Name: CRISPR 기반 셔틀 클로닝: High-throughput 클로닝 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: 배우세요 CRISPR 기반 셔틀 클로닝 방법으로 PCR 없이 DNA 조각을 고효율로 전달하는 고처리량 유전자 공학 기술입니다. 이 혁신적 프로토콜은 시간과 자원을 절약하며 다양한 벡터 시스템에서 유전자 조작 연구에 활용됩니다.

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<ol><li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">DNA cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).</li>
<li>Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orfeome+cloning+and+systems+biology%3A+Standardized+mass+production+of+the+parts+from+the+parts-list%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from the parts-list.</a> Genome Res. 14 (10B), 2001-2009 (2004).</li>
<li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-fusion+assembly%3A+Seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins%2C+modular+vectors%2C+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In-fusion assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li>
<li>Liu, Q., Li, M. Z., Leibham, D., Cortez, D., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+univector+plasmid-fusion+system%2C+a+method+for+rapid+construction+of+recombinant+DNA+without+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The univector plasmid-fusion system, a method for rapid construction of recombinant DNA without restriction enzymes.</a> Curr Biol. 8 (24), 1300-1309 (1998).</li>
<li>Marsischky, G., Labaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+paths+to+many+clones%3A+A+comparative+look+at+high-throughput+cloning+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Many paths to many clones: A comparative look at high-throughput cloning methods.</a> Genome Res. 14 (10b), 2020-2028 (2004).</li>
<li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA%2FORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+shuttle+cloning+of+1%2C397+human+genes+into+UAS+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based shuttle cloning of 1,397 human genes into UAS vectors.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). , (2025).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nat Methods. 8 (8), 659-661 (2011).</li>
<li>Wang, J. W., Beck, E. S., Mccabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+toolset+for+recombination+transgenesis+and+neurogenetic+analysis+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular toolset for recombination transgenesis and neurogenetic analysis of Drosophila.</a> PLoS One. 7 (7), e42102(2012).</li>
<li>Christie, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+DNA+cleavage+using+CRISPR-SpRYgests%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests.</a> Nat Biotechnol. 41 (3), 409-416 (2023).</li>
<li>Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-brick%3A+A+new+standard+for+assembly+of+biological+parts+using+Cpf1%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">C-brick: A new standard for assembly of biological parts using Cpf1.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).</li>
<li>Lei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CCTL+%28Cpf1-assisted+cutting+and+taq+DNA+ligase-assisted+ligation%29+method+for+efficient+editing+of+large+DNA+constructs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The CCTL (Cpf1-assisted cutting and taq DNA ligase-assisted ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 45 (9), e74(2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>한천 분말</td><td>켐베이스</td><td>KBS-001H</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>상곤</td><td>A600014-0100</td><td></td></tr><tr><td>자동 디지털 겔 이미지 분석 시스템</td><td>타논</td><td>타논-2500B</td><td></td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>상곤</td><td>A100230-0010</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. 젤 추출 키트</td><td>오메가</td><td>D2500-02</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. 플라스미드 DNA 미니 키트 I</td><td>오메가</td><td>D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>에코리-HF</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson 어셈블리 마스터 믹스</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 빠른 고수율 RNA 합성 키트</td><td>NEB</td><td>2050년</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA 어셈블리 마스터 믹스</td><td>NEB</td><td>E2621X</td><td></td></tr><tr><td>PCR 열 순환기</td><td>롱진</td><td>T20</td><td></td></tr><tr><td>플래티넘 슈퍼파이 II DNA 중합효소</td><td>써모 사이언티픽</td><td>12361010</td><td></td></tr><tr><td>PVUII-고폭</td><td>NEB</td><td>R3151L</td><td></td></tr><tr><td>Q5 핫 스타트 하이파이 2x 마스터 믹스</td><td>NEB</td><td>M0494</td><td></td></tr><tr><td>S. 화농성 Cas9</td><td>젠스크립트</td><td>Z03386</td><td></td></tr><tr><td>쉐이킹 인큐베이터</td><td>지추</td><td>ZQLY-180V</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>시마즈</td><td>바이오스펙-나노</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가아제</td><td>프로메가</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>Trans 10 화학적으로 유능한 세포</td><td>트랜스젠</td><td>CD101-02</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>옥소이드</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>엑스바이</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>옥소이드</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr 기반 셔틀 클로닝: high-throughput 클로닝 방법

CRISPR-based Shuttle Cloning: A High-throughput Cloning Method

우리는 CRISPRshuttle을 사용하여 초파리7에 보존된 1,397개의 인간 유전자를 포함하는 UAS-cDNA/ORF 플라스미드 컬렉션을 구축했습니다. 제한 분석에 따르면 CRISPRshuttle은 두 개의 반복 시퀀스를 포함하는 CRISPRshuttle 호환 destination vector를 사용하는 경우 94.5%의 효율에 도달하고 반복 sequence7이 없는 destination vector를 사용하는 경우 96.1%의 효율성에 도달하는 것으로 나타났습니다. 우리의 데이터는 일반적으로 두 명의 연구자가 7일 이내에 CRISPRshuttle을 통해 ~300개의 플라스미드를 생성할 수 있음을 보여주었습니다7. 성공적인 CRISPR셔틀 매개 cDNA/ORF 단편 전달은 진단 제한 분해를 통해 검증되었습니다. CRISPRshuttle 호환 목적지 벡터(pBIDC-UASC-pLXve...

CRISPR 기반 셔틀 클로닝: High-throughput 클로닝 방법

The development of genome-wide plasmid libraries using existing genomic repositories serves as a pivotal prerequisite for systematic functional ...

우리는 고처리량 복제 방법인 CRISPRshuttle에 대한 프로토콜에 대해 설명합니다. 여기에는 DNA 단편의 PCR 증폭 없이 벡터 간에 표적 DNA 단편을 전달하는 작업이 포함됩니다. 게이트웨이 주입 및 단일벡터 클로닝 PCR 증폭과 같은 기존 기술. 이 접근 방식에는 1차 설계 및 분비 검증을 포함한 단편별 절차가 필요합니다. 이러한 태그는 노동 집약적이고 시간이 많이 걸립니다. CRISPR 셔틀은 벡터 간 표적 DNA 단편을 순차적 시험관 반응으로 전달하는 동안 PCR을 제거합니다. 이 방법은 조각별 취급의 필요성을 능가하여 시편 구성을 가속화합니다.[해설자] 시작하려면 화면에 표시된 시약을 결합하여 주어진 수의 분해 반응에 대한 마스터 믹스를 준비합니다. 얼음 위의 알루미늄 냉각 블록에 적절하게 라벨이 붙은 0.2밀리리터 튜브를 배열합니다. 적절한 양의 CAS9, sgRNA, 10, CAS9 완충액 및 DEPC 처리수를 혼합하여 N회 반응을 위한 마스터 믹스를 준비합니다. 마스터 믹스를 완전히 섞고 아래로 돌립니다. 3.75마이크로리터의 마스터 믹스를 각 반응 튜브에 분취합니다. 0.75마이크로리터의 0.03마이크로몰 PLX 304 ORF 플라스미드를 각 튜브에 완전히 혼합하고 튜브를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 0.14마이크로리터의 3.36마이크로몰 선형화 pBIDC-UASC-pLXvect와 1.8마이크로리터의 Gibson 어셈블리 마스터 믹스를 결합하여 마스터 믹스를 준비합니다. 마스터 믹스를 완전히 섞고 아래로 돌립니다. 이제 1.94마이크로리터의 마스터 믹스를 각 튜브에 분취합니다. 1.66마이크로리터의 CAS9 절단 플라스미드를 각 튜브에 첨가합니다. 잘 섞고 섭씨 50도에서 1시간 동안 배양합니다. 얼음 위에서 박테리아 유능 세포를 해동합니다. 해동된 세포 10마이크로리터를 미리 냉각된 각 1.5밀리리터 튜브에 분취합니다. 10마이크로리터의 유능한 세포와 1마이크로리터의 Gibson 조립 제품을 부드럽게 혼합합니다. 튜브를 얼음 위에 30분 동안 놓습니다. 튜브를 섭씨 42도에서 1분 동안 열 충격을 가한 다음 얼음 위에서 2분 동안 식힙니다. 예열된 SOC 배지 100마이크로리터를 각 튜브에 넣고 섭씨 37도에서 1시간 동안 250RPM으로 흔듭니다. 마지막으로, 세포를 클로람페니콜 밀리리터당 15마이크로그램이 들어 있는 LB 한천 플레이트에 놓고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 이 그림은 CRISPRshuttle 시스템을 사용하여 생성된 UAS-cDNA/ORF 플라스미드의 제한 분석의 대표적인 결과를 보여줍니다. 이 분석에서 PVU2를 사용한 15개의 UAS-cDNA/ORF 구조체의 제한 분해는 모든 샘플이 약 1072 염기쌍 및 1,820 염기쌍에서 예상되는 단편 패턴을 나타내는 것으로 나타났습니다.

crispr-based-shuttle-cloning-a-high-throughput-cloning-method

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

유전자 표적화 방법론을 사용하여 knockout, knock-in 및 tagged 대립유전자가 있는 형질전환 마우스를 생성할 수 있습니다.  여기에서는 E. coli에서 재조합하는 개선된 방법, 즉 'subcloning plus insertion'이라고 하는 재조합 방법을 설명하며, 이는 맞춤형 유전자 표적화 벡터를 빠르게 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

서브 클로닝 플러스 삽입 (SPI) - 유전자 타겟팅 벡터의 신속한 건설 소설 Recombineering 방법

DNA 조립체를 사용하여, 여러 CRISPR 벡터가 CRISPR 다수의 구성을 하나 복제 반응에 병렬로 구성 될 수있는 간단한 작업 벡터. 토마토 털이 뿌리는 CRISPR 경로를 확인하고 돌연변이 물질을 생성 할 수있는 훌륭한 모델 시스템입니다.

토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성

형광 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 겔 전기 영동, 모세관에 결합 여기에 설명 된 기술 유전자형은 뉴 클레아 제 매개 녹아웃 클론의 높은 처리량 유전자형을 허용한다. 그것은 다른 유전자형 기술에 의해 직면 한 한계를 우회하고 시퀀싱 방법보다 더 비용 효과적입니다.

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 기술을 사용하여 다중 유전자 녹아웃을 만드는 데 사용되는 하나의 가이드 RNA concatemer 벡터에 여러 단일 가이드 RNA를 복제하는 단계를 설명합니다. 장 organoids에 이중 knockouts의 생성은이 방법의 가능한 응용 프로그램으로 표시됩니다.

CRISPR-concatemer를 이용한 마우스 작은 창자 organoids에서 다중 유전자 녹아웃을위한 프로토콜

여기, 간단 하 고, 효율적인, 그리고 sgRNA 복제의 비용 효율적인 방법 설명입니다.

CRISPR 가이드 RNA 포유류 시스템 복제

이 원고에서 급성 골수성 백혈병 (AML) 세포 증식에 여러 후보 유전자의 역할의 간단 하 고 신속 하 게 조사에 대 한 클러스터 정기적으로 Interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) CRISPR-Cas9-기반 방법을 설명 합니다. 병렬입니다. 이 기술은 확장성 이며 다른 암 세포 라인에 적용 될 수 있습니다.

CRISPR-Cas9-기반 경쟁 분석 실험을 사용 하 여 유전 종속성의 조사

이 프로토콜은 음향 액적 배출 기술을 사용하여 384 웰 플레이트에서 포유류 세포의 고처리량 플라스미드 형질 감염을 설명합니다. 시간이 많이 소요되고 오류가 발생하기 쉬운 DNA 디스펜싱과 트랜스펙션 시약 디스펜싱은 나노 에스터디터 장치에 의해 소프트웨어 구동 및 수행됩니다. 세포는 다음 이 미리 채워진 우물에서 파종됩니다.

음향 나노 디스펜싱 기술을 사용한 고처리량 DNA 플라스미드 멀티플렉싱 및 트랜스펙션

이 프로토콜은 인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 이형 이형 또는 동형접합 뉴클레오티드 변화의 생성을 용이하게 하는 방법을 제공한다.

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

CRISPR-Cas 시스템과 anti-CRISPR 단백질은 Saccharomyces cerevisiae의 부울 게이트 체계에 통합되었습니다. 새로운 소형 논리 회로는 우수한 성능을 보였으며 dCas9/dCas12a 기반 전사 인자와 항-CRISPR 단백질의 특성에 대한 이해를 심화시켰습니다.

CRISPR-Cas 시스템 및 Anti-CRISPR 단백질을 기반으로 하는 유전자 디지털 회로

공개적으로 사용 가능한 cDNA/ORF 리소스를 사용하여 Drosophila 에서 UAS-cDNA/ORF 플라스미드 라이브러리의 고처리량 구축 방법인 CRISPR-based modular assembly (CRISPRmass)를 위한 프로토콜을 제시합니다. CRISPRmass는 다양한 플라스미드 라이브러리 편집에 적용할 수 있습니다.

UAS-cDNA/ORF Plasmid Library의 고처리량 구축을 위한 CRISPR-based Modular Assembly

THP-1 세포주는 다양한 생물학 관련 연구 분야에서 인간 단핵구/대식세포의 기능을 조사하기 위한 모델로 널리 사용됩니다. 이 논문에서는 효율적인 CRISPR-Cas9 기반 엔지니어링 및 단일 세포 클론 분리를 위한 프로토콜에 대해 설명하여 강력하고 재현 가능한 표현형 데이터를 생성할 수 있습니다.

THP-1 세포의 전기천공법 기반 CRISPR-Cas9 매개 유전자 녹아웃 및 단일 세포 클론 분리

배우세요 CRISPR 기반 셔틀 클로닝 방법으로 PCR 없이 DNA 조각을 고효율로 전달하는 고처리량 유전자 공학 기술입니다. 이 혁신적 프로토콜은 시간과 자원을 절약하며 다양한 벡터 시스템에서 유전자 조작 연구에 활용됩니다.

CRISPR 기반 셔틀 클로닝: High-throughput 클로닝 방법

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