치과 복합 재료의 Cytocompatibility 평가하기위한 효율적인 방법으로 공 촛점 시간 경과 영상

이 절차의 전반적인 목표는 타임 랩스 이미징을 위해 3D 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 치과 복합재의 체외 생체 적합성을 정성적 및 정량적으로 평가하는 것입니다. 이것은 먼저 두 번째 단계에서 경화되지 않은 치과 복합재의 구형 샘플을 채취하여 수행됩니다. 인간 치은 섬유아세포는 이러한 복합 추출물의 유무에 관계없이 배양된 다음 세포에 살아있는 사체 염색으로 표지됩니다.

그런 다음 세포 배양에 대한 맵 이미지가 생성되고 관심 영역에 대한 오버레이 이미지가 생성됩니다. 궁극적으로, 테스트된 복합체의 존재 유무에서 발생하는 세포 행동의 실시간 차이는 이미지에서 관찰된 녹색 또는 적색 형광 신호의 변화에 따라 모니터링할 수 있습니다. 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포 구조의 변화를 유도하지 않고 살아있는 세포를 실시간으로 모니터링할 수 있다는 것입니다.

세포 염색 후 또는 시간 경과 관찰 전에 고정 또는 건조 단계가 필요하지 않습니다. 복합 추출물을 준비하려면 먼저 반경이 2mm인 맞춤형 홀더를 사용하여 경화되지 않은 치과 복합재의 구형 샘플을 형성하는 것으로 시작합니다. 대조군 세포 배양을 위해 일부 웰에 배지만 남겨두도록 주의하면서 1ml의 배양 배지를 포함하는 6웰 플레이트의 개별 웰로 샘플을 옮긴 다음 샘플의 0.5mm 이내에 1070밀리와트 제곱 강도를 가진 LED 램프를 배열합니다.

치아와 관리되지 않은 치과 복합재 사이의 일시적인 접촉을 시뮬레이션하기 위해 샘플을 40초 동안 경화시킨 다음 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 복합 표본을 배양했습니다. 배지는 3일마다, 세포는 5일마다 교체하십시오. 그런 다음 배양액이 공동 유창성에 도달한 후 세포를 수확하고 90배 G 및 섭씨 37도에서 5분 동안 스핀다운합니다.

펠릿을 배양 배지에 재현탁시킨 다음 세포를 계수한 후 5% 이산화탄소 분위기에서 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 챔버 슬라이드 시스템에서 밀리리터당 4번째 세포에 2.5배의 세포 밀도로 세포 현탁액을 파종합니다. 다음 날 아침, 챔버 슬라이드의 두 웰에 있는 배지를 테스트된 복합 추출물 1ml로 교체하고 슬라이드를 인큐베이터에 다시 넣어 컨포칼로 세포를 이미지화합니다. 타임랩스 이미징.

먼저 제조업체의 지침에 따라 진핵 세포에 대한 살아있는 죽은 세포 독성 염색으로 공동 배양된 복합 및 대조 세포에 라벨을 부착합니다.염색 후 15분 후 세포 배양 조건에서 챔버 슬라이드를 컨포칼 통합 챔버의 어두운 곳에 놓고 473 나노미터 및 559 나노미터 레이저를 예열합니다. 다음으로, 새로 개발된 스펙트럼이 있는 검출기를 사용하여 473 나노미터 레이저의 이미징 조건을 자동으로 설정합니다.

프레이밍 및 확대/축소 기능을 사용하여 관심 영역을 선택한 다음 관찰 모드를 선택합니다. 필요에 따라 타임 랩스 Zack과 다중 영역을 포함하여 최대 5가지 유형의 관찰 모드를 선택한 다음, 원하는 이미지가 획득되었을 때 테스트 샘플과 대조군 셀 모두에 대해 10 x 대물렌즈 아래에서 473 나노미터 레이저로 5개의 맵 이미지를 신속하게 캡처합니다. 559 나노미터 레이저로 전환하고 방금 시연한 것처럼 두 번째 형광등에서 세포의 이미지를 캡처합니다.

또는 X 60 라이브 화면에서 선택한 지점을 사용하여 형광등 및 광 대비 이미지를 오버레이하여 라이브 이미지 저장소를 관찰합니다. 신호 분석을 위한 Olympus 이미지 형식의 맵 이미지와 최대 프로젝션 이미지는 픽셀당 24비트입니다. 그런 다음 TIFF 파일은 다른 분석 도구를 사용하여 신호의 강도 프로파일과 두 형광 채널 간의 강도 비율을 측정합니다.

마지막으로, 적절한 소프트웨어를 사용하여 두 그룹 간의 형광 세포 신호 전달의 차이를 분석합니다. 배지 단독으로 또는 복합 추출물에 노출된 살아있는 TED 염색 세포의 이러한 맵 이미지에서는 저속 경과 15분이 지나도 세포의 생존력에 차이가 관찰되지 않았습니다. 여기서, 대조 세포의 최대 투영 이미지는 관찰된 바와 같이 시간 경과 기간이 끝날 때 처음 15분 이내와 5시간 이내에 세포의 확대된 운명을 보여주며, 잠복 기간 동안 대조군 세포 내 형광에는 큰 변화가 없었습니다.

ELS 초저수축 노출 세포는 대조군 세포와 유사한 방추체 형태를 취했지만, 저속 기간이 끝날 때 녹색 형광 신호가 약간 감소하고 적색 형광이 매우 약간 증가했습니다. 염색된 세포의 강도 프로파일은 이들 그래프에 예시되어 있으며, 여기서 칼슘 내피 호모다이머 1 형광 방출 강도는 대조군 및 복합 노출된 세포에서 최대 5시간 동안 1시간 간격으로 측정되었습니다. 두 배양 간에 신호전달에 있어 유의한 차이는 관찰되지 않았습니다.

대조군 세포와 노출된 복합 세포에 대한 생존율 비율이 표에 나와 있습니다. 테스트된 복합체가 있는 경우, 5시간 후 1시간 접촉 후 살아있는 세포의 비율이 100%에서 93.9%로 약간 감소하는 것으로 나타났습니다. 복합체의 비세포독성에도 불구하고 테스트된 복합체 ELS, 매우 낮은 수축 및 음성 대조군 세포 배양 간에 세포 생존율의 유의한 차이가 관찰되었습니다.

현재 데이터는 컨포칼 타임랩스 이미징을 치과 복합재 개발 후 치아 복합재와 접촉하는 gen 섬유아세포 거동을 평가하기 위한 정확하고 민감한 방법으로 사용하는 것을 강조합니다. 이 방법은 독성학 분야의 연구자들이 치과 재료, 약물, 화학 물질 및 기타 의료 기기의 세포 독성 및 위험 평가를 탐구하는 개인적인 방법입니다.