Name: 치과 복합 재료의 Cytocompatibility 평가하기위한 효율적인 방법으로 공 촛점 시간 경과 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 배우세요 3D 공촛점 레이저 주사 현미경을 활용한 시간 경과 영상법으로 치과 복합 재료의 세포독성을 평가하는 방법을. 인간 잇몸 섬유아세포를 사용하여 실시간 세포 거동을 관찰하고 생체적합성을 정량적으로 분석합니다.

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Saremco Dental Switzerland와 Olympus Microsystems France 회사들은 재정적 지원에 대해 감사의 뜻을 전합니다. Saremco Dental은 또한 치과용 복합재 ELS extra low shrinkage의 관대한 기부로 인정받고 있습니다. 저자는 또한 영어 교정에 도움을 준 University College London(유니버시티 칼리지 런던) 화학과의 Simon Banks 박사에게 감사를 표하고자 합니다.

프로토콜은 세 가지 주요 단계로 구성된다 : 첫 번째 단계는 배양 배지에서 복합재 추출물의 제조를 포함하며; 두 번째 문제 기본 인간 치은 섬유 아세포 (HGF) 세포 배양, 복합 추출물과 세포 염색 세포의 접촉; 세 번째 단계는 공 초점 이미징 및 형광 신호 분석으로 구성되어 있습니다. 치은 조직을 복용의 경우, 프로토콜은 프랑스 법, 동의서 및 지역 윤리위원회 준수 승인을 받았다. 1. 복합 추출물 준비 용출 매체로 둘 베코의 변형 이글 배지 (DMEM)를 사용합니다. 시험편의 표면적과 추출 매질의 부피의 비는 ISO 12분의 10,993 요구 최하위 레벨인지 확인. 절차는 최근 11 기재되고 아래 간단히 요약된다 : <ol><li> 맞춤 보류를 경화 치과 복합의 구형 샘플 양식어. 홀더 크기는 경구 임상 치료에 일반적 의뢰 경화 깊이에 따른 것이다 반경 2mm이다. </li><li> 웰 플레이트를 준비, 5 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 암포 테리 믹스 1 %로하지만 소 태아 혈청 (FBS)이없는 배지의 각각 함유하는 1 ㎖ (DMEM). </li><li> 40 초 동안 1,070 메가 와트 cm -2 강도 (λ = 465-475 ㎚)와 LED 조명 램프를 사용하여 잘 포함하는 DMEM 배지 내에서 치료 샘플. 경화 팁과 시료 사이의 거리가 0.5 mm의 범위 인 것이 확인. 치아와 경화 치과 복합의 차이 인 일시적 접촉을 시뮬레이션이 경화 모드를 사용합니다. 보철 복합체 구강에 배치 될 때 임상 적 상황에서 접촉이 발생한다. </li><li> 공기 중 5 % CO 2의 가습 된 분위기 하에서 37 ° C에서 샘플 (DMEM 배지에서 복합 표본) 부화. 동일한 조건에서 대조군 세포에 대한 (합성 샘플 없음) DMEM 배지를 배양하라. </li></ol> 2. HGF 세포 배양, 복합 추출물 테스트 및 세포 염색 <ol><li> 성장과 세포 배양의 유지 보수 일상적인 교정 추출 동안 촬영 환자의 건강한 치은 조직 생검에서 인간 치은 섬유 아세포를 분리합니다. <ol><li> 10 % FBS의 존재하에 DMEM 인간 치은 섬유 아세포를 배양, 5 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 1 % 암포 테리 B. 공기 중 5 % CO 2의 가습 된 분위기 하에서 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포를 유지한다. </li><li> 변경된 매체 매 3 일, 그리고 통과 세포 5 일마다. 트립신에 의해 포화 상태, 수확 세포에 도달 한 후. </li><li> 5 분 90 XG에 원심 분리기 세포 배양 배지에서 그들을 다시 일시 중지합니다. 홀 핸드 헬드 자동 세포 계수기로 세포를 계산합니다. </li><li> 챔버 슬라이드 시스템에서 2.5 × 104 세포 / ml의 세포 밀도로 시드 세포 현탁액. 5 %의 분위기하에 밤새 37 ° C에서의 세포 배양을 허용. </li></ol></li><li> 문화의 세포에 복합 추출물의 첨가 <ol><li> (배양 24 시간 후) 시험 복합 추출물 1 ㎖에 의해 챔버 슬라이드의 두 우물의 용지를 교체하십시오. </li><li> 동일한 조건에서 남은 두 웰 (대조군 세포)를 유지한다. </li><li> 공기 중 5 % CO 2의 가습 된 분위기하에 인큐베이터에서 37 ° C에서 네 개의 우물을 포함하는 챔버 슬라이드를 부화. </li></ol></li><li> 형광 염색 제조업체의 지침에 따라 진핵 세포의 라이브 / 죽은 세포 독성 얼룩을 사용합니다. NOTE는 : 키트 세포막 무결성 및 에스 테라 제 활성에 기초하여 집단에서 세포의 생존 능력을 결정하기 위해 빠른 2 색 형광 분석을 제공한다. 얼룩은 membran의 세포 내 에스 테라 제 활동과 빨간색 형광 에티 디움 호모 다이머-1 (EthD-1) 표시하기 위해 손실을 나타 내기 위해 동시에 녹색 형광 칼 세인 AM과 라벨에 의해 손상된 세포에서 라이브 구분전자의 무결성. <ol><li> 칼 세인 오전 2 μM 4 μM EthD-1 (섬유 아세포 염색에 적합한 것으로보고 최종 농도)를 포함하는 두 개의 염색 시약의 작업 솔루션을 준비합니다. 선택된 복합재 추출물의 존재 또는 부재하에 배양 된 세포에 부착 얼룩을 추가한다. </li><li> 염색 후 시간 경과 영상을 통해 최소 15 분에서 직접 신속하게 염색 된 세포 집단을 준수하십시오. 하지 원심 분리기를 수행하고 염색 된 세포를 픽스하지 않습니다. </li></ol></li></ol> 3. 공 촛점 시간 경과 이미징 및 신호 분석 사용 된 시스템은 네 개의 다이오드 레이저 장치와 각 시험편에 대한 최대 네 개의 형광 염료에 대한 멀티 - 얼룩진 화상을 갖추고있다. 시스템은 하나이자 (600X 배율)의 영역을 관찰 이동할 수있는 시료의 개요를 제공 매핑 화상 (10X 배율)을 수행 할 수있다. <ol><li> 시간 경과 영상 <ol><li> 의 배치pecimens는 공 초점 통합 보육의 어두운 방 (챔버 슬라이드 스테인드 샘플을 포함) (37 ° C, CO 2 다습 한 분위기의 5 %). </li><li> 해당 레이저를 선택합니다. 칼 세인과 EthD-1을 자극하는 두 개의 레이저 소스를 473 나노 미터 (15 MW) 및 (559) 뉴 멕시코 (18 mW의)를 사용합니다. </li><li> 두 사용되는 형광 염료로 이미지에 혼선없이 라인 시퀀스를 통해 이미지를 수집하기 위해 두 개의 연속 모드를 사용합니다. </li><li> 자동 주사 유닛의 형광 염료에 따라 조건을 설정하기 위해 새로이 개발 된 스펙트럼 검출기를 사용한다. </li><li> 최대 채널별로 검출 된 형광의 대역폭을 최적화. 기록 모든 인수는 순차적으로 잠재적 교차 이야기를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 수집 소프트웨어를 이용하여 형광 염료 선택에 기초하여 최적의 촬상 조건을 선택한다. </li><li> 자동 나선형 패턴의 중심에서 생성되는지도 화상을 취득관심 영역 쉽게 자세히 살펴보면 선정된다. </li><li> 선택 관찰 모드. 시간 경과, Z-스택, 필요에 따라 여러 영역을 포함하여 관찰 모드의 다섯 가지 유형까지 선택합니다. 본 연구에서 Z-스택 및 시간 경과 모드의 조합을 사용하여 신속하게 이미지 캡처를 완료 </li><li> 변경 및 형광 염료를 전환합니다. 대안 적으로, 형광 및 서로 광 콘트라스트 이미지를 오버레이. 왼쪽 아래지도 화면에서 선택한 지점을 사용하여 라이브 이미지를 관찰합니다. </li><li> 프레임을 사용하고 기능을 확대하여 이미지 영역을 결정합니다. 선택적으로, 형광 염료의 종류마다 표시 전환. 참고 :이 프로토콜에 사용되는 현미경은 컴팩트 한 디자인에 높은 기존의 공 초점과 같은 기능이 있습니다. 현미경 최적 단순화 내장 인큐베이터와 살아있는 세포의 안정 시간 경과 영상에 적합 거꾸로 물 침지 목표를 갖추고 있습니다. </lI&gt; </ol></li><li> 신호 분석 및 정량화 <ol><li> 형광 신호를 정량화하는 이미징 소프트웨어를 사용합니다. 모두 테스트 샘플 및 세포 제어를위한 10 배 목적으로 다섯지도 이미지를 가져옵니다. </li><li> 0.231 μm의 × 0.231 μm의 픽셀 크기, 1,024 × 1,024 픽셀 정기적 인 이미지를 획득. 신호 분석을위한 올림푸스의 이미지 포맷 (OIF)로 화상을 저장합니다. 이 형식은 함께 다양한 파라미터 설정과 이미지를 저장 할 수 있습니다. 다른 분석 도구 (강도 프로파일의 측정, 두 사용되는 채널 사이의 강도 비)를 사용합니다. </li><li> 12 비트 / 픽셀 TIFF 파일로 최대 투사 이미지를 저장합니다. </li><li> R 지휘관 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 프리폼. 반복 시험과 분산 (ANOVA) 단방향 분석을 사용하여 차이점을 분석한다. 보고서는 (± 표준 편차) 등의 평균 표준 편차 P &lt;0.05에서 통계적으로 유의 한 결과. </li></ol></li></ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없으며 공개할 것이 없다고 선언합니다.

생체 적합성 물질의 동작은 의료용으로 평가하는 가장 필수 파라미터이다. 국제 표준은 의료 기기 ISO를 10993 33 특히 치과 재료 ISO 7405 (34)를 커버한다. 주변의 세포 독성 효과의 부재는 재료의 생체 적합성 평가의 핵심 표준이다. 37 - 세포 독성 시험은 치과 재료의 생체 적합성 (35)의 평가에서 이러한 중요성을 가지고 이유입니다. ISO 테스트 방법은 신진 대사 활동 또는 막 무결성을 기반으로 할 수 있습니다 제안했다. 선택된 엔드 포인트는 시간과 평가 분석의 비용을 최소화하기 위해 시험 물질에 의해 유발 된 부작용의 순위에 대한 구체적인 조건을 따라야한다. 조사의 현재 방법 (3D 공 촛점 시간 경과 영상)을 기반으로 막 무결성. 이 엔드 포인트를 통해 세포 독성 평가는 세포 biocompa의 중요한 지표가 될 것으로 보인다테스트 자료와 그것이 가진 tibility 또한 ISO는 엔드 포인트를 승인했다. 시험관 시험 물질 샘플이 특정 세포 유형에 영향을 미치는 방법을 결정하기 위해 설계되었습니다. 비색 MTT 분석은 원래 시험 관내 세포 독성 및 세포 증식의 측정에 유용한 방법으로서 (1983) 모스맨 의해 설명 하였다. MTT 시험 미토콘드리아 활성을 결정 활성 셀에 의해 포르 마잔 결정으로 테트라 졸륨 염 변환에 기초한다. 이것은 생존률 (38)에 의해 번역 될 수있다. 굽​​타 및 공동 작업자 MTT 시험 복합 수지의 세포 독성을 측정하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이다보고. 숙신산 탈수소 효소 알칼리성 포스파타제 및 응답은 또한 동일한 목적 (39)을 위해 사용되어왔다. MTT 분석법은 각 측정 시점에서 세포를 죽이는 필요하기 때문에, 세포의 운명, 추적 할 수 없다. 현재 연구에서 더욱 밀접하게 염색 된 세포의 동작을 모니터링하기 위해, 다이에살아있는 세포의 RECT 관찰, 짧은 프로토콜 염색, 자동 이미지 분석 및 형광 신호의 정량화와 함께 시간 경과 CLSM 영상 덕분 하였다. 치과 복합 재료는 구강 조직, 특히 잇몸과 치수의 세포에 밀착되어 있습니다. 41 - 섬유 아 세포는 이러한 회복 복합 재료 (40)로부터 방출 구성 요소의 대상이 될 것입니다. 또한, 여러 연구는 불후의 세포 및 일차 전지는 생체 물질과 접촉하는 다른 세포 반응이있을 수 있다고보고있다. 일차 세포는 생체 물질 (42) 효과를 평가하기 위해 더 적절한 것으로 밝혀졌다. 이것은 현재 연구에서 시험 치과 복합체의 세포 독성 평가를위한 세포 모델로서 일차 인간 치은 섬유 아세포 세포의 사용을 설명한다. 44 - 치과 복합체로부터 방출 물질의 독성 전위는 43 널리 검토되고있다. t를 평가하기 위해서그 물질의 잠재적 인 세포 독성, 두 콘택트 모델 셀은 수행 될 수있다. 간접 접촉 시스템에서, 세포 생물학 미디어에서 용출과 접촉하는 동안 대상 직접 접촉 모델 시스템에서 물질을 직접적으로 표적 세포로 배치된다. 임상 적용 및 회복 절차, 치과 복합은 치은 조직과 간접 접촉에 배치됩니다. 이러한 이유로, 현재의 실험 프로토콜 (시험 복합 추출물의 존재하에 세포) 인간 치은 섬유 아세포와 간접 접촉 시스템에 집중 하였다. 이전 달과 공동으로 보도 된 바와 같이, 세포 독성 반응은에 활동 기준에 따라 &lt;(90 %), (30 % 중간 (30~60%), 약간 (60~90%) 또는 비 세포 독성)&gt; 심한 위를 차지했다 값은 컨트롤 (45)에 대한 취득. 따라서, 얻어진 결과의 빛 (표 1)이 순위에과에 따라, 복합 ELS 여분의 낮은 수축 VER로 선정 될 수있다Y는 약간 세포 독성 및 전체 시간 경과 기간 동안 세포를 제어하는​​ 비교 동작을 나타내었다. 정확하게 동일한 방법을 이용하여 조사, 본 연구의 결과는 최근 발표 된 연구와 비교 될 수있다. ELS 여분의 낮은 수축 복합은 직접 복원 11 같은 임상 응용 프로그램에 사용되는 두 개의 이전에 테스트 복합 재료에 비해 우수한 생체 적합성을 보여 주었다. 추가적인 연구는 더욱 완전한 비교를 설정할 필요하다. 특정 종말점 평가를 승인하는 세포 독성 분석을 결정할 때, 그 장점과 각 분석의 한계를 이해하는 것이 중요하다. 공 촛점 이미지의 주된 목적은 세포 및 기관의 3-D 구조를 달성하는 것이다. 이 기술은 시료의 표면뿐만 아니라, 그 표면 아래뿐만 아니라 공개 할 수있다. 본원에 기재된 프로토콜은 SENSI로서, 3D CLSM 시간 경과 촛점 이미징의 사용을 강조적인 방법은 치과 복합 체외 생체 적합성 동작을 평가한다. 그러나,이 연구에서 발생 한계를 피하기 위해, 진동 방지 워크 스테이션은보다 안정적이고 장시간 경과 이미징을 허용하기 위해 사용될 수있다; 탁상용 실험실에서 진동이 발생할 수 있음 해로운 영향에서 사용 된 공 초점 시스템을 분리 할 수​​ 있습니다. 또한, 재료는 이상적으로 치은 조직에 무해해야한다 구강에 사용되는 전신 독성을 일으킬 수있는 물질이 포함되어야합니다. 사용 방법에 따라서, 현재의 연구에서 얻은 결과 그것은 테스트 복합체 (ELS 여분 낮은 수축율) 본 실험 조건에서 세포 독성이되지 않는다는 결론을 내릴 수있다. CLSM 방법 민감 생존 세포의 초기 속도를 제공 할 수 있듯이, 다른 가능성은 더 많은 엔드 포인트를 평가하기 위해 예상 될 수있다. 특히, 최근보고 된 바와 같이 합성 모노머 THR 세포에 영향을 미친다깨닫지 못하고 있거나 남의 반응성 산소 종 (ROS) 46- (48)가, 추가 조사는 세포 독성 사이는 네트워크 및 ROS 생성을 시그널링하는 경우 상관 관계를 평가하기 위해 필요하다. 미래의 프로토콜을 동시에 ROS 생산을 평가하기 위해 (H 2 O 2 및 / 또는 O 2 - 염색) 설계 될 수 있으며, 시간 경과 CLSM 영상을 사용하여 세포 독성 비 (라이브 / 죽은 염색).

생체 적합성을 정의하는 ISO 권고에 인용 주요 표준 중 하나는 세포 독성 물질의 부재이다. 수지 기반 치과 복합 시간이 1-4 이상 및 / 또는 이상에 의한 분해 과정에 대한 부분 중합 초기에 기인 할 수있는 수지 매트릭스의 구성 요소를, 공개 할 수 있습니다. 이 발표 구성 요소는 구강 조직에 접촉 및 두드러기 및 점막 반응 5 명 6 알레르기 및 과민 반응의 개발, 미토 겐에 유형에 대한 치은 섬유 아세포의 형태와 감소의 수정 I 콜라겐 단백질 (7), 면역 억제 또는 면역 자극 같은 다양한 단점을 가질 수있다 자신의 유전 독성 가능성 (9)을 강조 정제 T 림프구 및 비장 세포 (8) 및 기본 인간 치은 섬유 아세포의 DNA 손상 구동 형 확산. 대부분의 매개 변수는 C의 그늘로 치과 복합 독성에 영향을 미칠 수omposite, 광 경화 수지 단량체의 화학 성분, 충전제 및 전환 10- (13)의 정도. 재료의 시험 관내 독성 생체 전위 상황에서 예측할 수 있고, 일부 관련 엔드 포인트의 연구에 의해 임상 적 상황과 비교 될 수 있기 때문에. 치과 복합 재료 및 그 구성 요소의 세포 독성 널리 세포 배양 시스템 14- (16)으로 평가하고 있었다. 이러한 체외 시스템의 용어에 치과 복합 생체 적합성을 평가하기 위해 개발되었다 : 세포 성장, 세포 사멸 세포 (17)와 같은 THP-1monocytes를 사용하여, 인간 치은 섬유 아세포 (18)의 세포 독성, HaCaT에 염증 가능성이 세포 2, 세포 기능처럼 각화 odontoblast- MDPC-23 세포 (19), 총 RNA 수준의 감소, 인간 치은에 세포 사멸 유도에 크게 증가처럼 각화 20치은 및 펄프 섬유 아세포 세포 (21)에 대한 DNA 손상. 다른 방법은 치과 복합 재료의 생체 적합성을 조사하기 위해 제안된다. 특정 착색제 및 광 흡착 측정을 포함 비색 분석법, 그들의 상대적인 단순성 및 저가 22- 26, 가장 일반적으로 사용 남아있다. 광에 의한 콘트라스트 현미경 분석은 종종 더 많은 시간을 소비하며 비용 증가를 초래한다. 그러나 이러한 현미경 기술은 몇 가지 중요한 장점이있다. 셀 구조의 관찰하여보다 적절하고 중요한 데이터를 제공, 경험 독성 효과에 대한 확장 정보를 제공합니다. 특히, 공 초점 현미경 (27)의 도입은 기존의 와이드 필드 이미징 형광 현미경에 비해 축 방향의 해상도를 향상시키는 생물학적 구조의 관찰을 허용했다. 따라서, 공 초점 이미징의 다양한 분야에서 강력한 조사 도구가되었습니다의료 및 과학 연구. 전자 현미경 기술과 대조적으로, 스캐닝 공 초점 현미경은 특정 형광 마커의 혼입에 의해 세포의 별개의 구성 요소를 시각화 할 수있는 능력을 제공한다. 이들 특정 트레이서 대부분 임상에서 사용뿐만 아니라 실험실 연구 연구를 허용, 수성 환경에서 안정한 띌 측정, 저렴하고 28 무독성이다. 또한, 종래의 전자 현미경 분석에 필요한 시료 건조 및 고정 시간 경과 촛점 이미징을위한 필요가없고, 따라서 시간에 따라 획득 된 샘플에 또한 가능하다. 이차원 촬상에 비해 공 촛점 촬상 원리 시편 지하 시각화 및 상이한 깊이 얻어진 이미지에서 입체 구조의 재구성을 가능하게; 초래되는, 더 정확하고 더 세부 구조 (29), (30). 본 연구는 비디오 입체 타임 랩스 C의 사용의 예이다혁신적인 방법으로 라이브 / 죽은 형광 표지 및 신호 정량화와 결합 onfocal 레이저 스캐닝 현미경 (3D-CLSM). 이 논문에서 제시된 기술은 평가 된 셀 구조를 변경하지 않고 생균의 민감한 평가 및 시간 경과 이미징을 가능하게하는 장점을 갖는다. 어떤 준비 단계는 공 초점 분석하기 전에 필요하지 않습니다. 이전에는, 동일한 염색 배양 해면골 코어 (31)의 가능성을 평가하기 위해 다음의 촛점하지만 경과하지 않고 사용 하였다. 마찬가지로 동일한 시간 경과 촛점 절차 / 특정 박테리아 라이브 죽은 염색법을 사용하여 그람 형태 32에 따른 활성 슬러지의 박테리아 에리스로 시간 - 명 활성을 평가하는데 사용 하였다. 이들 방법은 최근에 적응 및 메타 크릴 레이트 단량체 11에 기초 치과 복합 독성을 비교하기 위해 사용되어왔다.

<table><tbody><tr><td>올림푸스 플루오뷰 FV10i&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>O2/CO2 인큐베이터</td><td>Pnasonic</td><td>MCO 5M</td><td>세포 인큐베이션</td></tr><tr><td>라이브/데드 키트</td><td>인비트로겐&nbsp;</td><td>MP 03224</td><td>스테인&nbsp;</td></tr><tr><td>ELS 초저 수축 &nbsp;</td><td>사렘코&nbsp;</td><td></td><td>치과 복합</td></tr><tr><td>DMEM 매체</td><td>Sigma</td><td>D 6046</td><td>배양 매체</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td>수확 세포</td></tr><tr><td>챔버 슬라이드 시스템&nbsp; &nbsp;</td><td>PAA</td><td>14220040X</td><td>배양실</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신&nbsp;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>암포테리신 B</td><td>PAA</td><td>P11-001</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>태아 소 혈청&nbsp;</td><td>PAA</td><td>A11-101</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>세포 카운터</td><td>Merck Millipore</td><td>00110230TP1</td><td>세포 계수&nbsp;</td></tr></tbody></table>

치과 복합 재료의 cytocompatibility 평가하기위한 효율적인 방법으로 공 촛점 시간 경과 영상

Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

그것은 일반적으로 시험 관내 세포 물질의 상호 작용은 치과 용 재료, 생체 적합성의 평가 기준이 유용한 것을 허용한다. 이 연구의 목적은 치과 복합 재료의 생체 외 생체 적합성을 평가하기 위해 3D CLSM의 시간 경과 공 촛점 이미징을 사용하는 것이 었습니다. 이 방법은 치과 복합 추출물과 접촉 생존 세포 비율의 정확하고 민감한 표시를 제공한다. ELS 여분의 낮은 수축, 직접 복원에 사용되는 치과 복합체는, 예를 들어 촬영되었습니다. 시험관 평가는 라이브 / 죽은 염색을 사용하여 배양 주 인간 치은 섬유 아세포에서 수행되었다. 이미지는 FV10i 공 초점 생물학적 반전 시스템으로 얻은 FV10-ASW 3.1 소프트웨어로 분석 하였다. 이미지 분석은 시간 경과 5 시간 후에 시험 복합체의 존재 하에서 아주 약간의 세포 독성을 보였다. 세포 생존의 약간의 감소는 시험 복합 추출 비교 예와의 접촉에 나타내었다에드 셀을 제어 할 수 있습니다. 결과는 정 성적 및 정량적으로 치과 복합 재료의 생체 적합성을 평가하기위한 동작 감지 방법으로서 3D CLSM 시간 경과 이미징의 사용을 강조.

그림 1은 제어 및 시험 복합 추출물 (ELS 여분의 낮은 수축)에 노출 된 세포를 모두 얻을 매핑 이미지 (10 배 목표)의 라이브 / 죽은 염색 된 세포의 개요를 보여 주었다. 세포의 삼차원 구조는 배율 600X에서 시각화 될 수있다. 제어실과 시험 복합 추출물의 존재 하에서 챔버 내에서 수집 된 세포의 수집 세포의 가시화는도 2에 제시되어있다. 최대 돌기 (대물 60X)는 시간 경과의 시작에서 선택된 세포 집단의 운명을 도시 (15 분에서)와 시간 경과 기간 말 (5 시간에). 이미지의 쉰 일곱 스택 (xyzt 모드 스캔, 스택 당 39 이미지, 복셀 깊이 1.00 μm의)는이 기간 동안 얻었다. 적색 형광에 녹색 형광 신호에 약간의 감소와 아주 약간의 변화는 노출 된 세포에서 얻어졌다. 유의 한 변화는 제어를 위해 관찰되지 않았다세포. 복합 추출물 노출 된 셀들은 셀을 제어하는​​ 스핀들 유​​사한 형태를 상정; 형태는 (녹색 신호 감소 및 테스트 복합체의 존재에 빨간 신호 증가에도 불구하고)이 실험 조건에서 변경되지 않았습니다. 이미지 분석은 녹색​​ 및 적색 모두 신호에 대한 음성 대조군 세포에 비해 테스트 용 복합 얻어진 이미지에서 다른 세포 집단에 대응 선택한 5 개의 상이한 이미지 스택에서 수행 하였다. 염색 된 세포의 강도 프로파일은도 3에 도시되어있다; 테스트 복합체와 접촉 세포의 녹색 및 적색의 신호 발생이 대조군 세포의 것과 비교했다. 칼 세인과 EthD-1 형광 방출 강도는 대조군 세포에 노출 된 복합 세포에서 측정 하였다. 측정은 최대 5 시간 동안 한 시간 간격으로 행해졌 다. 녹색 495-515 나노 미터의 통합 강도와 붉은 620-650 nm의 신호에 따라 그린 / 레드 형광 비율 () 시간 경과 기간을 계산 하였다. ELS 여분 낮은 수축 추출물에 생존 제어용 비율과 노출 된 세포 일 수 T에 나타내었다. 시험 복합체의 존재 하에서, 생균의 비율이 1 시간 후 93.9 %로 100 % 약간 감소였다 접촉. 유의 한 차이는 지정된 시간 경과 기간의 5 시간 후에 시험 복합 (있는 복합 추출물이없는 세포) 음성 대조군 사이에 관찰되었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig1highres.jpg"> 도 1 : 매핑 화상의 개요 시간 경과 시간 (t = 15 분)의 시작 부분에서의 복합 추출 (ELS 여분 낮은 수축)의 존재하에 대물 10X, (A) 대조군 세포와 (B) 세포에서 세포를 염색 하였다. 녹색 영역은 살아있는 세포이고 빨간색 지역은 손상된 세포이다. 이에실험 조건 (모두 녹색 및 적색 형광 용) 없음 변화는 대조군 세포에 비해 복합 노출 세포 관찰되었다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig2highres.jpg"> 도 2 (A) 제어실과 처음에 (B) 복합 추출물 챔버 및 노출 시간 경과 기간의 끝에서 세포 집단의 대물 60X에서 CLSM 이미지 (I : 15 분 및 II는 : 각각 5 시간, ). 녹색 영역은 살아있는 세포이고 빨간색 지역은 손상된 세포이다. 이미지의 패널은 강도 신호에 약간의 변화 (녹색 신호에 약간의 감소와 빨간 하나에 아주 약간의 증가)을 보여 주었다. 어떠한 세포 형태의 변화는 복합 추출물의 존재는 관찰되지 않았다; 대조군 세포로 자신의 스핀들 모양과 섬유 모세포의 형태를 유지하고 세포를 노출합니다. 그림 3 : 시간 경과 현미경에서 관찰되는 세포의 라인 프로파일 15 분 5 시간에서 (II)에서 (A) 대조군 세포 (B) 복합 추출물 노출 된 세포, (I).. 상관없이 테스트 복합체의 존재하에 녹색 신호 진화에 눈에 띄는 변화 없음 시간 콘택. 그러나, 적색 신호의 약간의 증가는 접촉 5 시간 후에 복합체의 존재가 관찰되었다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> 접촉 시간 (시간) </td><td colspan="5"> 세포 생존율 (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> (5) </td></tr><tr><td> 제어 셀들 </td><td> (100) </td><td> (100) </td><td> 100 &lt;/ TD&gt; </td><td> (100) </td><td> (100) </td></tr><tr><td> ELS 여분의 낮은 수축 ® </td><td> 93.9 ± 7 </td><td> 91.3 ± 5 * </td><td> 89.5 ± 3 * </td><td> 87.6 ± 2 * </td><td> 87.7 ± 3 * </td></tr></tbody></table> 표 1 :. 복합 추출물 세포 생존 접점 1, 2, 3, 4, 5 시간 후 살아있는 HGF 세포 진화의 평점 라이브 / 죽은 세포 독성 키트를 사용하여 염색하여 분석 하였다. 다섯 이미지의 SD 분석 스택 ± 데이터는 평균 값을 보여줍니다. 값은 p &lt;0.05에서 대조군 세포와 크게 다르다.

치과 복합 재료의 생체 적합성 연구의 대부분의 측면은 형광 신호의 정량화와 결합 된 세포 독성 3D CLSM 시간 경과 영상은 시간이 지남에 따라 세포의 운명의 민감한 평가할 수있다. 이 방법을 활용하여 치과 복합 재료의 cytocompatibility을 평가하는 효율적인 도구가 될 수 있습니다.

치과 복합 재료의 Cytocompatibility 평가하기위한 효율적인 방법으로 공 촛점 시간 경과 영상

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The ...

이 절차의 전반적인 목표는 타임 랩스 이미징을 위해 3D 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 치과 복합재의 체외 생체 적합성을 정성적 및 정량적으로 평가하는 것입니다. 이것은 먼저 두 번째 단계에서 경화되지 않은 치과 복합재의 구형 샘플을 채취하여 수행됩니다. 인간 치은 섬유아세포는 이러한 복합 추출물의 유무에 관계없이 배양된 다음 세포에 살아있는 사체 염색으로 표지됩니다.그런 다음 세포 배양에 대한 맵 이미지가 생성되고 관심 영역에 대한 오버레이 이미지가 생성됩니다. 궁극적으로, 테스트된 복합체의 존재 유무에서 발생하는 세포 행동의 실시간 차이는 이미지에서 관찰된 녹색 또는 적색 형광 신호의 변화에 따라 모니터링할 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포 구조의 변화를 유도하지 않고 살아있는 세포를 실시간으로 모니터링할 수 있다는 것입니다.세포 염색 후 또는 시간 경과 관찰 전에 고정 또는 건조 단계가 필요하지 않습니다. 복합 추출물을 준비하려면 먼저 반경이 2mm인 맞춤형 홀더를 사용하여 경화되지 않은 치과 복합재의 구형 샘플을 형성하는 것으로 시작합니다. 대조군 세포 배양을 위해 일부 웰에 배지만 남겨두도록 주의하면서 1ml의 배양 배지를 포함하는 6웰 플레이트의 개별 웰로 샘플을 옮긴 다음 샘플의 0.5mm 이내에 1070밀리와트 제곱 강도를 가진 LED 램프를 배열합니다.치아와 관리되지 않은 치과 복합재 사이의 일시적인 접촉을 시뮬레이션하기 위해 샘플을 40초 동안 경화시킨 다음 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 복합 표본을 배양했습니다. 배지는 3일마다, 세포는 5일마다 교체하십시오. 그런 다음 배양액이 공동 유창성에 도달한 후 세포를 수확하고 90배 G 및 섭씨 37도에서 5분 동안 스핀다운합니다.펠릿을 배양 배지에 재현탁시킨 다음 세포를 계수한 후 5% 이산화탄소 분위기에서 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 챔버 슬라이드 시스템에서 밀리리터당 4번째 세포에 2.5배의 세포 밀도로 세포 현탁액을 파종합니다. 다음 날 아침, 챔버 슬라이드의 두 웰에 있는 배지를 테스트된 복합 추출물 1ml로 교체하고 슬라이드를 인큐베이터에 다시 넣어 컨포칼로 세포를 이미지화합니다. 타임랩스 이미징.먼저 제조업체의 지침에 따라 진핵 세포에 대한 살아있는 죽은 세포 독성 염색으로 공동 배양된 복합 및 대조 세포에 라벨을 부착합니다.염색 후 15분 후 세포 배양 조건에서 챔버 슬라이드를 컨포칼 통합 챔버의 어두운 곳에 놓고 473 나노미터 및 559 나노미터 레이저를 예열합니다. 다음으로, 새로 개발된 스펙트럼이 있는 검출기를 사용하여 473 나노미터 레이저의 이미징 조건을 자동으로 설정합니다.프레이밍 및 확대/축소 기능을 사용하여 관심 영역을 선택한 다음 관찰 모드를 선택합니다. 필요에 따라 타임 랩스 Zack과 다중 영역을 포함하여 최대 5가지 유형의 관찰 모드를 선택한 다음, 원하는 이미지가 획득되었을 때 테스트 샘플과 대조군 셀 모두에 대해 10 x 대물렌즈 아래에서 473 나노미터 레이저로 5개의 맵 이미지를 신속하게 캡처합니다. 559 나노미터 레이저로 전환하고 방금 시연한 것처럼 두 번째 형광등에서 세포의 이미지를 캡처합니다.또는 X 60 라이브 화면에서 선택한 지점을 사용하여 형광등 및 광 대비 이미지를 오버레이하여 라이브 이미지 저장소를 관찰합니다. 신호 분석을 위한 Olympus 이미지 형식의 맵 이미지와 최대 프로젝션 이미지는 픽셀당 24비트입니다. 그런 다음 TIFF 파일은 다른 분석 도구를 사용하여 신호의 강도 프로파일과 두 형광 채널 간의 강도 비율을 측정합니다.마지막으로, 적절한 소프트웨어를 사용하여 두 그룹 간의 형광 세포 신호 전달의 차이를 분석합니다. 배지 단독으로 또는 복합 추출물에 노출된 살아있는 TED 염색 세포의 이러한 맵 이미지에서는 저속 경과 15분이 지나도 세포의 생존력에 차이가 관찰되지 않았습니다. 여기서, 대조 세포의 최대 투영 이미지는 관찰된 바와 같이 시간 경과 기간이 끝날 때 처음 15분 이내와 5시간 이내에 세포의 확대된 운명을 보여주며, 잠복 기간 동안 대조군 세포 내 형광에는 큰 변화가 없었습니다.ELS 초저수축 노출 세포는 대조군 세포와 유사한 방추체 형태를 취했지만, 저속 기간이 끝날 때 녹색 형광 신호가 약간 감소하고 적색 형광이 매우 약간 증가했습니다. 염색된 세포의 강도 프로파일은 이들 그래프에 예시되어 있으며, 여기서 칼슘 내피 호모다이머 1 형광 방출 강도는 대조군 및 복합 노출된 세포에서 최대 5시간 동안 1시간 간격으로 측정되었습니다. 두 배양 간에 신호전달에 있어 유의한 차이는 관찰되지 않았습니다.대조군 세포와 노출된 복합 세포에 대한 생존율 비율이 표에 나와 있습니다. 테스트된 복합체가 있는 경우, 5시간 후 1시간 접촉 후 살아있는 세포의 비율이 100%에서 93.9%로 약간 감소하는 것으로 나타났습니다. 복합체의 비세포독성에도 불구하고 테스트된 복합체 ELS, 매우 낮은 수축 및 음성 대조군 세포 배양 간에 세포 생존율의 유의한 차이가 관찰되었습니다.현재 데이터는 컨포칼 타임랩스 이미징을 치과 복합재 개발 후 치아 복합재와 접촉하는 gen 섬유아세포 거동을 평가하기 위한 정확하고 민감한 방법으로 사용하는 것을 강조합니다. 이 방법은 독성학 분야의 연구자들이 치과 재료, 약물, 화학 물질 및 기타 의료 기기의 세포 독성 및 위험 평가를 탐구하는 개인적인 방법입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

출처: Parker, J. J., et al. 항침습적 약물의 종양 세포 이동 및 환자 특이적 효과 연구를 위한 인간 교모세포종 기관형 절편 배양 모델. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 공초점 현미경을 통해 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 교모세포종 조직 절편의 이미징을 보여줍니다. 고해상도 이미지는 종양 세포의 움직임과 방향을 추적하기 위해 일관된 간격으로 캡처됩니다.

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