성숙 및 장기간의 유지 관리, 체외 흉선형성을 지원하는 것을 목표로 하는 3D 피브린 하이드로겔에서 성장한 인간 iPSC 유래 흉선 오가노이드 형성을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

3차원 피브린 하이드로겔에서 인간 흉선 오가노이드의 형성

CD8 T 세포의 분화 및 기능을 시험 관 내에서 연구하기 위해, CD8 T 세포를 마우스에서 분리하여 기존에 형성된 감염된 쥐 질 상피 유기체와 장기간 공동 배양할 수 있습니다. 여기서는 이 과정을 설명하고 공동 배양 시 상주 기억 T 세포 표지자의 획득을 평가합니다.

시험관 내 상피 오가노이드-T 세포 공동 배양 시스템을 이용한 상류 기억 CD8 T 세포 분화

배우세요 수질 흉선 상피 세포(mTEC)의 3D 오가노타이픽 공동 배양법을. 섬유질 스캐폴드와 피브리노겔을 활용하여 증식, 분화 및 무차별 유전자 발현을 효과적으로 유지하는 이 방법은 면역학 연구에 필수적입니다.

수질 흉선 상피 세포의 증식, 분화 및 무차별 유전자 발현을 지원하는 3D의 Organotypic 공동 문화 모델

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