생물막의 세포 및 세포 외 성분의 동시 정량화

이 절차의 전반적인 목표는 항균제로 처리한 후 3개의 세포 및 세포외 생물막 구성 요소의 동시 3차원 분포를 정량화하고 비교하는 것입니다. 이것은 먼저 수지 복합 시편을 제작한 다음 연마하여 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 관심 생물막을 표본에서 성장시킨 다음 항균제로 처리합니다.

다음으로, 생물막을 세포 외 고분자 물질, 핵산 및 단백질에 대한 형광 색소로 염색한 다음 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경으로 이미지화합니다. 마지막 단계에서는, 생물막 성분의 동시 시각화를 용이하게 하기 위해 오버레이된 형광 색소의 3차원 이미지를 재구성하고 생물막 이미지로부터 구조적 파라미터를 계산합니다. 궁극적으로, 바이오 부피 및 평균 바이오필름 두께와 같은 바이오필름 구조 매개변수에 대한 통계적 분석을 수행하여 치료 그룹과 대조군 간의 차이를 비교할 수 있습니다.

기존 방법에 비유되는 이 절차의 주요 이점은 절차가 박사 페르난도 플로레스 박사, 박사후 연구원 및 Ms.Kristen Smart, 내 실험실에서 연구 조교가 될 것임을 입증하는 특정 조건 하에서 성장한 생물막의 구조 내에서 여러 구성 요소의 분포를 특성화하기 위해 독특하지만 상호 연결된 기술을 사용한다는 것입니다 표본을 만드는 것은 0.4 또는 TPH 3 치과 수지 복합체의 한 증가를 사용자 정의로 배치하여 시작합니다 스테인레스 스틸 금형을 만들었습니다. 다음으로, LED 광경화 장치로 첫 번째 증분을 40초 동안 중합합니다. 두 번째 증가에 대한 절차를 반복한 후 반자동 그라인더 연마기를 사용하여 경화된 시편을 허용 가능한 최종 표면 마감으로 연마합니다.

마지막으로 표본을 살균하여 생물막을 성장시킵니다. 먼저, 4ml의 야간 배양 배지에 S 뮤탄의 단일 콜로니를 접종한 다음 섭씨 37도에서 16-18시간 동안 배양하여 최소 0.9의 광학 밀도를 달성합니다. 다음으로, 10 밀리리터의 생물막 성장에서 1:100의 비율로 배양액을 희석합니다.

배지는 멸균 수지 복합 시료를 멸균 12웰 플레이트로 무균 이송한 다음 각 웰에 2.5밀리리터의 희석된 배양물을 추가합니다. 구강 세정제 처리 및 대조군의 경우, 멸균 제어 웰에 배지를 2.5ml의 멸균되지 않은 접종된 생물막 성장을 추가한 다음 100RPM의 셰이커에서 미세 파라필릭 조건에서 섭씨 37도에서 생물막을 성장시킵니다. 24시간 후, 모든 웰에서 배지를 무균으로 흡인하고 각 세척 후 식염수를 흡인하는 2.5 밀리리터의 멸균 PBS로 각 웰을 두 번 세척한 다음 각 웰에 2.5 밀리리터의 신선한 생물막 성장 배지를 보충하고 바이오필름 성장이 완료된 후 48시간의 총 생물막 성장 기간에 대해 방금 설명된 대로 추가 24시간 동안 플레이트를 배양합니다. 성장 배지를 흡입한 다음 각 치료 그룹 웰에 2.5ml의 구강 세척제를 분배하고 대조군에 2.5ml의 멸균 초순수를 분배합니다.

150RPM으로 궤도 셰이커의 플레이트를 잘 교반한 다음 60초 후에 우물에서 구강 세척제와 초순수를 모두 흡입하여 생물막의 엑소 다당류 성분을 염색합니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 30분 동안 50마이크로리터의 LOR 접합체로 각 생물막을 배양합니다. 그런 다음 각 세척 후 2.5ml의 TC 완충액으로 표본을 두 번 세척하고 각 생물막의 핵산을 50마이크로리터의 cyto nine 방울로 빛으로부터 보호된 실온에서 30분 동안 염색합니다.

표본을 두 번 세척한 후 각 생물막의 단백질 성분을 빛으로부터 보호하여 실온에서 30분 동안 50마이크로리터의 Cipro red로 염색합니다. 표본을 세 번 세척한 후, 우물당 6밀리리터의 멸균 초순수가 들어 있는 6개의 웰 플레이트의 개별 웰로 옮겨 컨포칼 현미경 검사로 시각화를 용이하게 하여 처리 및 대조군의 생물막 내에서 각 구성 요소 염색의 이미지를 획득합니다. Exor conjugate stain에 의한 exo polysaccharides 검출을 위해 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경의 레이저를 다음과 같이 설정하고, cyto nine stain에 의한 핵산 검출을 위해 633 나노미터 레이저와 659 - 749 나노미터 방출 대역을 사용합니다.

488 나노 미터 레이저와 495 - 500 나노 미터 방출 대역을 사용하고, Cipro 레드 염색에 의한 단백질 검출은 543 나노 미터 레이저와 615 - 651 나노 미터 방출 대역을 사용하십시오. 그런 다음 0.9 개구수와 2.2mm의 작동 거리를 가진 63 x dipping lens를 사용합니다. 스택 간 모드에서 순차 스캔을 사용하여 400Hz에서 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 이미지를 수집하여 동일한 생물막 내 여러 염색 이미지 캡처를 최적화합니다.

컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 이미지를 분석한 후 속도 이미지 분석 소프트웨어의 3D 렌더러 메뉴 옵션을 사용하여 각 생물막 내에 중첩된 구성 요소 염색의 재구성된 3D 이미지를 생성합니다. 다음으로, 3D 이미지를 회전하여 생물막에 대한 최적의 시야를 얻습니다. 그런 다음 생물막 재구성의 스냅샷을 캡처하고 적절한 이미지 파일 형식으로 스냅샷을 내보냅니다.

마지막으로, 생물막 내에서 exo 다당류 핵산과 단백질 성분의 동시 분포에 대한 시각적 분석을 수행합니다. 재구성된 이미지에서는 ISA 3D 소프트웨어를 사용하여 바이오 부피 및 평균 바이오필름 두께와 같은 바이오필름 구조 매개변수를 계산하고, 이 표에서 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 계산된 생물막 구조 매개변수의 평균 및 표준 편차 값이 표시됩니다. 구강 세척제로 처리된 생물막의 구조적 매개변수에 대한 평균 및 표준 편차 값은 대조군의 생물막과 크게 달랐으며 빨간색 혼합 모델에서 강조 표시되어 있습니다.

통계적 분석에 따르면 Biotene PBF 구강세정제는 두 수지 복합체에서 대조군과 크게 다른 생물막 구조를 생성한 반면, 리스테린 토탈 케어 구강세정제는 두 수지 복합체에서 유의미한 차이를 생성하지 않았으며, 이는 두 가지 구강세정제 처리 후 남아 있는 세포 및 세포외 생물막 성분의 차이를 명확하게 나타냅니다. 생물막 내 엑소 다당류, 핵산 및 단백질의 동시 분포는 속도 소프트웨어를 사용하여 생성된 3D 재구성을 통해 시각화할 수 있습니다. 이 그림에서는 0.4에서 성장한 대조군 생물막의 대표적인 재구성을 보여주며, 청색이 엑소 다당류에 할당되었음을 보여줍니다.

S mutans 생물막 내에서 녹색은 핵산에 할당되고 빨간색은 단백질에 할당되었습니다. 그 사이의 공간은 물 또는 형광 표지되지 않은 다른 생물막 성분에 의해 점유될 수 있습니다. 이 그림에서는 이전 그림과 동일한 성분을 나타내는 색상으로 TPH 3 수지 복합체에서 성장한 대조군 생물막의 대표적인 재구성이 나와 있습니다.

이 절차는 의학, 치과, 지질학 및 해양 과학과 같은 다양한 분야에 적용되었습니다. 많은 기질과 생물막이 여기에 사용된 것을 대체할 수 있기 때문입니다.