CRISPR 기반 셔틀 클로닝: High-throughput 클로닝 방법

우리는 고처리량 복제 방법인 CRISPRshuttle에 대한 프로토콜에 대해 설명합니다. 여기에는 DNA 단편의 PCR 증폭 없이 벡터 간에 표적 DNA 단편을 전달하는 작업이 포함됩니다. 게이트웨이 주입 및 단일벡터 클로닝 PCR 증폭과 같은 기존 기술. 이 접근 방식에는 1차 설계 및 분비 검증을 포함한 단편별 절차가 필요합니다. 이러한 태그는 노동 집약적이고 시간이 많이 걸립니다. CRISPR 셔틀은 벡터 간 표적 DNA 단편을 순차적 시험관 반응으로 전달하는 동안 PCR을 제거합니다. 이 방법은 조각별 취급의 필요성을 능가하여 시편 구성을 가속화합니다.

[해설자] 시작하려면 화면에 표시된 시약을 결합하여 주어진 수의 분해 반응에 대한 마스터 믹스를 준비합니다. 얼음 위의 알루미늄 냉각 블록에 적절하게 라벨이 붙은 0.2밀리리터 튜브를 배열합니다. 적절한 양의 CAS9, sgRNA, 10, CAS9 완충액 및 DEPC 처리수를 혼합하여 N회 반응을 위한 마스터 믹스를 준비합니다. 마스터 믹스를 완전히 섞고 아래로 돌립니다. 3.75마이크로리터의 마스터 믹스를 각 반응 튜브에 분취합니다. 0.75마이크로리터의 0.03마이크로몰 PLX 304 ORF 플라스미드를 각 튜브에 완전히 혼합하고 튜브를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 0.14마이크로리터의 3.36마이크로몰 선형화 pBIDC-UASC-pLXvect와 1.8마이크로리터의 Gibson 어셈블리 마스터 믹스를 결합하여 마스터 믹스를 준비합니다. 마스터 믹스를 완전히 섞고 아래로 돌립니다. 이제 1.94마이크로리터의 마스터 믹스를 각 튜브에 분취합니다. 1.66마이크로리터의 CAS9 절단 플라스미드를 각 튜브에 첨가합니다. 잘 섞고 섭씨 50도에서 1시간 동안 배양합니다. 얼음 위에서 박테리아 유능 세포를 해동합니다. 해동된 세포 10마이크로리터를 미리 냉각된 각 1.5밀리리터 튜브에 분취합니다. 10마이크로리터의 유능한 세포와 1마이크로리터의 Gibson 조립 제품을 부드럽게 혼합합니다. 튜브를 얼음 위에 30분 동안 놓습니다. 튜브를 섭씨 42도에서 1분 동안 열 충격을 가한 다음 얼음 위에서 2분 동안 식힙니다. 예열된 SOC 배지 100마이크로리터를 각 튜브에 넣고 섭씨 37도에서 1시간 동안 250RPM으로 흔듭니다. 마지막으로, 세포를 클로람페니콜 밀리리터당 15마이크로그램이 들어 있는 LB 한천 플레이트에 놓고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 이 그림은 CRISPRshuttle 시스템을 사용하여 생성된 UAS-cDNA/ORF 플라스미드의 제한 분석의 대표적인 결과를 보여줍니다. 이 분석에서 PVU2를 사용한 15개의 UAS-cDNA/ORF 구조체의 제한 분해는 모든 샘플이 약 1072 염기쌍 및 1,820 염기쌍에서 예상되는 단편 패턴을 나타내는 것으로 나타났습니다.