서브 클로닝 플러스 삽입 (SPI) - 유전자 타겟팅 벡터의 신속한 건설 소설 Recombineering 방법

다음 실험의 전반적인 목표는 sub cloning plus insertion을 사용하여 유전자 표적화 벡터를 구성하는 것입니다. 이는 대장균을 함유한 등을 재조합 플라스미드로 변형시킴으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 비대칭 인산화 삽입 카세트를 생성하고 중합효소 연쇄 반응에 의해 플라스미드를 subcloning하는 것입니다.

아라비노스를 첨가한 후 GBAA 재조합 단백질이 발현되고 말단 변형 삽입 카세트 및 서브클로닝 플라스미드가 전기천공됩니다. 원하는 DNA 염기서열은 동시에 뒤쪽에서 캡티브(captive from)되고 삽입 카세트와 함께 서브클로닝 플라스미드(subcloning plasmid)로 변형됩니다. 표준 재조합과 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 유전자 표적화 벡터 구축을 단일 반응으로 수행할 수 있다는 것입니다.

먼저 삽입 카세트 및 서브클로닝 플라스미드에 대한 올리고 설계를 시작하여, 게놈 표적 부위 측면에 있는 180개의 염기쌍 상동성 암과 삽입 카세트 또는 서브클로닝 플라스미드에 대한 특정 프라이밍 서열인 20개의 염기쌍을 포함하도록 각 올리고를 설계합니다. 다음으로, clone db와 같은 웹 기반 도구를 사용하여 back clone의 genomic DNA 삽입 방향을 결정합니다. back에서 사용되는 back plasmid backbone의 map을 확인하여 복제 방향 또는 ES를 설정합니다.

라이브러리 건설, 2 개의 말단 phospho 8 결합을 추가하여, 백 클론의 복제 방향과 반대에있는 올리고의 5 개의 프라임 엔드를 추가합니다. 다음으로, 리버스 올리고에 5 프라임 인산염 변형을 추가합니다. 먼저 멸균 피펫 팁을 뒤쪽 한천 배양액에 찔러 넣고 5.0ml의 오딘 육수를 접종합니다.

섭씨 37도에서 200RPM으로 흔들면서 5시간 동안 배양물을 배양합니다. 다음으로, 냉각, 10% 글리세롤 용액, 마이크로 원심 분리기, 튜브 및 전기천공법, 얼음 냉각기의 큐벳, 냉장 대형 원심 분리기 및 마이크로 원심 분리기를 섭씨 4도까지 가열합니다. 배양 후 분광 광도계를 사용하여 배양물의 광학 밀도를 측정합니다.

흡광도 측정. 600나노미터에서. OD 600 판독값이 0.3 - 0.8에 도달하면 전기 컴피턴트 셀을 준비합니다.

배양이 준비되면 50ml 원심분리 튜브에서 세포를 스핀다운합니다. 식힌 10% 글리세롤 1ml로 세포를 씻고 다시 돌립니다. 이 세척 단계를 총 세 번 수행합니다.

총 50 μl의 부피로 세포를 재현탁시키고 10 - 200 나노그램의 재조합 플라스미드를 첨가합니다. 여러 번 위아래로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 얻은 다음 세포를 사전 냉각 electroporation으로 옮깁니다. 베트. 다음으로, VETE를 electroporation 장치에 넣고 세포를 즉시 전기 작동시켜 LB 1 밀리리터에서 세포를 복구하고 세포를 50 밀리리터 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.

섭씨 30도에서 200RPM으로 흔들면서 2시간 동안 등 배양을 성장시킵니다. 이 시간이 지나면 회수된 배양액에 9ml의 LB를 추가합니다. 섭씨 30도에서 하룻밤 동안 200RPM으로 흔들어 상동체를 삽입 카세트와 subc 클로닝 플라스미드에 통합합니다.

앞서 제조된 긴 변형 올리고를 사용하여 PCR을 수행합니다. 또는 제한 효소를 사용하여 플라스미드 템플릿을 선형화하고 PCR 증폭 영역 외부를 절단하고 활성화된 열을 갖는 템플릿을 선택합니다. 고충실도 핫 스타트, DNA 중합효소 시스템을 사용하여 PCR을 설정합니다.

PCR 마스터 믹스를 준비하고 모범 사례에 따라 열 사이클링을 수행합니다. 반응 후에, AROS 젤 전기 이동법으로 PCR 제품을 분석하십시오. 1%aros 젤에 각 PCR의 1개에서 5개의 마이크로리터를 적재하십시오.

다음으로, PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제합니다. 알려진 DNA 표준물질 세트에 대해 또는 NanoDrop 분광 광도계를 사용하여 PCR 증폭 DNA를 정량화합니다. 하룻밤 배양 후 GBAA 배양을 50배 희석하고 음성 대조군을 위한 별도의 배양을 준비합니다.

희석된 배양물을 섭씨 30도에서 200RPM으로 1시간 50분 동안 흔들면서 성장시킵니다. 다음으로, 앞에서 설명한 것처럼 모든 재조합 재료와 장비를 섭씨 4도로 냉각합니다. OSE의 부피당 10% 중량 용액을 준비하고 0.2 미크론 주사기 필터를 통해 필터를 살균합니다.

back culture의 OD가 원하는 수준에 도달하면 재조합 단백질의 유도를 진행합니다. 10% 아랍 용액 200마이크로리터를 백 배양 10밀리리터에 첨가하여 0.2%의 최종 광역 농도를 달성하고 음성 대조군으로 사용할 유도 배양액을 포함합니다. 배양물을 섭씨 37도의 진탕 인큐베이터로 옮기고 230RPM으로 진탕하면서 45분 동안 적색 발현을 유도합니다.

세포를 스핀다운하고 600-1000 나노그램에서 앞서 보여준 것처럼 10% 글리세롤로 3회 세척합니다. 재조합 반응에 대한 삽입 카세트 및 서브클로닝 플라스미드 각각은 벡터의 재조합 숙련도 및 무결성을 확인하기 위해 벡터만 및 벡터와 단일 삽입 대조군을 포함한다. 다음으로, 단일 셀 현탁액을 얻고 앞서 보여진 바와 같이 셀을 전기 작동시킵니다.

다중 복사 플라스미드의 경우 섭씨 37도의 LB 배지에서 1시간 동안, 백 벡터의 경우 섭씨 37도의 10lb 배지에서 3시간 동안 회수할 수 있습니다. 이중 선택에서 회수된 배양액으로 다양한 희석을 완료합니다. 한천은 섭씨 37도에서 16시간 동안 자라십시오.

준비가 되면 선택적 항생제가 포함된 5ml의 LB로 군체를 선택하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 자랍니다. 다음으로, 컬럼 정제 키트를 사용하여 미니 분취 DNA를 준비하고, 적절한 제한 효소를 도입한 다음, 겔 전기영동으로 예상되는 단편 크기를 포함하는 클론을 식별합니다. 마지막으로, 상동성 암과 삽입 카세트 전반에 걸쳐 DNA 염기서열분석을 수행하여 oli 광합성 오류를 확인합니다.

이 예시에서, 클론을 포함하는 P 2 RX 1 EYFP 인서트의 제한 분해 분석은 올바르게 조립된 knockin 벡터를 포함하고 있음을 나타내는 예상 패턴을 보여주었습니다. 이 회로도는 bact trimming의 개념을 보여줍니다. 서브클로닝과 PCR 산물의 삽입 분석을 사용하여 카세트가 올바르게 통합되었음을 확인했습니다.

또한, 적절한 제한 효소를 첨가한 후 양성 백 클론을 분석했을 때, 예상되는 패턴이 얻어졌습니다. 12개의 RSR 2개의 SBI 클론에 대한 제한 분해 분석은 대부분의 재조합체에서 올바른 벡터 조립을 보여주었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 sub cloning plus insertion을 사용하여 유전자 표적화 벡터를 빠르게 구성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.