MALDI-TOF 질량 분석 및 사용자 지정 데이터베이스의 사용은 고유 동굴 환경 (Kartchner 동굴, AZ, USA)에 토착 박테리아의 특성을

이 작업은 MALDI-TOF MS를 사용하여 박테리아를 신속하게 식별하기 위한 절차를 자세히 설명합니다. 식별 절차에는 스펙트럼 수집, 데이터베이스 구축 및 후속 분석이 포함됩니다. 유사성 계수 기반 방법과 바이오마커 기반 방법의 두 가지 식별 방법이 제시됩니다.

이 절차의 전반적인 목표는 질량 분석법에 MALDI를 사용하여 라이브러리 기반 박테리아 식별을 위한 자세한 절차를 개발, 적용 및 시연하는 것입니다. 이는 먼저 maloff 질량 분석기를 사용하여 박테리아의 질량 스펙트럼을 획득함으로써 달성됩니다. 이 연구에서는 부식성 환경에서 분리된 15개 박테리아의 질량 스펙트럼을 수집하여 분석된 박테리아의 피크 형태, 특징적인 패턴 또는 지문을 수집합니다.

그런 다음 이러한 질량 스펙트럼을 소프트웨어로 가져오고 모델 데이터베이스를 구성합니다. 다음으로, 모델 데이터베이스의 참조 질량 스펙트럼은 클러스터 분석, 피크 매칭 및 통계 분석을 사용하여 처리 및 분석됩니다. 마지막으로, 이 15가지 박테리아에서 무작위로 선택된 블라인드 코딩 박테리아의 질량 스펙트럼을 다시 수집하고 식별 결과를 위해 모델 데이터베이스의 참조 스펙트럼과 비교하면 유사성 계수 또는 잠재적인 바이오마커 및 피크 클래스를 기반으로 박테리아를 올바르게 식별할 수 있음을 보여줍니다.

생존 가능한 세포가 없는 단백질 추출물 1마이크로리터를 스테인리스강 maldi 타겟 플레이트에 증착하고 건조시키는 것으로 이 절차를 시작합니다. 그런 다음 건조된 단백질 추출물에 1마이크로리터의 매트릭스 용액을 바르고 건조시킵니다. 그런 다음 건조 후 1마이크로리터의 CBR 표준물질을 타겟 플레이트에 증착하고 CBR에 1마이크로리터의 매트릭스 용액을 오버레이한 다음 건조시킵니다.

마지막으로, 2마이크로리터의 매트릭스 용액을 음성 대조군으로 타겟 플레이트에 증착합니다. 질소 레이저가 장착되고 Bruker 플렉스 제어 소프트웨어를 사용하여 작동되는 다중 질량 분석기를 사용하십시오. 100샷 단위로 500개의 레이저 샷을 누적하여 포지티브 리니어 모드에서 각 질량 스펙트럼을 수집합니다.

이온 소스의 전압을 20으로, 이온 소스를 킬로볼트로, 이온 소스를 18.15킬로볼트로, 렌즈 전압을 9.05킬로볼트로 설정합니다. 이러한 매개변수는 기기에 따라 다르며 최적화가 필요할 수 있습니다. 자동 스펙트럼 평가를 위한 질량 대 충전 범위를 충전당 2킬로달톤에서 20킬로달톤까지 설정합니다.

그런 다음 최소 해상도 임계값을 100으로 설정합니다. OID 피크 검출 알고리즘을 선택합니다. 신호 대 잡음비 임계값을 2로 설정하고 최소 강도 임계값을 100으로 설정합니다.

마지막으로, 데이터베이스 설계를 위해 최대 누적을 500으로 설정합니다. 새 데이터베이스 마법사를 사용하여 bio numerics 7.1에서 새 데이터베이스를 만듭니다. 그런 다음 실험 유형 패널의 명령을 사용하여 maldi와 같은 스펙트럼 실험 유형을 만듭니다.

그런 다음 데이터베이스 디자인 패널을 사용하여 레벨을 만들고 데이터베이스 메뉴로 이동한 다음 여기에서 level add new level 명령을 사용하여 새 레벨을 추가합니다. 종 수준, 생물학적 복제 수준 및 기술 수준을 만듭니다. 원시 질량 스펙트럼을 가져옵니다.

먼저, 파일 메뉴를 탐색하고 질량 스펙트럼 내보내기 명령을 클릭하여 flex analysis를 사용하여 원시 질량 스펙트럼을 텍스트 파일로 내보냅니다. 그런 다음 원시 질량 스펙트럼을 기술 복제 수준의 데이터베이스로 가져옵니다. 원시 질량 스펙트럼을 2차 피팅 알고리즘을 사용하여 import와 resampleing을 통해 전처리합니다.

그런 다음 50점 크기의 롤링 디스크를 사용하여 기준선 빼기를 수행하고, 연속 웨이블릿 변환(CWT)을 사용하여 잡음을 계산합니다. 윈도우 크기가 20점이고 베타가 10점인 카이저 윈도우를 사용하여 스펙트럼을 평활화합니다. 그런 다음 200포인트 크기의 롤링 디스크를 사용하여 두 번째 기준선 빼기를 수행합니다.

마지막으로, 피크 크기, 피크 강도, 신호 대 잡음비를 포함하는 피크 목록과 같은 각 질량 스펙트럼의 안전한 특성 패턴을 전처리한 후 최소 신호 대 잡음비 10으로 CWT를 사용하여 피크를 검출합니다. 다음으로, 분석 메뉴의 summarized 명령을 사용하여 전처리된 스펙트럼에서 복합 질량 스펙트럼을 생성합니다. 생물학적 복제를 목표 수준으로 선택합니다. 여기.

동일한 콜로니의 10개 기술 복제의 질량 스펙트럼을 결합하여 해당 콜로니에 대한 복합 질량 스펙트럼을 생성하면 생물학적 복제 수준에서 해당 분리물에 대한 3개의 복합 질량 스펙트럼이 생성됩니다. 마지막으로, 세 가지 복합 스펙트럼을 요약하여 종 수준에서 해당 분리체에 대한 하나의 복합 스펙트럼을 만듭니다. 유사성 기반 클러스터 분석 및 다차원 스케일링을 수행하려면 색상이 있는 그룹을 만듭니다.

먼저 세 가지 생물학적 복합 질량 스펙트럼을 선택하고 그룹 메뉴에서 선택에서 새 그룹 만들기 명령을 클릭하여 해당 분리에 대한 그룹을 만듭니다. 그런 다음 이 세 가지 질량 스펙트럼에 자동으로 사용되는 색상을 디자인합니다. 클러스터링 메뉴를 탐색하고 클러스터 분석 계산 명령을 클릭하여 클러스터 분석을 수행합니다.

비교 설정의 첫 번째 페이지에서 Pearson 상관 관계를 선택하고 다른 매개변수는 기본값으로 둡니다. 2페이지에서 산술 평균이 있는 가중치가 없는 쌍 그룹 방법을 선택합니다. 그런 다음 마침을 클릭합니다.

통계량 메뉴의 multidimensional scaling 명령을 사용하여 피크 정합을 수행하는 다차원 스케일링 플롯을 얻습니다. 실험 패널에서 스펙트럼 유형 maldi를 클릭합니다. 그런 다음 레이아웃을 선택합니다.

이미지를 표시하면 스펙트럼의 개별 피크가 표시됩니다. 그런 다음 스펙트럼 메뉴에서 do peak matching 명령을 사용하여 피크 매칭을 수행하여 피크 클래스를 식별하고, 통계량 행렬을 클릭하여 양방향 클러스터링을 수행합니다. 광업. 피크 등급과 일치하는 피크의 강도는 유사성 계수 기반 방법을 사용하여 박테리아를 식별하고, 비교를 생성하고, 클러스터 분석을 위해 수행된 기술 반복 수준에서 질량 스펙트럼을 기반으로 로그램을 생성하고, 유사성 비교를 위해 로그램을 저장하기 위한 히트 맵으로 표시됩니다.

알 수 없는 질량 스펙트럼을 선택하고 분석을 클릭합니다. 선택한 항목을 식별합니다. ID 대화 상자가 나타납니다.

비교 기반 분류자 유형을 선택하고 다음을 클릭합니다. 다음 페이지에서 저장된 그램을 참조 비교로 선택하고 다음을 클릭합니다. 식별 방법으로 기본 유사성을 선택하고 다시 다음을 클릭하여 점수 매기기 방법으로 최대 유사도를 선택합니다.

각 매개 변수에 대해 적절한 임계값과 최소 차이 값을 입력하고 다음을 클릭합니다. 계산이 완료되면 결과 패널에 식별 창이 나타납니다. 알 수 없는 항목과 가장 일치하는 데이터베이스 멤버가 나열됩니다.

클러스터링 분석을 기반으로 하는 로그램은 데이터베이스의 각 격리 항목 간의 유사성을 보여줍니다. 데이터 세트에는 각 종에 대해 3개의 복합 스펙트럼이 있는 15개의 서로 다른 종의 스펙트럼이 포함되어 있습니다. 양방향 클러스터 분석은 연구자가 종 또는 종 내 균주에 대한 잠재적인 바이오마커를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

여기서 최대 강도는 색상으로 표시되며 녹색은 낮은 강도를 의미하고 빨간색은 높은 강도를 의미합니다. 마지막으로, 이러한 분석을 기반으로 미지의 질량 스펙트럼을 그램과 비교할 수 있으며 유사성 계수 기반 식별이 달성됩니다.