펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께
July 31st, 2011
안정 동위 원소 표준 및 안티 펩타이드 항체 (SISCAPA) 각각의 단백질에 대한 surrogates으로 펩티드의 양적 측정을 제공하기 위해 안정 동위 원소 희석 질량 분석법 (MRM - MS)과 펩티드의 커플 선호도 농축하여 캡처합니다. 여기서 우리는 부분적으로 자동화된 형식으로 자기 입자를 사용하여 프로토콜을 설명합니다.
다음 절차의 전반적인 목표는 각각의 단백질에 대한 대용품 역할을 하는 복잡한 혼합물에서 펩타이드를 분리하고 정량화하는 것입니다. 첫째, 혼합물 내의 큰 단백질은 트립신과 같은 효소를 사용하여 구성 펩타이드로 소화됩니다. 그런 다음 표적 펩타이드 분석물과 내부 표준물질로 표시된 스파이크 안정 동위원소를 분리 후 단백질 G 코딩 자성 입자에 고정하여 안티프 펩타이드 항체를 사용하여 농축합니다.
표적 펩타이드는 자성 입자에서 암시되고 내부 표준물질과 관련된 정량화를 위해 질량 분석법으로 분석됩니다. 기존 면역 분석법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 많은 수의 분석을 구축하는 데 더 빠르고 비용 효율적이라는 것입니다. 성공률이 높고 쉽게 다중화되어 절차가 배치될 것임을 보여줍니다.
실험실의 기술자가 10마이크로리터 플라즈마 Eloqua를 젖은 얼음 위에 올려놓고 있습니다. 샘플을 1000 마이크로 리터 깊이의 웰 플레이트로 옮기고 비유 필름으로 덮어 20 마이크로 리터의 신선한 9 몰 요소 30 밀리 몰 DTT의 단백질을 변성시키고 30 분 동안 배양합니다 섭씨 37도에서 3 마이크로 리터의 신선한 500 밀리 몰 I oto 아세트 아미드를 각 샘플에 추가하고 실온에서 어둠 속에서 30 분 동안 배양합니다. 이제 요소를 100 밀리 몰 트리스 pH 8로 0.6 몰로 희석하고 1 대 50 효소 대 기질 비율에 대한 1 마이크로 리터 트립 및 저장 용액 당 1 마이크로 그램의 10 마이크로 리터를 추가합니다.
섭씨 37도에서 하룻밤 동안 3마이크로리터의 깔끔한 포름산에서 최종 농도 1%까지 반응을 배양한 후 안정 동위원소 표준 또는 다중 표준을 계속 첨가합니다. 멀티플렉스 분석을 수행하는 경우, 80% ACE 니트릴에 0.1%포름산 500마이크로리터를 넣고 Oasis 카트리지 플레이트를 잘 세척하여 흐름을 버리십시오. 그런 다음 물에 500마이크로리터의 0.1% 포름산을 첨가하여 카트리지 플레이트를 평형을 이루고 흐름을 버립니다.
다이제스트 샘플을 카트리지 플레이트에 로드하고 흐름이 매우 느려지도록 진공을 조정합니다. 물에 0.1% 포름산 500마이크로리터로 3회 세척하고 흐름을 버리고 80% 아세토 시험에서 0.1% 포름산 500마이크로리터로 펩타이드를 두 번 용출한 다음 동결건조하거나 용출액을 건조로 되돌리고 건조된 펩타이드를 50마이크로리터의 PBS와 0.03%Chaps로 재구성하여 샘플을 표준 Kingfisher 96 웰 플레이트로 옮기고 항체 1마이크로그램과 단백질 G 1.5마이크로리터를 추가합니다. 타겟당 코드화된 마그네틱 비드. 추가하기 전에 구슬을 소용돌이
치십시오.구슬이 잘 매달려 있는지 확인합니다. 접시를 호일로 덮고 부드러운 텀블링 원심 분리기로 밤새 배양합니다. 플레이트를 400RPM에서 10초 동안 가열하여 호일 표면에서 액체를 제거합니다.
호일 덮개를 제거합니다. 샘플 조작은 Kingfisher 플랫폼의 자동화된 물총새 플랫폼에서 발생합니다. PBS의 200 마이크로 리터와 0.03 % chaps로 두 번 구슬을 세척하고 PBS의 1-10 희석 플러스 0.03 % Chaps의 200 마이크로 리터로 한 번 펩티드를 피하십시오 이제 25 마이크로 리터의 5 % 아세트산과 0.03 % chaps로 펩타이
드를 피하십시오.용출 플레이트를 자석에 놓고 용리액을 96웰 플레이트로 옮기되 남은 비드가 옮겨지지 않도록 주의합니다. 플레이트를 천장 매트로 덮고 용리액이 포함된 이 플레이트를 분석을 위해 삼중, 4배 질량 분석기로 전달합니다. MRM 분석법은 최상의 전이 단편 이온을 선택하고 최적화하는 것보다 관심 펩타이드의 탠덤 질량 스펙트럼을 얻어 구성됩니다.
일반적으로 MRM 분석을 위한 구성에서는 두 개의 이동상이 있는 C 18 트랩 및 분석 컬럼을 사용합니다. 10마이크로리터의 시료를 로드하고 선형 그래디언트로 용리합니다. 경펩타이드와 중펩타이드에 대한 피크 면적을 적분하고 각 샘플에서 라벨링되지 않은 펩타이드와 라벨링되지 않은 펩타이드의 피크 면적 비율을 계산합니다.
가벼운 펩타이드와 무거운 펩타이드는 동시에 용리되며 각 펩타이드에 대해 여러 전이를 모니터링할 수 있습니다.정체를 확인하기 위해 내인성 펩타이드의 피크 면적을 내부 표준물질의 면적에 대해 측정하여 표적 펩타이드의 정량적 측정을 제공합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 실험실에서 이 기술을 구현하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 관심 있는 모든 단백질을 정량화하는 데 사용할 수 있으므로 생물학 연구의 광범위한 응용 분야에 적합합니다.
개요
이 기사는 펩티드의 친화성 농축과 정량적 펩티드 측정을 위한 안정 동위원소 희석 질량 분석법을 결합하는 Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) 기술을 설명합니다. 이 프로토콜은 효율성을 향상시키기 위해 부분 자동화된 형식으로 자기 입자를 사용합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생화학
- 질량 분석법
배경
- SISCAPA는 단백질의 대체물로 펩티드의 정량화를 가능하게 합니다.
- 이 방법은 전통적인 면역 분석법보다 속도와 비용 효율성이 좋습니다.
- 다중 분석에 적합하여 여러 펩티드를 동시에 분석할 수 있습니다.
- 이 기술은 단백질을 펩티드로 소화하고 특정 항체를 사용하여 농축합니다.
연구 목적
- 복잡한 혼합물에서 펩티드를 분리하고 정량화합니다.
- 펩티드 분석의 효율성을 향상시키는 프로토콜을 보여줍니다.
- 생물학 연구에 광범위하게 적용할 수 있는 방법을 제공합니다.
사용된 방법
- 트립신을 사용하여 단백질을 펩티드로 소화합니다.
- 자기 입자에 항펩티드 항체로 표적 펩티드를 농축합니다.
- 펩티드의 정량화를 위한 질량 분석법 분석합니다.
- Kingfisher 플랫폼을 사용하여 부분 자동화된 워크플로우를 구현합니다.
주요 결과
- SISCAPA 방법은 펩티드 정량화에 높은 성공률을 제공합니다.
- 효과적으로 다중 분석을 할 수 있는 능력을 보여줍니다.
- 가벼운 펩티드와 무거운 펩티드의 비율을 비교하여 정량적 측정을 달성합니다.
- 이 기술은 다양한 관심 단백질에 적용 가능합니다.
결론
- SISCAPA는 생물학적 샘플에서 펩티드 정량화를 위한 강력한 방법입니다.
- 이 프로토콜은 다양한 응용 분야에서 실험실에서 구현할 수 있습니다.
- 전통적인 방법에 비해 장점을 제공하여 연구에서 귀중한 도구가 됩니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Quantitative protein measurement remains a critical bottleneck in target validation and biomarker discovery, where traditional immunoassays face cost, lead time, and interference limitations. SISCAPA offers a scalable, multiplexable alternative that enhances predictive confidence in early discovery by providing stoichiometric, antibody-independent quantification of proteotypic peptides. This supports risk-adjusted portfolio decisions and translational continuity from hypothesis to preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise quantification of target proteins in complex matrices.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by using proteotypic peptides as stoichiometric surrogates for protein concentration.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by delivering reproducible, multiplexable data for target prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated peptide enrichment workflows compatible with downstream SRM/MRM-MS quantification.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through stable isotope internal standards and magnetic bead enrichment.
- Scalability: Facilitates multiplexed assay development for parallel target evaluation without plasma depletion.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing quantitative peptide readouts translatable across sample types.
- Mechanistic De-risking: Enables biomarker alignment through specific, interference-resistant peptide detection in disease-relevant systems.
- Predictive Confidence: Supports risk-adjusted advancement decisions via quantitative, antibody-free protein measurement.
Pipeline & Workflow Integration
SISCAPA integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification, enabling quantitative measurement of proteins as a foundation for assay development and screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying target proteins in native biological contexts.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible peptide enrichment and quantitative MS readouts for compound evaluation.
- Analytics: Provides light/heavy peptide peak area ratios as quantitative outputs for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Enables continuity from discovery to preclinical validation through standardized peptide quantification.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for multiplexed target quantification across projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, antibody-based enrichment, and mass spectrometry.
- Depends on access to SRM/MRM-capable mass spectrometers and magnetic bead handling platforms.
- Necessitates cross-team standardization of antibody validation and peptide selection criteria.
- Involves adaptation considerations for different sample types, including plasma, cell lysates, and tissue extracts.
- Involves practical limitations related to antibody availability for specific peptides and trypsin digestion efficiency.
