수질 흉선 상피 세포의 증식, 분화 및 무차별 유전자 발현을 지원하는 3D의 Organotypic 공동 문화 모델

현재의 2D 배양 시스템이 in vivo 시나리오를 모방하지 않기 때문에 in vitro에서 수질 흉선 상피 세포를 연구하는 것은 대체로 성공적이지 못했습니다. 본 명세서에 기술된 3D 배양 시스템(변형된 피부 유기형 배양 모델)은 mTEC 증식, 분화 및 난잡한 유전자 발현의 유지를 재현하는 데 탁월한 것으로 입증되었습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 3차원 유기형 배양 또는 OTC 시스템에서 흉선, 수질, 상피 세포 또는 mtech를 배양하는 것입니다. 이는 먼저 섬유질 스캐폴드 물질을 12웰 필터 인서트에 배치한 다음 인간 피부 섬유아세포를 포함하는 새로 준비된 피브린 겔을 층화하여 수행됩니다. 4-5일의 사전 배양 후 MTS는 골격에 앉아 수중 배양 조건에서 배양됩니다.

궁극적으로 CED Mtech의 발달을 평가하기 위해 공동 배양에서 면역조직화학, RNA 분리 및 사실을 수행할 수 있습니다. 기존 2D 배양 시스템에 비해 3D Organotypic co-culture 시스템의 주요 장점은 mtech 분화, 증식 및 난잡한 유전자 발현 유지를 재현하는 데 훨씬 우수하다는 것입니다. 오늘 이 기술을 시연할 사람은 협업 연구소의 기술자인 Iris Martin입니다.

인간 진피 섬유아세포가 유창성에 도달하면 0.4-0.6mm 두께의 점성 부직포 섬유질 조각을 끓이고, 말리고, 다림질하여 골격 섬유를 준비합니다. 금속 구멍 펀치를 사용하여 11mm 원으로 자릅니다. 절단된 섬유질 재료를 두 슬라이드 사이에 놓고 슬라이드를 호일로 감싸고 오토클레이브합니다.

멸균이 완료되면 인서트를 멸균 12웰 플레이트의 웰에 넣은 다음 각 골격을 해당 인서트에 넣습니다. 다음으로 100마이크로리터의 태아 송아지 혈청에 있는 5번째 섬유아세포를 2.7배로 10배하여 골격당 100마이크로리터의 갓 희석된 트롬빈으로 혼합합니다. 트롬빈 섬유아세포 혼합물을 각 골격에 분배한 다음 갓 희석된 피브리노겐 200마이크로리터를 주입합니다.

그런 다음 각 웰 내에서 세포 혼합물을 혼합하고 부드러운 피펫팅으로 전체 골격에 용액을 고르게 분배합니다. 이 이미지는 배양 1일차와 4일차에 피브린 겔을 사용한 인간 진피 섬유아세포의 성장을 보여줍니다. 이 시기에도 혈전의 시간과 형성을 추적하기 위해 골격이 없는 대조군 웰에 테스트 젤을 준비합니다.

피펫 팁을 사용하거나 섬유아세포 후 플레이트를 뒤집어 혈전 형성을 평가하고, mtech 파종 당일 4-5일 동안 라 소르브산과 TGF 베타 1을 보충한 배지에 장기 배양을 침지하고, 이 배지를 단백질 밀리리터당 500단위를 함유하는 RFAD 배지로 교체하여 조숙한 섬유소 용해를 방지합니다. 7-8 시간 후, 각 골격의 상단에 100 마이크로 리터의 RFAD에 현탁 된 5 번째 MT E에 2.5 번 2.5 번 파종하고 24 시간 동안 공동 배양을 배양합니다. 다음날, 배지를 프로인 밀리리터당 250단위를 함유한 새로운 배지로 교체하여 4-7일 동안 배양합니다.

배양 종료 시 면역조직화학(immunohistochemistry)에 의한 m Texs의 발달을 평가하려면 한 쌍의 집게를 사용하여 각각의 필터에서 골격 등가물을 분리합니다. OCT 화합물에 OTC를 잘 삽입하고 삽입합니다. OTC를 액체 질소 위에서 기체 상태로 동결하여 O-T-C-R-N-A를 분리합니다.

필터에서 골격 조직을 분리한 후 메스를 사용하여 OTC를 조각으로 자르고 조각을 1ml의 변성 용액이 들어 있는 2mL RNA free 튜브로 옮깁니다. 빠른 준비 도구를 사용하여 OTC를 6.0의 속도로 30초 동안 두 번 기계적으로 파쇄하고 각 파쇄 사이에 얼음 위에서 2분의 휴식 시간을 갖습니다. 그런 다음 제조업체가 설명한 대로 산 guad dium thiocyanate 페닐 클로로포름 추출을 사용하여 RNA를 분리합니다.

유세포 분석으로 OTC를 분석하려면 멤브레인을 제거하고 피브린 섬유아세포 mtech 겔에서 골격을 분리합니다. 그런 다음 마지막으로 방금 시연한 대로 메스로 젤을 자릅니다. 조직을 팩스 튜브로 옮깁니다.

2 밀리리터의 콜라겐 분해 효소 디스 페이스트를 계속합니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 37도의 수조에 넣고 20분 동안 자기 교반을 합니다. 교반: 조직이 완전히 소화될 때 5분에 한 번씩 피펫을 사용하지 마십시오.

생성된 세포 현탁액을 70마이크로미터 스트레이너를 통해 여과하고 그림과 같이 적절한 항체를 사용하여 세포를 염색합니다. MTS는 케라틴 14 발현으로 식별할 수 있어 멘톤 양성 섬유아세포와 쉽게 구별할 수 있습니다. 흥미롭게도, 미성숙한 M Tex와 성숙한 M Texs는 배양에서 다르지만 재현성이 높은 성장 패턴을 보입니다.

예를 들어, 미성숙 CD 80 D low M Texs는 일반적으로 섬유아세포와 밀접하게 접촉하는 이중층을 형성합니다. CD 80 D high MTS는 섬유아세포에 의해 구분되는 소형 셀 응집체를 형성하는 경향이 있는 반면, mtech 하위 집합은 EDU 통합으로 입증된 바와 같이 입증된 3D OTC 조건에서 생존할 뿐만 아니라 증식합니다. 흥미롭게도 CD 80 낮은 MT 기술은 rankl이 있을 때 더 높은 속도로 증식합니다.

CD 80 High MT Techs의 경우 그 반대이지만, 이 동영상을 시청한 후에는 MT 배양 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 3D OTC를 사용하는 기술자. 이는 기술 차별화, PGE 유지 관리 및 유도 측면에서 2D 배양 시스템을 사용하는 것보다 훨씬 우수한 방법이며, 여러 테이크 매개변수를 연구하거나 조작할 수 있는 잠재력이 있습니다.