Name: 펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: 배우세요 SISCAPA 기술을 사용하여 복잡한 혼합물에서 펩타이드를 분리하고 정량하는 방법을. 트립신 소화, 항체 기반 농축, 질량 분석법을 활용한 이 프로토콜은 신경과학 및 생화학 연구에서 단백질 정량에 효율적인 도구를 제공합니다.

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이 작품은 NCI 임상 Proteomic 기술 평가 센터 (CPTAC) 부여 (# U24 CA126476)뿐만 아니라 엔터테인먼트 산업 재단 (EIF)과 EIF 여성 암 연구 기금에서 유방암 Biomarker 디스커버리 컨소시엄에 부여로 투자하고,되었다 켁 재단 카나리 재단, 그리고 폴 G. 알렌 가족 재단에서 후한 선물.

실험 절차 : 분석은 합성 펩티드 및 안티 펩티드 항체가 필요합니다. 선택된 펩티드 관심의 단백질 고유, 8시 사이에 22 아미노산을 포함하고, 더 알려진 사후 translational 수정을해서는 안됩니다. 메티오닌 잔류물은 일반적으로 피할 및 이염 기성 아미노산 (예 : 주식, KR, RR)이있는 펩티드는 바람직하지입니다. 이 기법에 대한, 그것은 펩타이드의 C - 말단 (예 : K 또는 R은 표시)에서 아미노산을 레이블 (13 C, 15 N) 무거운 통합, 내부 표준으로 안정 동위 원소 분류 펩티드를 사용하는 것이 일반적입니다. 다음 프로토콜은 Epitomics 주식 회사 (버링게임, CA)과 뉴 잉글랜드 펩타이드 (가드너, MA)에서 합성 펩티드에서 얻은 방지 펩티드​​ 항체를 사용하여 마우스 단백질 Osteopontin의 펩타이드 GDSLAYGLR를 측정하기 위해 개발된 분석을 설명합니다. 1) 펩티드 3 농축) 질량 분광법으로 분석 복잡한 단백질 혼합물, 2 트립신의 소화를) 프로토콜은 세 가지 주요 단계 (그림 1)으로 구성되어 있습니다. 이것은 마우스 Osteopontin 단백질과 아군 인간의 플라즈마 샘플을 시연한다. 1. 트립신 효소 소화 및 정리 <ol><li> 서부 유럽 표준시 얼음 10 μL 깔끔한 플라즈마 나누어지는를 녹여. </li><li> BCA 분석하여 총 단백질 농도를 결정하고 정지 고체를 제거하기 위해 시료를 원심 분리기. </li><li> 자사의 스토리지 관에서 1000 μL 딥웰 플레이트와 피어스 가능한 필름으로 덮어 Pipet 10 μL 나누어지는. </li><li> 각 샘플에 우레아 / 30mM dithiothreitol (DTT) (최종 농도 6M의 요소 / 20mM DTT) 신선한 9M 20 μL를 추가합니다. </li><li> 37 30 분 품어 ° C. </li><li> 각 샘플에 신선한 500 MM의 iodoacetamide (최종 IAM 50mM) 3 μL를 추가합니다. </li><li> 상온에서 어두운 곳에 30 분 알을 품다. </li><li> 100 MM 트리스 (산도 8) (~ 0.6M로 dilutes의 요소)의 257 μL를 추가합니다. </li><li> 트립신 주식 솔루션 (; 기판 비율 1시 50분 효소 1 μg / μL) 10 μL를 추가합니다. </li><li> 부화 37 ° C 야간 (12-16시간). </li><li> 깔끔한 개미의 산성 (1 %의 최종 농도) 3 μL를 추가합니다. </li><li> 안정 동위 원소 표준 (다중 분석을 수행, 일반적으로이 표준 isotopically - 분류 펩타이드 10 μL가 포함된 50-100 fmol에 관한 것이라면 여러 기준 추가) 추가합니다. </li><li> 80 % acetonitrile, 폐기 흐름 통해 0.1 % 개미 산성 500 μL 잘 오아시스 카트리지 플레이트 씻으십시오. 이 3 번 반복합니다. </li><li> 물에 0.1 % 개미 산성 500 μL를 추가하여 카트리지 판 평형과 흐름을 통해 폐기하십시오. 이 4 번 반복합니다. </li><li> 카트리지 플레이트에 다이제스트 샘플을로드하고 흐름이 매우 느리게 때문에 진공을 조정합니다. </li><li> 물에 0.1 % 개미 산성 500 μL로 씻어하고, 흐름을 통해 폐기하십시오. 이 3 번 반복합니다. </li><li> 1000 μl 깊이 잘 플레이트에 80 % acetonitrile의 0.1 % 개미 산성 2 X 500 μL를 추가하여 Elute 펩티드는 (흐름을 통해 폐기하지 않음). </li><li> 건조 (또는 speedvac) eluate를 Lyophilize. (Lyophilization이 선호하는 방법입니다) </li><li> Reconstitute 50 μL PBS + 0.03 % 챕스을 추가하여 펩티드를 건조. </li></ol> 2. 펩타이드의 면역 친 화성의 농축 <ol><li> 표준 킹피셔 96 잘 접시에 샘플을 전송합니다. </li><li> 1 μg 항체와 표적 단백질 당 1.5 μL - G 코팅 자기 구슬을 (이것은 이전뿐만 아니라 비즈에 항체를 crosslink에게 옵션으로 제공됩니다) 추가합니다. 확인 구슬이 잘 흔들어 또는 vortexing으로 중지됩니다. </li><li> 호일로 접시를 커버. </li><li> 부드러운는 구슬이 정지되도록하는 텀블링와 (과 12~16시간) 밤새 품어. </li><li> 포일 표면에서 어떤 액체를 제거하기 위해 5 초 동안 32 XG에 접시를 원심 분리기. </li><li> 호일 커버를 제거합니다. </li><li> 구슬의 세탁과 용출은 수동 또는 자동 방식으로 수행할 수 있습니다. 이 절차는 킹피셔 플랫폼에서 자동으로 단계를 설명합니다. </li><li> 200 μL PBS + 0.03 % 챕스 (세척 당 일분)와 비즈에게 2 번 씻으십시오. </li><li> PBS 200 μL 1시 10분 희석 + 0.03 % 챕스 (1 분)와 비즈 1 시간을 씻으십시오. </li><li> 펩티드 5 % 초산 + 0.03 % 챕스 25 UL에 eluted 있습니다. </li><li> 자석에 용출 플레이트를 삽입하고 남은 비즈를 전송하지를 돌보는 96 잘 접시에 eluate을 전송하기만하면됩니다. </li><li> 실링 매트와 접시를 커버. </li><li> eluate가 포함된 플레이트는 분석을 위해 세 quadrapole 질량 분석기로 전달됩니다. </li></ol> 3. 다중 반응 모니터링에 의해 분석 - 질량 분광법 <ol><li> SRM / MRM 분석을위한 전환은 0.5 μL / 분 질량 분석기에 30% acetonitrile/0.1 % 개미 산성에서 펩타이드 표준의 microliter 솔루션 당 1 picomole을 일으키는 선정 및 최적화할 수 있습니다. 일단 안정 스프레이를 얻을 수 있습니다, MS / MS 스펙트럼을 수집합니다. </li><li> 전환은 thre을 식별하여 MS / MS 스펙트럼에서 선택됩니다전자 약간의 노이즈가 스펙트럼의 영역에 풍부한 조각 이온. 번식 - 충전 펩타이드 이온 들어, Y 이온 조각 M /에서 감지 Z&gt; 전구체 M / z는 일반적으로 SRM / MRM 분석 개발을위한 최선입니다. 그림 2 보여줍니다 476.3 MS / MS 스펙트럼 선택한 전환 이온&gt; 508.3, 579.3 , 펩타이드 GDSLAYGLR에 대한 692.4 (무거운 안정 동위 원소 표준 481.3에 대한 전환이&gt; 518.3, 589.3, 702.4 표시되지 않습니다.) </li><li> 사용되는 질량 분석계의 제조 업체 및 모델에 따라 각 전환에 대해 최적화할 수 있습니다 여러 개의 매개 변수가 없습니다. 여기, 우리는 충돌 에너지를 올렸 및 신호의 수준을 모니터링하여 선택한 각 전환의 충돌 에너지를 최적화. 25 충돌 에너지는 각 전환에 대해 사용되었습니다. </li><li> 다음과 같이 간단히, SRM / MRM 분석을위한 일반적인 구성은 다음과 같습니다 : 모바일 단계 (A) 0.1 % 개미 산성, (B) 90 % Acetonitrile / 0.1 % 개미 산성, 0.3 X 5mm C18 트랩 열, 75 μm의 ID를 X 15cm C18 분석 열 (Reprosil - PUR C18 AQ, 120 A · 기공). 주사 량은 10 μL이며, 샘플은 총 유량에서 3 %의 B에서 5 분 장전 3 μL / 분 및 3 선형 그라데이션으로 eluted - 300에서 45 % B - 10 분 400 NL / 분. 4000 QTRAP (ABSCIEX, 포스터 시티, CA)에 조건이 스프레이 전압 2.3kV, 이온 소스 온도 150 ° C했다, 12의 GS1, 그리고 커튼 가스 15. </li><li> 샘플은 샘플의 10 μL를 주입하여 SRM / MRM 의해 분석됩니다. 피크 영역은 프로그램 스카이 라인을 사용하여 빛과 무거운 펩티드를 위해 통합되어 있습니다. 14이 경우, 배경 잡음 무료입니다 가장 풍부한 전환을 사용하여 각 샘플에 레이블이 지정되지 않은 / 레이블 펩타이드의 최고 지역 비율 (PAR), Y5 전환을 계산 (가벼운 펩티드 476.3&gt; 579.3, 무거운 표준 펩티드 481.3&gt; 589.3). </li></ol> 4. 대표 결과 : 측정된 피크 면적 비율 (아군 무거운 isotopically - 표시 펩타이드에 가벼운 내생 펩타이드의 상대)는 대상 펩타이드의 양적 측정을 제공합니다. 그림 3 SISCAPA - 풍부한 샘플의 빛과 무거운 펩티드의 예제 크로마토 그램을 보여줍니다. 동시에 여러 전환에 elute 가볍고 무거운 펩티드가 신원을 확인하여 각 펩타이드에 대해 모니터링할 수 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> SISCAPA 과정을 그림 1. 도식 개요. 복잡한 단백질 혼합물은 펩티드로 소화합니다. 타겟 펩티드 analytes는 (내생 analyte과 아군 안정 동위 원소 - 라벨이 내부 표준) 단백질 G - 코팅 자성 입자에 고정화 방지 펩티드​​ 항체를 사용하여 풍부하게하고 있습니다. 절연 다음, 대상 펩티드는 자성 입자에서 eluted되고 내부 표준에 상대적으로 quantitation에 대한 질량 분광법으로 분석했다. <img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. SRM / MRM 변환 세 조각의 선택을 보여주는 펩타이드 GDSLAYGLR의 MS / MS 스펙트럼. <img src="/files/ftp_upload/2812/2812fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 가벼운 펩티드 analyte의 최고 프로필 (빨간색)와 무거운 안정 동위 원소 - 라벨 내부 표준 (파란색)을 보여주는 예제 chromatograms. 그들은 크로마 토그래피 시스템에서 elute으로 가벼운 펩티드 (476.3&gt; 579.3)와 라벨 무거운 동위 원소에서 안정 Y5 전환 Chromatograms는 표준 (481.3&gt; 589.3) 시간이 지남에 따라 꾸몄다 있습니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

로 설명한 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 구슬이 부화 기간 동안 잘 혼합 남아 보장합니다. 구슬이 잘 / 유리병의 바닥에 정착 수 있도록하는 것은 다양성을 증가 발생합니다. 또한 중요하기 잠복기 다음 잘 / 유리병의 상단에 남아있을 수있는 액체 다운 스핀. 재현성 트립신의 소화도 중요합니다. 그러나, 그것은 소화의 가능성이 다른 방법이 대상 단백질의 주어진 집합에 대한 최적화할 수 있습니다 무료로 항체의 15 용리가의 검색을 방해하지 않는다;. 소화에 대한 절차는 SISCAPA와 함께 우리의 연구실에 광범위하게 활용되어 여기에서 설명한 항체가 나중에 펩티드보다 열 또는 elutes에서 제외되어 있지만 항체가 이전에 대규모 실험 또는 무료 항체 경우 친화 농축에 단백질 G 비즈에 가교 될 수 있기 때문에 가능성이 펩티드는 문제가된다. 우리는 또한 잔여 구슬이나 입자를 제거하는 예제 autosampler에 접시뿐만 아니라 흐름의 반대 방향으로 트랩 열을 씻는 아래 자석을 (로딩에 비해) 장소에 유용하게 나타났습니다. 설명 마그네틱 비드 접근뿐만 아니라, 기술도 칼럼 형식 (즉, 친화 크로마 토그래피)에 적용할 수 있습니다. 12, 16 사용자가 전체 프로토콜과 함께 편안한되면, 기술은 또한 전체적인 분석을 강화 몇 가지 수정 의무가 있습니다. 우선 11, 그것이 강화 단계 (즉 멀티플렉싱)에 항체를 결합하여 하나의 분석에서 여러 analytes를 분석 할 수 있습니다. 질량 분석계는 동시에 analytes 다수의 분석이 가능합니다. 둘째, 원래의 샘플의 볼륨을 증가하는 것은 분석의 감도를 향상시킵니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 자료 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 1000ul 딥 잘 96 - 웰 플레이트 </td><td> Eppendorf </td><td> 951032786 </td></tr><tr><td> 오아시스 HLB 카트리지 CC 1 판, 9 월 - 박, 40 MG 96 웰 플레이트 </td><td> 워터스 </td><td> 186003966 </td></tr><tr><td> 킹피셔 96 웰 플레이트 </td><td> 써모 피셔 사이 언티픽 </td><td> 97002540 </td></tr><tr><td> 96 음, 흰 벽에 접시를 지우고 </td><td> 바이오 래드 </td><td> HSP9601 </td></tr><tr><td> 96 잘 접시 커버 호일 </td><td> Excelscientific </td><td> 12-169 </td></tr><tr><td> 96 잘 접시 Axymat 씰링 매트 </td><td> Axygen </td><td> 521-01-151 </td></tr><tr><td> X 피어스 필름 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> Z722502 </td></tr><tr><td> PCR 자석의 머리와 킹피셔 자석 구슬 프로세서 </td><td> 써모 피셔 사이 언티픽 </td><td> HSP 9601 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 자료 <table border="1"><tbody><tr><th> 자료 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 요소 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> U6031 </td><td></td></tr><tr><td> Trizma베이스 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> 찌르다 </td><td> 20,291 </td><td> &quot;dithiothreitol 노 달다&quot; </td></tr><tr><td> Iodoacetamide (IAM) </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> I1149 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 골드 </td><td> Promega </td><td> V5280 </td><td></td></tr><tr><td> 단백질 G 자석 구슬, 2.8um </td><td> Invitrogen </td><td> 10004D </td><td></td></tr><tr><td> 인산 버퍼 호수 (PBS) </td><td> 써모 피셔 사이 언티픽 </td><td> L5401 </td><td></td></tr><tr><td> 챕스 </td><td> 써모 피셔 사이 언티픽 </td><td> 28,300 </td><td></td></tr><tr><td> 개미 산성 </td><td> EMD </td><td> 11,670 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitrile </td><td> 써모 피셔 사이 언티픽 </td><td> A998 - 1 </td><td></td></tr><tr><td> 아세트산 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> 242853 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 2 : 시약 <table border="1"><tbody><tr><th> 용액 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 100 MM 트리스의 산도 8 </td><td></td></tr><tr><td> 9 M 100 MM 트리스 (산도 8)의 요소 / 30 MM의 DTT </td><td> 매번 신선한 준비를해야합니다 </td></tr><tr><td> 100 MM 500 MM 트리스의 IAM (산도 8) </td><td> 매번 신선한 준비를해야합니다 </td></tr><tr><td> 100 MM 트리스의 산도 8 트립신 1mg/mL </td><td></td></tr><tr><td> 100 MM 트리스의 산도 8 트립신 억제제 1mg/mL </td><td></td></tr><tr><td> 안정 동위 원소 표준 mastermix </td><td></td></tr><tr><td> 안티 펩티드 항체 mastermix </td><td></td></tr></tbody></table> 표 3 : 솔루션 준비에

펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

단백질을 측정 양적 assays에 대한 큰 필요가있다. 크게 quantitation의 황금 표준으로 간주 전통 샌드위치 immunoassays은, 높은 비용, 긴 리드 타임과 관련된, 그리고 단점 (예 : heterophilic 항체, autoantibody 간섭 &#39;후크 효과&#39;)이 따른 다네입니다. 한 대체 기술 친화 농축집니다 양적 질량 분광법과 결합 펩티드의 일반적 SISCAPA (안티 펩타이드 항체에 의해 안정 동위 원소 표준 및 캡처)이라고도합니다.이 기법 2 다중 / 선택된 반응 모니터링 질량 분석법에 의해 안정 동위 원소 희석 및 검출과 펩티드의 선호도 강화가 ( SRM / MRM - MS)는 각각의 단백질에 대한 surrogates으로 펩티드의 양적 측정을 제공합니다. SRM / MRM - MS 잘 작은 분자 3, 4의 정확한 quantitation을 위해 설립되고 최근에는 플라즈마와 세포 lysates의 단백질의 농도를 측정하는 맞게되었습니다. 단백질의 quantitation를 달성하기 위해 5-7이 큰 분자로 소화 같은 트립신과 같은 효소를 사용하여 구성 요소 펩티드. 누구의 순서대로 해당 종의 대상 단백질 (예 : &quot;proteotypic&quot;펩티드)에 독특한 하나 이상 선택 펩티드는 다음 방지 펩티드​​ 항체를 사용하여 샘​​플에서 농축하여 시료의 단백질 농도에 대한 정량 stoichiometric의 surrogates로 측정됩니다. 따라서, 안정 동위 원소 희석 (SID) 방법 (즉, 아군 인 펩타이드 표준 표시 안정 동위 원소), SRM / MRM 복잡한 생물 학적 매트릭스의 단백질 양을 정함 대한 surrogates로 proteotypic 펩티드의 농도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.을 결합 assays은 전통적인 immunoassays에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 시약은 생성하기 위해 상대적으로 저렴, analyte에 대한 특이성이 우수합니다, assays가 높은 멀티 플렉스 수, 농축은 깔끔한 플라즈마 (더 고갈 필요 없음)에서 수행하고, 기술은 단백질이나 수정의 다양한 의무가있다 할 수있다 자석 구슬 플랫폼에 맞게 본 동영상에 대한 관심. 8-13의 우리는 기본적인 프로토콜을 보여줍니다.

안정 동위 원소 표준 및 안티 펩타이드 항체 (SISCAPA) 각각의 단백질에 대한 surrogates으로 펩티드의 양적 측정을 제공하기 위해 안정 동위 원소 희석 질량 분석법 (MRM - MS)과 펩티드의 커플 선호도 농축하여 캡처합니다. 여기서 우리는 부분적으로 자동화된 형식으로 자기 입자를 사용하여 프로토콜을 설명합니다.

단백질 측정을 위한 정량 분석법에 대한 수요가 매우 높습니다. 일반적으로 ...의 표준 방법으로 간주되는 전통적인 샌드위치 면역 분석법은...

다음 절차의 전반적인 목표는 복잡한 혼합물 내에서 각 단백질의 대리물로 작용하는 펩타이드를 분리하고 정량하는 것입니다. 우선, trypsin과 같은 효소를 사용하여 혼합물 내의 거대 단백질을 구성 펩타이드로 소화시킵니다. 그 다음, 표적 펩타이드 분석물과 스파이킹된 안정 동위원소 표지 내부 표준물을 항-펩타이드 항체를 사용하여 농축하며, 분리 후에는 단백질 G가 코팅된 자기 입자에 고정시킵니다.표적 펩타이드를 자성 입자로부터 용출시킨 후, 질량 분석법을 통해 내부 표준물질 대비 정량을 분석합니다. 기존의 전통적인 면역 분석법과 같은 방법들에 비해 이 기술의 주요 장점은 다수의 분석법을 구축할 때 더 빠르고 비용 효율적이라는 점입니다. 또한 성공률이 높고 다중 분석(multiplexing)이 용이하며, 본 절차를 통해 그 과정이 상세히 제시될 것입니다.실험실 기술자가 젖은 얼음 위에 10 µL의 혈장 용액을 준비합니다. 샘플을 1000 µL 딥웰 플레이트로 옮기고 파라필름으로 덮어 단백질을 변성시킵니다. 각 샘플에 20 µL의 신선한 9 M urea와 30 mM DTT를 첨가하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 각 샘플에 3 µL의 신선한 500 mM iodoacetamide를 첨가하고 상온의 암실에서 30분 동안 배양합니다. 이제 100 mM tris pH 8을 사용하여 urea 농도를 0.6 M로 희석하고, 효소 대 기질 비율을 1:50으로 맞추기 위해 1 µg/µL trypsin 표준 용액 10 µL를 첨가합니다.순수 formic acid 3 µL를 최종 농도 1%가 되도록 첨가하여 37 °C에서 하룻밤 동안 반응시킨 후, 안정 동위원소 표준물질 또는 여러 표준물질을 계속해서 첨가합니다. 멀티플렉스 분석을 수행하는 경우, Oasis 카트리지 플레이트를 80% ACE nitrile에 녹인 0.1% formic acid 500 µL로 충분히 세척하고 통과액은 버립니다. 그런 다음, 물에 녹인 0.1% formic acid 500 µL를 첨가하여 카트리지 플레이트를 평형화하고 통과액을 버립니다.소화된 샘플을 카트리지 플레이트에 로딩하고, 흐름이 매우 느려지도록 진공 상태를 조절합니다. 물에 희석한 0.1% formic acid 500 µL로 3회 세척한 후 통과액은 버립니다. 80% acetonitrile에 희석한 0.1% formic acid 500 µL로 펩타이드를 2회 용출합니다. 그 후 용출액을 동결 건조하거나 속건 건조하여 완전히 말린 다음, 0.03% Chaps가 첨가된 PBS 50 µL에 건조된 펩타이드를 재용해합니다. 샘플을 표준 Kingfisher 96웰 플레이트로 옮기고, 타겟당 1 µg의 항체와 1.5 µL의 Protein G 코팅 자성 비드를 추가합니다. 비드를 추가하기 전에 볼텍싱합니다.비드가 충분히 부유되었는지 확인하십시오. 플레이트를 호일로 덮고 완만한 회전식 원심분리기를 사용하여 하룻밤 동안 배양하십시오. 플레이트를 400 RPM으로 10초 동안 원심분리하여 호일 표면에 묻은 액체를 제거하십시오.호일 덮개를 제거합니다. 시료 조작은 자동화된 Kingfisher 플랫폼에서 수행합니다. 0.03% CHAPS가 포함된 PBS 200 µL로 비드를 2회 세척하고, 0.03% CHAPS가 포함된 PBS를 1:10으로 희석한 용액 200 µL로 1회 세척합니다. 이제 0.03% CHAPS가 포함된 5% acetic acid 25 µL를 사용하여 펩타이드를 용출합니다.용출 플레이트를 자석 위에 놓고, 남은 비드를 옮기지 않도록 주의하며 용출액을 96-웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 실링 매트로 덮은 후, 용출액이 담긴 이 플레이트를 분석을 위해 삼중 또는 사중 질량분석기로 전달합니다. MRM 방법은 관심 펩타이드의 탠덤 질량 스펙트럼을 얻은 다음, 최적의 전이 프래그먼트 이온을 선택하고 최적화함으로써 구축됩니다.일반적으로 MRM 분석을 위한 구성에는 두 가지 이동상을 사용하는 C 18 트랩 및 분석 컬럼이 사용됩니다. 샘플 10 µL를 로딩하고 선형 기울기로 용출합니다. 경쇄 및 중쇄 펩타이드의 피크 면적을 적분하고, 각 샘플에서 비표지 펩타이드 대비 표지 펩타이드의 피크 면적 비율을 계산합니다.경쇄 및 중쇄 펩타이드는 동시에 용출되며, 각 펩타이드에 대해 여러 전이를 모니터링할 수 있습니다. 정체성을 확인하기 위해 내인성 펩타이드의 피크 면적을 내부 표준물질의 면적과 비교하여 측정함으로써 표적 펩타이드의 정량적 수치를 제공합니다. 이 영상을 시청한 후에는 귀하의 실험실에서 이 기술을 구현하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술은 관심 있는 모든 단백질을 정량화하는 데 사용할 수 있어 생물학 연구의 광범위한 응용 분야에 적합합니다.

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질량 분석법 (APMS)와 함께 태그 단백질의 친 화성 정화는 단백질 상호 작용 네트워크의 체계적인지도 및 생물학적 과정의 기계론의 기초를 조사하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 세균 용으로 개발 된 최적화 된 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) APMS 절차를...

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이 비디오에서는 펩타이드 혼합물에서 포스호펩타이드의 항체 기반 면역침전을 보여줍니다. 농축된 인산펩타이드는 진공 농축되어 다운스트림 분석을 위해 보관됩니다.

인산펩타이드 농축: 복합 펩타이드 혼합물에서 특정 인산화 펩타이드를 분리하는 항체 기반 면역침전 기법

환원 디메틸 화 (REDI 라벨)에 의해 펩티드의 안정 동위 원소 표지 정확한 질량 분석 기반의 정량 프로테오믹스에 대한 신속하고 저렴한 전략이다. 여기에서 우리는 거의 모든 샘플 유형에 적용 할 수있는 한 Redi 방식을 사용하여 단백질의 혼합물의 제조 및 분석을위한 강력한 방법을 보여준다.

안정 동위 원소 라벨링 환원성 디메틸 화를 사용하여 정량 프로테오믹스

이 프로토콜은 선택된 반응 모니터링을 사용하여 복잡한 생물학적 샘플 내 표적 단백질의 절대 정량화 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 마우스 대식세포 화학주성 신호전달 경로의 단백질을 정확하게 정량화하는 데 사용되었습니다. 표적 펩타이드 선택, 분석 개발, 정성적 및 정량적 분석이 자세히 설명되어 있습니다.

절대 단백질 정량 질량 분석을 모니터링 선정 반응

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

자동된 면역-MALDI (iMALDI) 기술을 사용 하 여 복잡 한 생물 학적 체액에서 단백질 정량화에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

펩 티 드 및 단백질 정량화를 사용 하 여 자동 면역-MALDI (iMALDI)

우리는 정확 하 게 액체 크로마토그래피 고해상도 질량 분석기에 인터페이스와 isobaric 라벨, 광범위 한 분류, 생물 정보학 도구, 그리고 품질 관리 단계에에서는 단백질을 quantitate 프로토콜을 제시.

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

이 프로토콜에는 전립선 암 세포 선 또는 단백질 질량 분석 기반 을 통해 phosphoproteome의 분석에 대 한 조직에서 phosphopeptides을 풍부 하 게 추출 하는 절차를 설명 합니다.

전립선 암에 있는 Phosphoproteome를 조사 하기 위해 양적 라벨 무료 질량 분석으로 결합 된 Phosphopeptide 농축

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

이 워크플로우에서는 정량적 글로벌 프로테오믹스 분석을 위해 동시에 여러 단백질 번역 후 변형(PTM)의 시간 및 비용 효율적인 농축 성능을 설명합니다. 이 프로토콜은 여러 개의 공액 항체를 사용한 펩타이드 수준 PTM 농축을 활용한 다음 데이터 독립적 수집 질량 분석 분석을 통해 PTM 누토크에 대한 생물학적 통찰력을 얻습니다.

정량화 및 사이트 현지화를 위한 두 가지 번역 후 수정의 동시 선호도 강화

설명된 프로토콜은 라벨 기반 및 라벨 자유 양수의 두 가지 접근법을 사용하여 조직 샘플의 최적화된 정량 적 프로테오믹스 분석을 제공합니다. 라벨 기반 접근법은 단백질의 보다 정확한 양을 얻을 수 있는 장점이 있으며, 라벨없는 접근법은 비용 효율적이며 코호트의 수백 가지 샘플을 분석하는 데 사용됩니다.

조직 샘플의 질량 분광계 기반 산탄총 프로테오믹스의 포괄적인 워크플로우

배우세요 SISCAPA 기술을 사용하여 복잡한 혼합물에서 펩타이드를 분리하고 정량하는 방법을. 트립신 소화, 항체 기반 농축, 질량 분석법을 활용한 이 프로토콜은 신경과학 및 생화학 연구에서 단백질 정량에 효율적인 도구를 제공합니다.

펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

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