적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

이 분석의 전반적인 목표는 비방사성 프로브를 사용하여 단백질-DNA 상호 작용을 검출하는 것입니다. 이 방법은 단백질의 DNA 표적 염기서열 결정과 같은 분자 생물학 및 생화학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 방사성 프로브를 사용하는 것보다 쉽고 안전하며 시간을 절약할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 미니 단백질 겔 시스템을 사용하여 0.5x 트리스 보레이트 EDTA 또는 TBE와 2.5% 글리세롤을 포함하는 5% 천연 폴리아크릴아미드 겔을 준비합니다. 4개의 겔을 위한 30ml의 겔 용액을 준비하려면 증류수, TBE, 과황산암모늄, TEMED, 아크릴아미드 비스 및 글리세롤을 혼합합니다. 젤 용액을 즉시 통과시키십시오.

중합 후 0.5x TBE로 미리 적신 투명 플라스틱 랩으로 겔을 감싸고 섭씨 4도에서 보관합니다. 다음으로, 약 51개의 mers에 대한 긴 올리고뉴클레오티드를 설계합니다. 5개의 프라임 말단에서 적외선 형광 염료 변형을 사용하여 약 14개의 mers에 대한 보완적인 짧은 올리고뉴클레오티드를 설계합니다.

올리고뉴클레오티드가 준비되면 1x Tris-EDTA 완충액에 최종 농도 100마이크로몰까지 재현탁합니다. 어닐링을 위해 1.5 밀리리터 튜브에 0.6 마이크로 리터의 5 프라임 염료 짧은 올리고 뉴클레오티드, 1.2 마이크로 리터의 긴 올리고 뉴클레오티드 및 28.2 마이크로 리터의 염화나트륨 트리스 -EDTA 완충액을 혼합합니다. 튜브를 끓는 물에 5분 동안 넣은 다음 열원을 끄고 어닐링된 올리고뉴클레오티드가 든 물을 어둠 속에서 밤새 식힙니다.

이중 가닥 DNA 프로브를 만들려면 30마이크로리터의 어닐링된 올리고뉴클레오타이드를 DNTP, Klenow 버퍼, Klenow five prime 염료 태그 및 이중 증류수와 0.2ml PCR 튜브에 혼합합니다. PCR 기계에서 섭씨 37도에서 60분 동안 혼합물을 배양합니다. 그런 다음 3.4마이크로리터의 0.5몰 EDTA를 첨가하여 반응을 중지하고 PCR 기계에서 섭씨 75도에서 20분 동안 불활성화를 가열합니다.

그 후, 채워진 프로브를 염화나트륨 트리스 -EDTA 완충액으로 희석하여 최종 농도 0.1 마이크로 몰로 희석한다. 올리고뉴클레오티드는 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 20도의 어두운 곳에 보관하십시오. 표지되지 않은 프로브를 준비하려면 20 밀리리터 튜브에 1.5 마이크로 리터의 긴 올리고 뉴클레오티드, 20 마이크로 리터의 Long R 올리고 뉴클레오티드 및 60 마이크로 리터의 염화나트륨 Tris-EDTA 완충액을 혼합합니다.

튜브를 끓는 물에 5분 동안 넣은 다음 열원을 끄고 어닐링된 올리고가 있는 물을 밤새 식힙니다. Tris HCl, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, EDTA, DTT, BSA 및 이중 증류수를 혼합하여 5x 결합 완충액 1ml를 준비합니다. 결합 반응을 설정하기 전에 0.5x TBE 및 2.5% 글리세롤에 5% 천연 폴리아크릴아미드 겔을 사전 실행하여 80볼트에서 30분에서 1시간 동안 또는 전류가 더 이상 시간에 따라 변하지 않을 때까지 과황산암모늄의 모든 흔적을 제거합니다.

다음으로, 4마이크로리터의 5x 결합 완충액, 80-200나노그램의 정제 단백질 A, 1마이크로리터의 0.1마이크로몰 염료 접합 프로브 및 이중 증류수를 혼합합니다. 혼합물을 실온에서 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후 모든 결합 반응을 겔에 로드하고 원하는 거리까지 센티미터당 10볼트로 겔을 실행합니다.

젤 장치를 알루미늄으로 덮어 젤을 가능한 한 어두운 곳에 두십시오. 적외선 이미징 시스템의 스캐너 베드를 증류수로 청소합니다. 젤이 들어 있는 유리판을 닦아내고 스캐너 베드에 놓습니다.

적외선 이미징 소프트웨어를 열고 획득 탭을 클릭합니다. 더 두꺼운 플레이트의 경우 채널은 700, 강도는 자동, 해상도는 84마이크로미터, 품질은 중간, 초점 오프셋은 3.5mm 설정을 사용합니다. 스캐너에서 젤이 차지하는 영역을 선택합니다.

마지막으로 시작을 클릭하여 스캔을 시작합니다. 전기영동의 진행 상황은 Orange G loading dye로 시각화할 수 있는 반면, Bromophenol blue는 스캔 중에 감지되어 이미지 분석을 방해합니다. 결합 반응에 dI-dC를 추가하면 정제된 6xHis-SOX-2와 5개의 프라임 염료 DNA 프로브의 결합이 폐

LIM-4 결합 부위에서 돌연변이가 발생한 LIM-4 돌연변이 및 SOX-2 콜드 프로브는 6xHis-SOX-2에 결합하기 위해 적외선 형광 염료 표지 프로브와 경쟁하는 야생형 콜드 프로브만큼 효율적입니다. 그러나 SOX-2 결합 부위에서 돌연변이된 LIM-4 및 SOX-2 돌연변이 콜드 프로브의 경쟁 효율은 6xHis-SOX-2에 결합하기 위한 야생형 콜드 프로브보다 훨씬 낮습니다. 6xHis와 플래그 에피토프를 사용한 SOX-2 DNA 복합체의 초이동(supershift) 분석은 초편이된 SOX-2 DNA 띠를 생성했습니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행되면 2-4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 적외선 프로브를 어두운 곳에 보관하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 특정 DNA 결합 염기서열의 중요성과 같은 추가 질문에 답하기 위해 CRISPR cas9 게놈 편집과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 생화학 분야의 연구자들이 다양한 모델 유기체에서 단백질-DNA 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 비방사성 DNA 표지를 사용하여 단백질-DNA 상호 작용을 결정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 아크릴아마이드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장비와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.