의 비 용해성 세포 외 유출을 시각화 크립토 콕 쿠스 네오 포르 디지털 광학 현미경을 사용하여 대 식세포에서

이 절차의 전반적인 목표는 원발성 골수 뉴런 대식세포에서 크립토코커스 네오포먼(cryptococcus neoformans)의 비지극성 외포작용(non litic exocytosis)을 시각화하는 것입니다. 이는 먼저 활성화된 신경 대식세포를 도금하고 곰팡이 세포로 감염시켜 Xeomin의 식세포작용 및 내재화를 가능하게 함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 세포 외 진균 세포를 제거하여 감염된 대식세포와 감염되지 않은 대식세포의 투명한 단층을 확보하는 것입니다.

다음으로, 대식세포는 이산화탄소 온도 조절 챔버에서 배양하고 24시간 동안 기록하여 비지질성 외포작용 및 기타 상호 작용 사례를 포착합니다. 마지막 단계는 24시간 동안 만들어진 모든 프레임을 압축하여 동영상을 만드는 것입니다. 궁극적으로, 디지털 광학 현미경을 사용한 대식세포 시각화는 대식세포가 24시간 감염 기간 동안 겪는 다양한 비지방성 외포작용 유형을 관찰하는 데 사용됩니다.

이 방법은 세포 이벤트의 타이밍 및 정량화와 같은 숙주 병원체 상호 작용 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.실험 전날, sbarro 한천 플레이트에서 자란 개별 선임 감독의 군체를 하나 선택하여 접종합니다.sbarro 육수 10ml. 서면 프로토콜에 설명된 대로 쥐를 안락사한 후 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 250RPM의 속도로 흔들면서 배양액이 자라도록 합니다.

70%에틸알코올로 전신을 살균합니다. 대퇴골과 경골을 모두 제거하고 뼈를 멸균 듀오, 변형된 독수리 배지 또는 DMEM에 넣습니다. 그런 다음 뼈가 완전히 깨끗해질 때까지 섬세한 물티슈를 사용하여 여분의 조직과 근육을 제거합니다.

70% 에틸 알코올이 함유된 페트리 접시에 손상되지 않은 뼈만 넣고 3분 동안 배양하여 관련 미생물을 죽입니다. 뼈를 제거하고 멸균 DMEM이 있는 페트리 접시에 넣습니다. 다음으로 뼈의 끝을 조심스럽게 자릅니다.

얼음 위에 올려 놓은 MT 50 밀리리터 원뿔형 튜브 위에 뼈를 대고 25 게이지 바늘을 사용하여 각 뼈를 통해 10 밀리리터의 차가운 DMEM을 조심스럽게 씻어냅니다. 그런 다음 수집된 세포 현탁액을 실온에서 650회 G.이 원심분리하는 동안 준비 및 여과하여 골수 대식세포 공급 매체를 살균하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 원심분리합니다. 다음으로, 결과 팔레트를 10ml의 공급 매체로 다시 현탁시킵니다.

70마이크로미터 세포 여과기에 세포 현탁액을 통과시켜 세포 덩어리를 파괴하고 큰 파편을 제거합니다. 그런 다음 1ml의 스트레인 세포 현탁액을 10ml의 공급 매체, 조직 배양용으로 지정된 페트리 접시에 플레이트합니다. 세포가 섭씨 37도에서 10% 이산화탄소로 7일 동안 부착되도록 합니다.

실험 전날 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 공급 매체를 변경합니다. 공급 매체를 제거하여 플레이트에서 대식세포를 분리하고 5-10분 동안 세포를 배양한 후 플레이트에 5ml의 부드러운 세포 스트리핑 시약을 추가합니다. 섭씨 37도에서 부드러운 피펫팅으로 대식세포를 제거합니다.

650배 G에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화한 후 1밀리리터의 공급 매체에서 펠릿을 구부립니다. 1에서 20 사이의 희석액을 사용하여 14mm 유리 바닥을 사용하여 10마이크로리터의 세포 현탁액을 혈액 세포분석기에 피펫팅하여 대식세포의 농도를 계산합니다. 페트리 접시는 10의 10에서 5번째 대식 세포의 농도를 최대 200 마이크로 리터를 보유하는 내부 우물에 직접 배치합니다.

이 부피를 초과하지 않도록 주의하십시오. 접시를 섭씨 37도의 인큐베이터에 1시간 동안 넣어 세포가 유리 페트리 접시에 부착되도록 합니다. 그런 다음 밀리리터당 1밀리그램의 리포다당류와 인터페론 감마가 보충된 1-2밀리리터의 공급 매체를 추가합니다.

밀리리터당 500단위에서 실험 당일 세포가 밤새 배양할 수 있도록 합니다. 하룻밤 동안 접종한 G 세포 배양액 1ml를 제거하고 배지 및 세포외 크립토코칼 생성물을 제거한 G.To 420회씩 5분 동안 원심분리하여 효모 세포를 분리하고, 인산염 완충 식염수 또는 PBS로 세포를 3회 세척한 후 이전과 같이 원심분리합니다. 효모 세포 펠렛을 1ml의 멸균 PBS에 현탁시킨 후 1:100 희석 피펫을 만들고 희석액 10마이크로리터를 혈구 분석기에 넣고 세포를 계수합니다.

1에서 5까지의 감염 다중도에 필요한 효모 세포의 농도를 계산합니다. 계산된 부피의 크립토코칼 세포 현탁액을 밀리리터당 10마이크로그램의 농도로 18 B 7 단클론 항체가 있는 1밀리리터의 공급 매체에 추가합니다. 세포 현탁액을 실온에서 5분 동안 배양합니다.

다음으로, 유리 페트리 접시에서 공급 매체를 제거하고 멸균 PBS로 대식 세포를 한 번 씻습니다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 opsonize cmin을 우물에 직접 첨가 한 다음 섭씨 37 도와 10 % 이산화탄소 측에서 2 시간 동안 효모로 배양합니다. CO 배양 후 현미경으로 대식세포가 내재화된 c를 확인하면 대식세포가 내재화된 것으로 간주되는 세포가 큰 화살촉으로 표시된 대식세포의 범위 내에서 명확하게 보여야 합니다.

작은 화살촉은 곰팡이 세포가 없는 감염되지 않은 대식세포를 나타냅니다. 페트리 접시를 멸균 PBS로 세 번 세척하여 모든 세포 외 c neoformans를 제거합니다. 그런 다음 단클론 항체가 없는 1-2mL의 공급 매체를 추가하여 이러한 실험을 수행합니다.

실험 전에 이산화탄소 전달과 가열 장치가 포함된 부속 배양 챔버가 장착된 현미경이 필요합니다. 인큐베이팅 챔버를 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 예열합니다. 실험 시작 시 이산화탄소 단위가 5%를 읽는지 확인하십시오.

유리 바닥의 페트리 접시를 이산화탄소가 켜진 현미경 플랫폼 덮개에 놓고 모든 문을 닫아 열이 빠져나가지 않도록 하고, 위상차가 있는 현미경과 함께 10 x 대물렌즈를 사용하여 열이 빠져나가지 않도록 하고, 감염된 대식세포의 깨끗한 필드에 초점을 맞추고, 24시간 동안 4분마다 이미지를 촬영하도록 현미경 소프트웨어를 설정합니다. 24시간이 지나면 실험이 완료되고 총 361개의 이미지가 수집됩니다. 이 이미지를 5% 압축으로 JPEG로 내보냅니다.

이미지 J 소프트웨어를 사용하여 이미지를 초당 5프레임의 시각적 스택으로 볼 수 있습니다. 영화의 초반부는 대식세포가 들판 전체에 걸쳐 많이 퍼져 있는 것을 보여주는데, 일부는 감염되지 않은 대식세포도 있고 대식세포는 다양한 크기의 대식세포를 가지고 있다. 영화가 진행됨에 따라 세포는 모두 mo이고 이 영화에서 들판을 돌아다니는 것을 볼 수 있으며, 크립토코커스 세포가 감염된 대식세포의 범위 내에 있음이 분명합니다.

대식세포가 동요하고 효모 세포가 보이지만, FGA 영역 내에서 크립토코커스 세포는 주변 환경으로 빠르게 말소됩니다. 두 번째 감염된 대식세포는 비지체 외포작용(non litic exocytosis)을 겪게 되고 더 많은 효모 세포가 세포외 공간으로 방출됩니다. 숙주 세포는 계속 움직일 수 있는 능력으로 알 수 있듯이 크립토코칼 외세포작용 후에도 생존 가능한 상태를 유지합니다.

때때로 대식세포는 숙주 세포 간의 크립토코커스 세포 전달을 용이하게 하는 방식으로 상호 작용합니다. 효모 세포는 세포 외 환경에 노출되지 않으며 숙주 세포는 생존 가능한 상태를 유지합니다. 이 영화에서는 감염된 두 개의 대식세포가 두 차례에 걸쳐 세포 대 세포 다리를 만들어 크립토코커스 세포를 한 대식세포에서 다른 대식세포로 이동시킵니다.

이 동영상을 시청한 후에는 디지털 광학 현미경을 활용하여 비용해성 외포작용(non lytic exocytosis)을 겪고 있는 대식세포 및 기타 숙주 병원체 상호작용을 시각화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.