Name: 서브 클로닝 플러스 삽입 (SPI) - 유전자 타겟팅 벡터의 신속한 건설 소설 Recombineering 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 학습하세요 E. coli에서 서브 클로닝 플러스 삽입(SPI)을 이용한 유전자 타겟팅 벡터의 신속한 건설 방법입니다. 이 기법은 단일 반응에서 벡터를 구축하여 유전자 타겟팅 효율성을 크게 향상시킵니다.

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T.R.R은 프로젝트를 구상하고 실험을 설계 및 수행하고 원고를 준비했습니다. E.J.K와 S.E.M은 실험을 수행했습니다. 모든 저자는 최종 원고에 지적으로 기여했습니다. 이 연구는 SEM에 대한 레스터 대학교 혁신 펠로우십과 S.M.C(MR/J009202/1)에 대한 영국 의학 연구 위원회(MRC) 선임 연구 펠로우십의 지원을 받았습니다. DNA 염기서열분석은 레스터 대학교(University of Leicester)의 핵심 생명공학 서비스 센터(Centre for Core Biotechnology Services)인 PNACL(Protein and Nucleic Acid Laboratories)에서 수행했습니다. Rox 및 Dre 플라스미드를 제공해 주신 A. Francis Stewart에게 감사의 말씀을 전합니다. pL451 및 pL452 플라스미드는 미국 프레더릭에 소재한 National Cancer Institute(NCI)에서 수득하였다.

디자인을 대상으로 1 유전자 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 관심의 게놈 영역을 다루는 적절한 BAC 클론을 주문. 이 예를 수정해야 ES 세포의 종류에 동질 있는지 확인, 유전자 RPCI-23 및 RPCI-24 BAC 클론 C57BL / 6 ES 세포를 대상으로. </li><li> 대상 벡터를 설계 할 때 기준을 대상으로 기존의 유전자를 적용합니다. 주요 매개 변수는 수정이 인트론 카세트의 유전자 녹아웃 전략 및 간격과 배치를 삭제 중요한 엑손 (CE)을 정의, 구성 적 또는 조건부로 할 필요가 있는지 여부를 포함한다. 주 : 이들 각각은 다른 곳에서 열 상세히 논의되었다. </li><li> 대상 변형 사이트를 측면에서는 5~6킬로바이트 각각의 게놈 영역을 선택합니다. 주 : 상한 같은 플라스미드 p15A 서브 클로닝 적은 카피와 80킬로바이트만큼 높을 수 있지만 서브 클로닝 인서트의 크기는, 따라서, 전형적 10-12킬로바이트이다 인 pBR322 등과 BAC와 최대 200킬로바이트벡터. </li></ol> 2. 멀티 플렉스 Recombineering 올리고 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 플라스미드 백본 (서브 클로닝 플라스미드) 및 선별 마커 (삽입 카세트)에 대한 설계 올리고. 그것은 180 염기쌍의 HA의 측면에 게놈 대상 사이트와 삽입 카세트 또는 서브 클로닝 플라스미드 (그림 2)의 특정 프라이밍 서열의 20 bp의를 포함하도록 각 올리고 디자인. 참고 : 동성 암은 어떤 반복적 인 요소를 포함 할 수 없습니다, 반복적 인 요소의 존재가 잘못된 타겟팅 및 서브 클로닝 발생합니다. 반복 요소는 예컨대 &#39;&#39; &#39;가리개를 반복&#39;와 같은 웹 기반 툴을 이용하여 검출 할 수있다. </li><li> ES 세포 (그림 2)을 대상으로 유전자 대상으로 선형화 된 벡터를 벡터 올리고 중 하나에 고유 제한 효소 (RE) 사이트를 포함합니다. </li><li> 올리고 분석기 프로그램을 사용하여 올리고 매개 변수를 확인합니다. 프라이밍 지역에서 차 구조 않도록주의하십시오의. </li><li> 삽입 카세트의 짧은 HA (50 BP)은 허용과 재조합의 낮은 숫자를 산출하지만 서브 클로닝 플라스미드 HA가 이상 (180 BP) 항상 있는지 확인한다. </li><li> &#39;cloneDB&#39;추천 웹 기반 툴을 사용하여 특정 BAC 클론의 게놈 DNA 인서트의 방향을 결정한다. BAC 라이브러리의 구축에 사용 된 BAC 플라스미드 골격의 맵을 확인하여 오리스에서 복제의 방향을 설정. 참고 : 오리스 모든 일반적으로 사용되는 BAC 플라스미드의 클로람페니콜 (엽록소) 마커의 전사 방향과 반대 보통이다. </li><li> BAC 클론에 복제의 방향과 반대이다 올리고의 5 &#39;말단에 두 개의 터미널 포스 (PTO) 채권을 추가합니다. 역 올리고 (그림 2)에 5 &#39;인산 수정을 추가합니다. 참고 : 레드 소화에 따라 비대칭 phosphorothioated PCR 카세트는 수 소수 보온재 가닥 ssDNA를 중간 생성복제 포크의. 주 : 극대 다중화 재조합 빈도는 보온 스트랜드 보호 카세트로 관찰된다. 선도 가닥 보호 또는 이중 보호 카세트는 어떤 궤적에 상응하는 재조합 효율성을 생산하지 않을 수 있습니다. </li><li> PAGE 또는 HPLC 정제에 올리고 주문. </li></ol> pSC101 BADgbaA Recombineering 플라스미드 3. BAC 클론 변환. <ol style="margin-left: 40px;"><li> E.을 만들려면 실력 BAC의 recombineering 베어링 대장균은 레드 유전자 (16)를 포함하는 pSC101 BADgbaA 플라스미드로 변환. 참고 : pSC101 BADgbaA 플라스미드 아라비 노스 유도 ARAÇ-P BAD 프로모터, 테트라 사이클린 선택 마커 및 온도에 민감한 pSC101 플리의 제어 아래에있는 빨간색과 RECA 유전자가 포함되어 있습니다. <ol><li> BAC 한천 문화 멸균 피펫 팁을 찔러 원성 국물의 5.0 ml에 접종 (LB) 12.5을 포함하는 pH가 8.056; g ml의 -1 엽록소. 5 시간 200 rpm으로 흔들어 37 ° C에서 성장. </li><li> 10 % (v / v) 글리세롤 용액, 마이크로 원심 분리 튜브 및 얼음에 전기 천공 큐벳 진정. 4 ° C에 냉장 대형 원심 분리기 및 마이크로 원심 쿨. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 배양 물의 광학 밀도 (OD)를 결정하고 600 nm에서 흡광도를 측정한다. 0.3 내지 0.8의 OD 판독이 600에 도달 할 때 (후술) electrocompetent 세포를 준비한다. </li><li> 4 ° C에서 5 분 동안 1,216 XG에서 큰 원심 분리기 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 세포를 스핀 다운. </li><li> 냉장 10 % 글리세롤의 1 ml의 세포를 씻으 4 ° C에서 20 초 동안 17,949 XG에서 세포를 스핀 다운. 세탁 3 회 총 단계 수행합니다. </li><li> 10 % 글리세롤 50 μl의 총 부피에 재현 탁하고 세포를 pSC101 BADgbaA의 recombineering 플라스미드 10-200 ng의 추가. 피펫에 의해 단일 ​​세포 현탁액을 수득최대 여러 번 다운 후 미리 냉장 1mm 간격 전기 큐벳에 세포를 전송합니다. </li><li> 1.8 KV, 25 μF 200 Ω의 설정을 사용하여 세포를 Electroporate. 참고 : electroporator의 각 브랜드에 대한 올바른 설정을 확인합니다. 보다 작은 4 일렉트로 시정 염 및 기타 불순물의 존재를 나타낸다. </li><li> 즉시 LB 1 ㎖에 균체를 회수하고 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 세포를 옮긴다. </li><li> 2 시간 200 rpm으로 흔들어 30 ° C에서 BAC의 gbaA 문화를 성장. 참고 : 세포 인해 온도에 민감한 REPE 복제 인자의 불 활성화에 37 ° C에서 성장하는 경우 pSC101 BADgbaA 플라스미드가 손실됩니다. recombineering 기능을 유지하기 위해 30 ° C에서 gbaA 세포 성장. </li><li> 12.5 μg의 ml의 -1 엽록소 4 μg의 ml의 -1 테트라 사이클린 (구정) 복구 된 BAC의 gbaA의 문화를 포함하는 LB의 9 ML을 추가합니다. 성장BAC gbaA 문화 O / N (30)에서 &#160; ° C 200 rpm으로 흔들어. 참고 :, 수퍼 gbaA 플라스미드를 electroporating의 변환 효율은 액체 미디어에 포화 성장 O / N을 허용하기에 충분히 높다. </li></ol></li></ol> 삽입 카세트 및 서브 클로닝 플라스미드 4. 준비 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 후술하는 바와 같이 변형 된 긴 올리고 사용 (PCR)를, 카세트 삽입 (들) 및 서브 클로닝 플라스미드로 HA를 통합 중합 효소 연쇄 반응을 수행한다. <ol><li> 옵션 : recombineering 반응에 플라스미드 이월을 방지하기 위해 삽입 카세트를 증폭 R6K 원산지 또는 유사한 좁은 숙주 범위 플라스미드 템플릿을 사용합니다. </li><li> 대안 적으로, RE 다이제스트 (표 2)를 이용하여 플라스미드를 선형화 템플릿. PCR 증폭 영역 이외의 절단 및 열 불 활성화 RE를 선택합니다. 증명할에서 권장하는 열은 RE를 비활성화acturer. </li><li> 고 충실도 핫 스타트 DNA 중합 효소 시스템을 사용하여 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 설정한다. (표 3)를 자세히 설명 PCR 마스터 믹스를 준비합니다. (표 3)과 같이 열 순환을 수행합니다. </li></ol></li><li> 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 PCR 생성물을 분석한다. 로드 1-5 1 % 상 각 PCR ㎕의 0.5 MG ml의 -1 에티 디움 브로마이드 (EtBr이)를 포함하는 아가로 오스 겔 (/ V w). 주 : 비 - 특이 적 증폭 생성물의 존재 recombineering 반응에 간섭하지 않는다. 그러나 일부 경우, 프라이머 다이머는 recombineering 효율을 감소시킬 수있다. </li><li> PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제. <ol><li> 옵션 : PCR 청소 다음 DpnI으로 처리하여 PCR들에서 플라스미드 템플릿을 제거합니다. (제조업체에서 권장) 멸균 탈 이온수의 최소 볼륨에서 용출 DNA. 주 : DpnI 첨가 번째 개열의 저감 효율 PCR 반응 결과를하기 미정전자 메틸화 된 플라스미드 DNA 템플릿입니다. </li></ol></li><li> DNA 기준 예, λ를 HindIII 분해물 또는 집합에 대해 공지 nanodrop 분광 광도계를 이용하여 아가 로스 겔 분석에 의한 PCR 증폭 된 DNA 정량화. </li></ol> 5. 서브 클로닝 플러스 삽입 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 10 ㎖의 LB + 엽록소 + 구정에 200 μl를 추가하여 O / N BAC gbaA 문화 50 배 희석. 30 성장 &#160; ° C는 1 시간 50 분 동안 200 rpm으로 진탕. 샘플을 포함하는 음성 대조군으로 사용할 수있다. </li><li> 단계 3.1.2에 설명 된대로 4 ° C에 모든 recombineering 용 재료 및 장비를 진정. </li><li> LB 한천의 pH를 서브 클로닝 벡터 (표 4)를 선택할뿐만 아니라, 삽입 된 DNA 단편의 선택을 허용 할 것이다 적절한 항생제 선택 (들)의 정확한 농도를 함유하는 8 개의 플레이트를 붓는다. 참고 : 일부 항생제의 pH에​​ 민감하다. 사용 LB원칙적으로 한천의 pH 8. </li><li> L 아라비 노스의 솔루션 (V / W) 10 %를 준비합니다. 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 살균 여과. 주 : 아라비 노스가 gbaA 플라스미드로부터 recombineering 단백질의 발현을 유도한다. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 BAC의 gbaA 문화의 OD를 확인합니다. 다음 단계에서 설명한 바와 같이 0.25 내지 0.3 600 도달 OD되면 recombineering 단백질을 유도한다. </li><li> 0.2 % 아라비 노스의 최종 농도를 달성하기 BAC 배양을 10mL의 10 % 아라비 노스 용액 200 μL를 추가한다. (아라비 노스)없이 유도되지 않은 배양을 포함하는 음성 대조군으로 사용할 수있다. </li><li> 37 BAC 문화를 전송 &#160; C 진탕 배양기를 °와 45 분 230 rpm에서 진탕 레드 발현을 유도. 참고 : 레드 단백질의 발현이 30 ° C에서 비효율적이다. </li><li> 세포를 스핀 다운 단계 3.1.5에 설명 된대로 10 % 글리세롤로 3 회 세척한다. </li><li> , 600-1 추가000 개의 서브 클로닝 플라스미드 recombineering 반응에 삽입 카세트 (S)의 각각 겨. 벡터와 카세트의 재조합 능력과 무결성을 확인하는 유일한 벡터 및 벡터 플러스 단일 삽입 컨트롤을 포함합니다. </li><li> 위아래로 pipetting하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. BAC 벡터를 3 시간 동안 37 ° C에서 다중 카피 플라스미드 또는 LB 10ml에 1 시간 동안 37 ° C에서 1 ml의 LB 스텝 3.1.7 이후 회복에 기재된 전기 천공을 수행한다. </li><li> 회수 된 배양 예, 90 %, 10 %, 1 듀얼 선택 아가 플레이트에서 37 %의 성장 접시 다른 희석액 &#160; 16 시간 동안 C를 °. </li></ol> 재조합 6. 분석 <ol style="margin-left: 40px;"><li> 옵션 : 6 ~ 12 식민지를 선택하고 HA 플 랭킹 프라이머 및 삽입 특정 프라이머를 사용하여 식민지 PCR을 수행합니다. 서브 클로닝 플라스미드와 삽입 캐스 포함SETTE 플라스미드뿐만 아니라 부정적인 컨트롤 등의 부모 BAC 클론. <ol><li> 식민지의 PCR의 아가 로스 젤 분석을 수행합니다. 예상 크기에서 밝은 밴드의 존재에 의해 긍정적 인 클론을 확인합니다. 주 : SPI 클로닝 과정의 높은 효율을 거의 정확한 재조합 체를 생성한다. </li></ol></li><li> 선택적 항생제가 포함 된 5 ㎖의 LB의 pH를 8로 식민지를 선택하고 37 ° C에서 O / N 성장. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 열 정제 키트를 사용하여 DNA의 minipreps를 준비합니다. </li><li> 표준 페놀 - 클로로포름 격리 또는 유사한 프로토콜을 사용하여 BAC 미니 프렙 DNA를 준비합니다. </li><li> 미니 프렙 DNA에 RE 다이제스트를 수행합니다. 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 분리 DNA. 정확한 표적화 벡터 단편의 예상 크기를 포함하는 클론을 확인하는 RE 패턴을 분석. 분명히 벡터 부족 삽입 (들) 및 삽입물을 포함하는 벡터를 구별 RE를 선택합니다. </li><li> 옵티오NAL : E. 여전히 존재한다 BAC, 결여되어 세포를 수득 대장균 recombineering 후 DH5alpha 또는 DH10B E.를 변환하는 플라스미드 미니 프렙 DNA를 사용하여 대장균 세포. </li><li> 올리고 합성의 오류를 확인하기 위해 HA 및 삽입 카세트를 통해 DNA 시퀀싱을 수행합니다. </li></ol>

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TRR은 다중 재조합 기술에 대한 영국 특허 출원의 발명가입니다.

ES 세포주 및 마우스 모델의 제작은 역사적 변성 대립 유전자를 포함하는 플라스미드 (4) 구조를 이용하여 표적 유전자를 포함하고있다. 그러나, 이러한 복잡한 유전자 타겟팅 벡터의 구성은 이러한 모델 적시 생산 상당한 병목 것으로 입증되었다. recombineering 기반 벡터 건설 전략의 개발은 개선 된 벡터 설계 및보다 효율적인 벡터 조립체를 허용했다. 그럼에도 불구하고, 현재의 recombineering 프로토콜은 여전히​​ 여러 단계를 포함하는 중간 플라스미드 정화를 필요로 다른 균주를 사용합니다. 플러스 삽입을 서브 클로닝하면 상주 BAC 호스트 변형 한 전기 이벤트에서 수행 할 수 벡터 건설에 대한 새로운 접근 방식을 제공합니다. 유전자 타겟팅에서 SPI의 유틸리티는 벡터 건설 다양한 응용 프로그램을 여기에 테스트되었습니다. 여기에 검사를 모든 경우에, SPI 효율적인 것으로 입증하고 올바른 재조합 플라스미드를 제조 하였다.대부분의 경우, 다른 복수의 카세트가 제대로 타겟팅 벡터에 삽입 하였다. 큰 DNA 카세트 및 벡터에 용이 SPI 프로토콜에 수용하고이 시스템의 융통성을 증명 하였다. SPI는 긴 상 동성 서열과 선형 DNA 카세트 포스 (PTO) 보호의 사용에 의존한다. PTO 수정은 선형 DNA (20, 21)에 exonucleases에 대한 보호를 부여하고 긴 HA 다중화를 허용하는 재조합 효율을 증가시킨다. 그러나, 더 긴 서열의 올리고 합성 에러에게 특히 결실 축적 가능성을 증가시킨다. 그들은 단백질 코딩 영역을 포함하는 경우 올리고 돌연변이 특히 유해 할 수 있습니다. DNA의 HA를 통해 시퀀싱 및 삽입 된 카세트의 전체 길이를 커버는 매우 어떤 순서 변경과 클론을 제거하는 것이 좋습니다. 고 충실도 DNA 폴리머 라제 시스템의 사용은 또한 도입을 피하기 위해 제안Y PCR 오류가 발생합니다. 서브 클로닝 플라스미드의 HA의 길이 및 조성이 삽입 카세트의 그것보다 상대적으로 중요하다 (데이터는 보이지 않음). 엑손 영역에 어떤 돌연변이가 용납되지 올림피아 벡터, 건설 등의 특히 중요한 애플리케이션의 경우, 삽입의 카세트 HA 긴 올리고와 연관된 문제를 피하기 위해 (50~120 BP)을 단축 할 수있다. 삽입은 카세트 (복제의 방향에 대한 지식을 사용할 수없는) 변성 또는 이중 phosphorothioated 남게 될 수있다. 그러나이 경우에 다중 여전히 긴 HA 서브 클로닝 플라스미드 보호가 필요합니다. 이 특정 전략의주의 할 점은 잠재적으로 다른 궤적에서 SPI 복제에 영향을 줄 수있는 다중 효율의 저하이다. 카세트 삽입 및 서브 클로닝 플라스미드의 길이는 SPI 클로닝 또 다른 중요한 파라미터이다. 큰 DNA 분자는 덜 효율적 electroporate 및 효과는 다시 주어진 누적동일한 셀의 모든 카세트를 도입하는 조건을 가지 (데이터는 보이지 않음). 다중 작은 삽입 카세트와 가장 효율적입니다. DNA보다 큰 3킬로바이트도 3킬로바이트 30까지 가장 효율적인 레드 매개 ssDNA의 처리에 제한을 두지 파편입니다. 3킬로바이트를 초과 삽입 카세트 절제된 듀얼하고 베타 독립적 인 통로 (20)를 통해 덜 효율적으로 재결합. 따라서, 정확한 복제를 식별 할 수있는 충분한 식민지의 심사는 이러한 경우에 중요합니다. 재조합 포스트 전기의 긴 기간은 어려운 SPI 운동의 올바른 클론의 회복의 가능성이 높아집니다. 4 개의 소형 카세트 (&lt;1.5 KB) 다중화 효율이 각각의 추가적인 카세트와 함께 감소하지만, SPI 프로세스와 동시에 삽입 될 수있는 최대 (데이타 미기재). 그러나 이것은 최적의 SPI 실험의 결과를 반영하며 많은 대형 카세트를 사용하는 경우 다중의 한계를 고려하는 것이 바람직하다. </P&gt; 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 같은 게놈 편집 도구의 개발은 (CRISPR) -cas9 효소 시스템은 새로운 게놈 수정의 생성을 활성화하고보다 효율적으로 게놈 엔지니어링 (36)하게되었다. 그러나 이러한 새로운 기술은 유전자 대상 벡터를 보완하기보다는 그들을 대신하게했다. 그것은 CRISPR-CAS 시스템은 항생제 선택을 교체하고 추가 멀티 플렉스 recombineering 프로토콜을 구체화 할 수 있다는 예상된다.

유전자 타겟팅 기술들의 개발은 다른 생물학적 시스템 1-3 조사 세포주 및 마우스 모델의 구성을 가능하게했다. 게놈 서열의 변형 키를 제 4 단계는 벡터를 표적 유전자의 설계 및 시공된다. 타겟팅 벡터는 선별 마커 (예를 들면, 네오 마이신)에 의해 측면 원하는 변형 (들)을 포함하는 관심있는 대립 유전자를 운반하는 플라스미드 구조체, 및 포유 동물 세포에서 5 ​​효율적인 상동 재조합에 필요한 긴 게놈 영역이다. 정확한 유전자 변형은 배아 줄기로 타겟팅 벡터의 도입 (ES) 세포를 6 또는 체세포 7에 의해 달성된다 타겟팅 벡터의 DNA 서열과 동일 뻗어 간의 상동 재조합과 의도 변형 예의 전사의 유전자좌 결과 유전자 변환 (8)에 의해 게놈. 그런 후 변형ED ES 세포는 배아 9 통해 이러한 대립 유전자 변형을 전송할 수있는 자손 (키메라)를 생성하기 위하여 마우스 포배 내로 주입 될 수있다. 트랜스 제닉 마우스를 제조하는 다른 경로는 마우스 게놈에서의 열 벡터의 임의의 통합에 이르게 단세포 마우스 접합체로 유전자 발현 벡터의 마이크로 인젝션을 포함한다. 벡터 건설의 전통적인 방법은 기존에 의존 한 벡터 백본에 다른 선택 마커 및 유전자 조각을 복제하는 제한 효소와 DNA 리가 제를 사용하여 복제 &#39;잘라 내기 및 붙여 넣기&#39;. 그러나, 기존의 복제 제한 요소는 고유 포지셔닝 및 제한 부위의 선택은 특히 긴 DNA 서열로이다. 이것은 종종 다수의 서브 클로닝 단계를 필요로하고 또한 종종 표적 유전자의 낮은 효율에 이르게 벡터 내로 외래 DNA 서열을 도입한다. Recombineering (재조합 성 ENGineering) E. 파아지 재조합 단백질에 의해 매개 된 상 동성 재조합 (HR)를 사용하여 이러한 한계를 극복 DNA 공학적이며 대장균 세포 (11, 12). 상동 서열의 어느 지역이 recombineering의 기판 역할을 할 수 있기 때문에, 제한 사이트의 가용성의 제약이 제거됩니다. 큰 DNA 서열은 따라서 원활 또한 구조적 일체 (13)을 보존, 생체 내에서 직접 변형 될 수있다. Recombineering 짧은 동성 (50 BP) (14), 따라서 동성 암 (HA)을 편리하게 합성 올리고 시퀀스에 통합 할 수 있습니다 매우 효율적입니다. 전형적인 recombineering 실험, 올리고 또는 ​​HA를 포함하는 이중 가닥 DNA (dsDNA) 조각에서 recombineering 관할 E.에 electroporation됩니다 염색체 나 플라스미드 (15)에 하나있는 대상을 포함하는 대장균 세포. 재결합 가능성은 레드 녹화의 유도 식으로 수여ombination 파지 16, 17의 단백질 또는 RAC의 프로 파지 (18)의 RecET 단백질. 레드 / RECE의 엑소 뉴 클레아 제는 파트너, 레드 / RECT, 단일 가닥 어닐링 단백질 (SSAP) (19)에 의해 결합되어 중간 단일 가닥 DNA (ssDNA를), 선형의 dsDNA를 변환합니다. ssDNA를 길게하거나 상보 표적 서열에 짧은 올리고의 어닐링 복제 포크의 보온 가닥 발생 및 표적 부위에서 서열의 혼입에 이르게. 스트랜드 ssDNA를 재결합하는 래깅 recombineering의 높은 효율의 기초와 &#39;베타&#39;재결합 모델 (20, 21)에 의해 설명 될 수있다. 일반적인 recombineering 워크 플로우는 유전자 표적 벡터는 다음과 같은 두 가지 경로 중 하나를 포함 빌드합니다. 하나의 경로에 loxP 재조합 사이트 순차 삽입, 선택 마커이어서 플라스미드로 마우스 BAC 클론에서 원하는 게놈 영역을 서브 클로닝 포함 <s업&gt; (22) 등, 또는 대체 경로가 10,23을 recombineering 후 24, 25 복제 갭 수리하여 플라스미드로 수정 된 궤적을 서브 클로닝의 여러 라운드로 다른 타겟팅 벡터 요소 BAC 유전자좌를 대상으로 포함한다. 이 테마에 큰 변형 마우스 제작 프로그램 (26, 27)의 일부로서 다른 높은 처리량 recombineering 파이프 라인에서 사용되어왔다. 그러나, 이들 절차가 복잡하고 긴 스테이지들을 포함 특수 벡터와 E.의 사용을 필요 대장균 균주 (예, Cre 호텔은 발현 세포) 및 벡터 DNA를 정제하고 다시 변환 (표 1)의 하나 이상의 중간 단계를 이용한다. 플러스 삽입 (SPI)를 서브 클로닝하는 베타 재조합 단일 프로세스로 복제 갭 수리 (그림 1)를 결합하는 새로운 recombineering 기술이다. SPI 벡터 조립, 단순 신속하고 유연하며 표준 recombi에 상당한 개선을 제공합니다어링 (표 1)에 접근한다. 여기서는 용이성 및 비표준와 도전 벡터 디자인 구성에 특정 중점을 다른 벡터 건설 애플리케이션에 SPI를 사용하는 유틸리티를 보여준다. 테스트 케이스는 형광 리포터 올림피아 벡터의 구조, 듀얼 태그 올림피아 단백질 발현 벡터, BAC 형광 리포터 벡터 및 조건부 녹아웃 벡터를 포함. 이들은 각종 핵 단백질 복합체를 세포 표면 수용체 지역화 정화 요구 조건을 조사하거나 유전자의 발현을 브레이션.

<table><tbody><tr>제오신 <td>시그마를</td> <td>제외한 항생제</td>: http://www.sigmaaldrich.com <td>암피실린, A9518-5G; 클로람페니콜, C1919-5G; 블라스티시딘, 15205-25MG; 겐타마이신, G1264-50MG; 하이그로마이신, H3274-50MG; 카나마이신, : K1876-1G; 테트라사이클린 염산염, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G</td><td></td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invivogen:&nbsp;</td><td>ant-zn-1</td><td>Zeocin은 Life technologies/Fisher</td></tr><tr><td>C57BL/6 BAC 클론</td><td>CHORI: https://bacpac.chori.org/&nbsp;</td><td>RPCI-23 또는 RPCI-24 BAC 라이브러리</td><td>129/Sv BAC 클론은 Invivogen 또는 Life technologies/Fisher</td></tr><tr><td>KOD 핫스타트 DNA 중합효소 시스템</td><td>Millipore: https://www.merckmillipore.com</td><td>71086-3</td><td></td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sigma: http://www.sigmaaldrich.com</td><td>A3256-25G</td><td></td></tr><tr><td>Long oligos</td><td>IDT: https://www.idtdna.com; 유전자 연결:</td><td>https://www.genelink.com IDT Ultramers 또는 Gene Link long oligos</td><td>PTO 및 Phosphosphate를 맞춤형 변형으로 사용할 수 있습니다. PAGE 정제는 긴 올리고에 강력히 권장됩니다.</td></tr><tr><td>MinElute PCR 정제 키트</td><td>Qiagen: http://www.qiagen.com&nbsp;</td><td>28004</td><td>Minimum elution PCR purifications kit가 선호됩니다.</td></tr><tr><td>QIAPrep Spin Mini Prep kit</td><td>Qiagen: http://www.qiagen.com&nbsp;</td><td>27104</td><td>실리카 컬럼 또는 유사한 매트릭스 키트가 선호됩니다.</td></tr><tr><td>제한 효소</td><td>NEB: https://www.neb.com</td><td>DpnI: R0176L</td><td>RE 목록은 NEB 웹사이트를 참조하십시오.</td></tr></tbody></table>

서브 클로닝 플러스 삽입 (spi) - 유전자 타겟팅 벡터의 신속한 건설 소설 recombineering 방법

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

유전자 표적화는 상동 재조합을 사용하여 유전자 자리의 정확한 변형을 나타냅니다. 이 방법을 사용하여 새로운 세포주와 형질전환 마우스 모델을 생성하려면 표적 유전자에 대한 상동 DNA 염기서열을 포함하는 '표적화' 벡터의 구축이 필요하며, 이는 수년 동안 이 과정에서 제한적인 단계였습니다. 벡터 구축은 재조합(recombinationering)이라는 기술을 사용하여 파지 재조합효소에 의해 매개되는 상동 재조합을 사용하여 대장균 세포에서 in vivo 수행할 수 있습니다. 재조합(Rebinering)은 긴 상동성 염기서열(>4kb)과 표적 벡터와 동족 게놈 유전자 자리 사이의 효율적인 대립유전자 교환을 매개하는 데 필요한 선택 마커를 포함한 다양한 표적화 요소를 subclone하기 위해 선호되는 기술입니다. 일반적인 재조합 프로토콜은 표적 요소의 단계적 통합의 반복적인 계획을 따르며 중간 정제 및 변환 단계가 필요합니다. 여기에서는 멀티플렉스 접근 방식을 사용하여 벡터 어셈블리의 새로운 재조합 방법론을 제시합니다. Plasmid gap repair는 마우스 Bacterial Artificial Chromosome 라이브러리에서 게놈 염기서열을 동시에 캡처하고 이중 박테리아 및 포유류 선택 마커를 삽입하여 수행됩니다. 이 subcloning plus 삽입 방법은 매우 효율적이며 대부분의 올바른 재조합 물질을 얻을 수 있습니다. 우리는 이 방법을 사용하여 구성된 다양한 유형의 조건부 유전자 녹아웃 또는 넉인(knock-in) 벡터와 BAC 리포터 벡터의 구성에 대한 데이터를 제시합니다. SPI 벡터 생성은 recombineering toolbox의 레퍼토리를 크게 확장하며 이러한 매우 복잡한 벡터를 구성하는 간단하고 빠르며 비용 효율적인 방법을 제공합니다.

유전자 표적화 방법론을 사용하여 knockout, knock-in 및 tagged 대립유전자가 있는 형질전환 마우스를 생성할 수 있습니다. 여기에서는 E. coli에서 재조합하는 개선된 방법, 즉 'subcloning plus insertion'이라고 하는 재조합 방법을 설명하며, 이는 맞춤형 유전자 표적화 벡터를 빠르게 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

서브 클로닝 플러스 삽입 (SPI) - 유전자 타겟팅 벡터의 신속한 건설 소설 Recombineering 방법

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

다음 실험의 전반적인 목표는 sub cloning plus insertion을 사용하여 유전자 표적화 벡터를 구성하는 것입니다. 이는 대장균을 함유한 등을 재조합 플라스미드로 변형시킴으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 비대칭 인산화 삽입 카세트를 생성하고 중합효소 연쇄 반응에 의해 플라스미드를 subcloning하는 것입니다.아라비노스를 첨가한 후 GBAA 재조합 단백질이 발현되고 말단 변형 삽입 카세트 및 서브클로닝 플라스미드가 전기천공됩니다. 원하는 DNA 염기서열은 동시에 뒤쪽에서 캡티브(captive from)되고 삽입 카세트와 함께 서브클로닝 플라스미드(subcloning plasmid)로 변형됩니다. 표준 재조합과 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 유전자 표적화 벡터 구축을 단일 반응으로 수행할 수 있다는 것입니다.먼저 삽입 카세트 및 서브클로닝 플라스미드에 대한 올리고 설계를 시작하여, 게놈 표적 부위 측면에 있는 180개의 염기쌍 상동성 암과 삽입 카세트 또는 서브클로닝 플라스미드에 대한 특정 프라이밍 서열인 20개의 염기쌍을 포함하도록 각 올리고를 설계합니다. 다음으로, clone db와 같은 웹 기반 도구를 사용하여 back clone의 genomic DNA 삽입 방향을 결정합니다. back에서 사용되는 back plasmid backbone의 map을 확인하여 복제 방향 또는 ES를 설정합니다.라이브러리 건설, 2 개의 말단 phospho 8 결합을 추가하여, 백 클론의 복제 방향과 반대에있는 올리고의 5 개의 프라임 엔드를 추가합니다. 다음으로, 리버스 올리고에 5 프라임 인산염 변형을 추가합니다. 먼저 멸균 피펫 팁을 뒤쪽 한천 배양액에 찔러 넣고 5.0ml의 오딘 육수를 접종합니다.섭씨 37도에서 200RPM으로 흔들면서 5시간 동안 배양물을 배양합니다. 다음으로, 냉각, 10% 글리세롤 용액, 마이크로 원심 분리기, 튜브 및 전기천공법, 얼음 냉각기의 큐벳, 냉장 대형 원심 분리기 및 마이크로 원심 분리기를 섭씨 4도까지 가열합니다. 배양 후 분광 광도계를 사용하여 배양물의 광학 밀도를 측정합니다.흡광도 측정. 600나노미터에서. OD 600 판독값이 0.3 - 0.8에 도달하면 전기 컴피턴트 셀을 준비합니다.배양이 준비되면 50ml 원심분리 튜브에서 세포를 스핀다운합니다. 식힌 10% 글리세롤 1ml로 세포를 씻고 다시 돌립니다. 이 세척 단계를 총 세 번 수행합니다.총 50 μl의 부피로 세포를 재현탁시키고 10 - 200 나노그램의 재조합 플라스미드를 첨가합니다. 여러 번 위아래로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 얻은 다음 세포를 사전 냉각 electroporation으로 옮깁니다. 베트. 다음으로, VETE를 electroporation 장치에 넣고 세포를 즉시 전기 작동시켜 LB 1 밀리리터에서 세포를 복구하고 세포를 50 밀리리터 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.섭씨 30도에서 200RPM으로 흔들면서 2시간 동안 등 배양을 성장시킵니다. 이 시간이 지나면 회수된 배양액에 9ml의 LB를 추가합니다. 섭씨 30도에서 하룻밤 동안 200RPM으로 흔들어 상동체를 삽입 카세트와 subc 클로닝 플라스미드에 통합합니다.앞서 제조된 긴 변형 올리고를 사용하여 PCR을 수행합니다. 또는 제한 효소를 사용하여 플라스미드 템플릿을 선형화하고 PCR 증폭 영역 외부를 절단하고 활성화된 열을 갖는 템플릿을 선택합니다. 고충실도 핫 스타트, DNA 중합효소 시스템을 사용하여 PCR을 설정합니다.PCR 마스터 믹스를 준비하고 모범 사례에 따라 열 사이클링을 수행합니다. 반응 후에, AROS 젤 전기 이동법으로 PCR 제품을 분석하십시오. 1%aros 젤에 각 PCR의 1개에서 5개의 마이크로리터를 적재하십시오.다음으로, PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제합니다. 알려진 DNA 표준물질 세트에 대해 또는 NanoDrop 분광 광도계를 사용하여 PCR 증폭 DNA를 정량화합니다. 하룻밤 배양 후 GBAA 배양을 50배 희석하고 음성 대조군을 위한 별도의 배양을 준비합니다.희석된 배양물을 섭씨 30도에서 200RPM으로 1시간 50분 동안 흔들면서 성장시킵니다. 다음으로, 앞에서 설명한 것처럼 모든 재조합 재료와 장비를 섭씨 4도로 냉각합니다. OSE의 부피당 10% 중량 용액을 준비하고 0.2 미크론 주사기 필터를 통해 필터를 살균합니다.back culture의 OD가 원하는 수준에 도달하면 재조합 단백질의 유도를 진행합니다. 10% 아랍 용액 200마이크로리터를 백 배양 10밀리리터에 첨가하여 0.2%의 최종 광역 농도를 달성하고 음성 대조군으로 사용할 유도 배양액을 포함합니다. 배양물을 섭씨 37도의 진탕 인큐베이터로 옮기고 230RPM으로 진탕하면서 45분 동안 적색 발현을 유도합니다.세포를 스핀다운하고 600-1000 나노그램에서 앞서 보여준 것처럼 10% 글리세롤로 3회 세척합니다. 재조합 반응에 대한 삽입 카세트 및 서브클로닝 플라스미드 각각은 벡터의 재조합 숙련도 및 무결성을 확인하기 위해 벡터만 및 벡터와 단일 삽입 대조군을 포함한다. 다음으로, 단일 셀 현탁액을 얻고 앞서 보여진 바와 같이 셀을 전기 작동시킵니다.다중 복사 플라스미드의 경우 섭씨 37도의 LB 배지에서 1시간 동안, 백 벡터의 경우 섭씨 37도의 10lb 배지에서 3시간 동안 회수할 수 있습니다. 이중 선택에서 회수된 배양액으로 다양한 희석을 완료합니다. 한천은 섭씨 37도에서 16시간 동안 자라십시오.준비가 되면 선택적 항생제가 포함된 5ml의 LB로 군체를 선택하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 자랍니다. 다음으로, 컬럼 정제 키트를 사용하여 미니 분취 DNA를 준비하고, 적절한 제한 효소를 도입한 다음, 겔 전기영동으로 예상되는 단편 크기를 포함하는 클론을 식별합니다. 마지막으로, 상동성 암과 삽입 카세트 전반에 걸쳐 DNA 염기서열분석을 수행하여 oli 광합성 오류를 확인합니다.이 예시에서, 클론을 포함하는 P 2 RX 1 EYFP 인서트의 제한 분해 분석은 올바르게 조립된 knockin 벡터를 포함하고 있음을 나타내는 예상 패턴을 보여주었습니다. 이 회로도는 bact trimming의 개념을 보여줍니다. 서브클로닝과 PCR 산물의 삽입 분석을 사용하여 카세트가 올바르게 통합되었음을 확인했습니다.또한, 적절한 제한 효소를 첨가한 후 양성 백 클론을 분석했을 때, 예상되는 패턴이 얻어졌습니다. 12개의 RSR 2개의 SBI 클론에 대한 제한 분해 분석은 대부분의 재조합체에서 올바른 벡터 조립을 보여주었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 sub cloning plus insertion을 사용하여 유전자 표적화 벡터를 빠르게 구성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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에서 상동 재조합 구문을 Recombineering<em&gt; 초파리</em

DNA 조립체를 사용하여, 여러 CRISPR 벡터가 CRISPR 다수의 구성을 하나 복제 반응에 병렬로 구성 될 수있는 간단한 작업 벡터. 토마토 털이 뿌리는 CRISPR 경로를 확인하고 돌연변이 물질을 생성 할 수있는 훌륭한 모델 시스템입니다.

토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성

여기에서 우리는 이전에 설명한 시스템 개선 한 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)의 AAVS1 궤적에 RMCE에 따라 신속하고 효율적인 유전자 편집 방법을보고합니다. 이 기술을 이용하여, 동질 라인 신속하고 안정적으로 형질 전환 hPSCs 매개 연구를 용이하게 적절한 비교 연구를 위해 생성 될 수있다.

에서 재조합 효소 중재 카세트 교환에 의해 재조합 인간 다 능성 줄기 세포의 신속하고 효율적인 생성<em&gt; AAVS1</em&gt; 로커스

이 프로토콜의 목표는 골든 게이트 복제를 기반으로 모듈형 복제 시스템을 사용하여 다중 유전자 구조를 조립하기위한 상세한 단계별 가이드를 제공하는 것입니다. 또한 우리의 경험을 바탕으로 최적의 어셈블리를 보장하기 위한 중요한 단계에 대한 권장 사항을 제공합니다.

모듈형 골든 게이트 복제를 사용하여 다중 유전자 구조물의 신속한 조립

이 프로토콜은 형광 기자 및 세포 분류를 사용하여 대식세포 및 T 세포주에서 노크-인 실험을 단순화합니다. 2개의 플라스미드는 면역 세포에 있는 Rosa26 메뚜기에서 영구적으로 통합되는 EBFP2를 표현하는 EBFP2를 표현하는 상동성 재조합 기증자 플라스미드와 CRISPR/Cas9- 및 DsRed2 표현 플라스미드와 균등하게 재조합 기증자 플라스미드인 이러한 단순화된 노크-인 실험에 사용됩니다.

CRISPR/Cas9 및 대식세포 및 T 세포주에서 세포 분류에 의한 유전자 노크인

재조합 아데노 관련 바이러스(rAAV)는 임상 및 전임상 유전자 전달에 널리 사용됩니다. rAAV의 과소평가된 용도는 정제 없이 배양된 세포의 강력한 transduction입니다. rAAV를 처음 접하는 연구자를 위해 transgene cassette 클로닝, 미정제 벡터 생산 및 세포 배양 transduction을 위한 프로토콜을 제공합니다.

Unpurified Recombinant Adeno-associated Viral Vectors를 사용한 배양 세포에서의 전이유전자 발현

여기에서는 인서트의 3' 말단에 적절한 제한 부위를 도입하여 pVAX1-PRRSV 발현 벡터를 얻기 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 상동 재조합 기술을 통해 벡터를 선형화하고 DNA 단편을 벡터에 하나씩 결합할 수 있습니다.

돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 발현 벡터 구축을 위한 원활한 클로닝 접근법

당사는 DNA 단편의 PCR 증폭 없이 벡터 간에 관심 DNA 단편을 전달할 수 있는 고처리량 클로닝 방법인 CRISPR 기반 셔틀 클로닝(CRISPRshuttle 클로닝)을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

CRISPR 기반 셔틀 클로닝: High-throughput 클로닝 방법

고가 플러스 미로 테스트에서 마우스 동작과 같은 불안을 측정하는 가장 널리 사용되는 검사 중 하나입니다. 여기, 우리는 테스트를 수행을위한 세부 절차를 보여주는 동영상을 제시한다.

마우스에 대한 고가 플러스 메이즈

생산 C. 엘레간스</em함께 Recombineering 통해> Transgenes galK 선택 마커

학습하세요 E. coli에서 서브 클로닝 플러스 삽입(SPI)을 이용한 유전자 타겟팅 벡터의 신속한 건설 방법입니다. 이 기법은 단일 반응에서 벡터를 구축하여 유전자 타겟팅 효율성을 크게 향상시킵니다.

서브 클로닝 플러스 삽입 (SPI) - 유전자 타겟팅 벡터의 신속한 건설 소설 Recombineering 방법

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