Name: 적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 학습하세요 적외선 형광 염료를 사용한 비방사성 전기 영동 이동성 시프트 분석법으로 SOX-2 단백질과 DNA의 상호작용을 안전하게 검출하는 방법을. 이 기술은 분자생물학 연구에 효율적입니다.

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이 연구는 Alfred P. Sloan Research Fellowship(C.-F.C.로)과 NIH R01 보조금(5R01GM098026-05에서 C.-F.C.)의 지원을 받았습니다. 고급 적외선 이미징 시스템을 사용해 주신 David Crowe에게 감사드립니다.

주 : 형광 표지 된 DNA 프로브 또는 표지 된 DNA의 다른 형태를 사용 EMSAs 단백질 또는 세포 추출물 제제, 단백질 DNA 결합 반응, 및 PAGE 겔 제제 및 실행 (도 1a)에 대해 동일한 프로토콜을 공유한다. 키 차이는 DNA 라벨 절차 후 실행 겔 처리 단계, 및 검출 방법이다. 1. 젤 준비 <ol><li> 미니 단백질 겔 시스템 (8.3 cm 폭 X 7.3 cm 길이 X 0.75 mm 두께)를 사용하여, 0.5 배의 TBE (45 mM 트리스 - 보레이트, 1 mM의 EDTA) 2.5 % 글리세롤을 함유하는 5 %의 천연 폴리 아크릴 아미드 겔을 제조. <ol><li> 아크릴 아미드 / 비스 4 겔에 대한 겔 용액 30 ㎖를 제조 30 % 5 mL를 혼합하는 (37.5 : 1), 3 배 TBE (0.45 M 트리스 - 보레이트, 10 mM의 EDTA), 50 %, 1.5 mL의 글리세롤 ㎖, 10 % 황산 암모늄 300 μL, TEMED 15 μL, 철저하게 DDH 2 O의 20.2 mL를. 참고 : 아크릴 아미드는 유해 및 독성, 적절한 개인 보호 장비를 처리합니다. </l난&gt; </ol></li><li> 즉시 겔 용액 캐스트. 중합 후, 투명한 플라스틱 랩 0.5 배의 TBE에 미리 적셔에 젤을 포장하고 4 ℃에서 저장합니다. </li></ol> 적외선 형광 염료 표지 된 프로브 2. 준비 참고 : 준비, 저장 및 실험하는 동안 멀리 가능한 한 많은 빛의 적외선 형광 염료 표지 올리고 뉴클레오티드를 유지합니다. <ol><li> 디자인 및 주문 올리고 뉴클레오티드. <ol><li> ~ 51 머 위해 긴 올리고 뉴클레오티드를 디자인합니다. 참고 : LIM-4 / SOX-2 프로브의 긴 올리고 뉴클레오티드 시퀀스는 TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC입니다. 긴 올리고 뉴클레오티드는 페이지 또는 HPLC 정화가 필요하지 않습니다. </li><li> 5 &#39;말단 (5&#39;Dye) 37 ℃ 이상의 용융 온도에서 적외선 형광 염료 변형 ~ 14 머에 대해 상보적인 짧은 올리고 뉴클레오티드를 설계한다. 참고 :의 짧은 올리고 뉴클레오티드 서열 LIM-4 / SOX-이 프로브는 5&#39;Dye-GGGAGAAGATTTTG이다. 5&#39;Dye 표지 짧은 올리고 뉴클레오티드의 최소 합성 규모는 100 ㎚이다. 따라서, 올리고 뉴클레오티드는 HPLC 정화를 필요로한다. </li></ol></li><li> 100 μM의 최종 농도; (1 mM의 EDTA 10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0 TE) 1X 트리스 - EDTA 버퍼에 재현 탁 올리고 뉴클레오티드. </li><li> 어닐링 짧은 (5&#39;Dye) 및 긴 올리고 뉴클레오티드. <ol><li> 0.6 5&#39;Dye - 짧은 올리고 (100 μM)의 μL, 긴 올리고 (100 μM)의 1.2 μL, 나트륨의 28.2 μL 염화 트리스 - EDTA 버퍼를 (혼합 STE : 100 mM의 NaCl을 10 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0, 1 mM의 EDTA) 1.5 mL의 관이다. </li><li> 5 분 동안 끓는 물에 튜브를 놓습니다. 열원을 끄고 어닐링 올리고 어둠 속에서 O / N를 냉각과 물을 수 있습니다. </li></ol></li><li> 이중 가닥 DNA 프로브를 만들기 위해 클레 나우 DNA 중합 효소와 어닐링 5&#39;Dye - 짧은 / 긴 올리고의 5 &#39;오버행를 입력합니다. <ol><li> 혼합하여 반응 준비5&#39;Dye 태그 어닐링 짧은 / 긴 올리고 30 μL, 8.5 μL의 10 배 클레 나우 버퍼, 10 밀리미터의 dNTPs 1.7 μL, 1.7 클레 나우의 μL (3 &#39;-&gt; 5&#39;엑소) (5 U / μL), 및 0.2 ㎖의 PCR 용 튜브의 DDH 2 O 43.1 μL. </li><li> PCR의 기계에서 37 ° C에서 60 분을 품어. </li><li> PCR의 기계에서 20 분 동안 75 ° C에서 반응과 열을 비활성화를 중지 3.4 μL 0.5 M EDTA를 추가합니다. </li></ol></li><li> 0.1 μM의 최종 농도 인트 기입 된 프로브 (0.7 μM)를 희석. </li><li> 준비가 될 때까지 어둠 속에서 -20 ° C에서 보관 올리고는 사용할 수 있습니다. 올리고이 조건에서 최대 1 년 동안 저장 될 수있다. 참고 : 돌연변이 결합 부위와 DNA 프로브를 생성하기는 긴 올리고 뉴클레오티드의 돌연변이 버전은 클레 나우 5 &#39;오버행의 필인 다음 5&#39;Dye 표지 짧은 올리고 뉴클레오티드로 어닐링된다. 하나의 가닥 프로브 적외선 형광 표지 것으로 밝혀졌다염료는 염료로 표지 된 두 가닥 프로브의 30 %의 강도를 갖는다. 신호 강도가 강화 될 필요가 있다면, 두 가닥의 긴 올리고 5 &#39;말단에서 적외 형광 염료로 표지 및 적외 형광 염료 - 표지 된 탐침을 만들기 위해 어닐링된다. </li></ol> 레이블이없는 / 콜드 프로브 3. 준비 (경쟁자) 주 : 상보 시퀀스 (길고 LongR)의 긴 올리고 뉴클레오티드 적외 형광 염료가 표지 된 프로브와의 경쟁 분석을위한 표지 된 프로브를 만들기 위해 어닐링 하였다. <ol><li> 1.5 mL의 튜브에 100 μM 긴 20 μL, 100 μM LongR 올리고 뉴클레오티드의 20 μL 및 STE의 60 μL를 섞는다. </li><li> 5 분 동안 끓는 물에 튜브를 배치 열원을 끄고 어닐링 된 올리고 밤새 냉각하여 물을 보자. </li></ol> 4. 바인딩 반응 및 전기 영동 <ol><li> 50 μL를 혼합하여 5 배 결합 완충액 1 mL의 준비60, 1 M 트리스 염산, pH가 7.5; 5 M NaCl을 10 μL; 1 M KCl을, 1 M의 MgCl 2의 5 μL, 200 μL, 0.5 M EDTA 10 μL, 8.0의 pH; 1 M DTT의 5 μL; DDH 2 O. 25 10 ㎎ / ㎖의 BSA의 μL 및 695 μL 주 : 배 결합 완충액을 분취하고 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 고려해야 할 또 다른 점은 다른 전사 인자가 결합 버퍼에 다른 수정을 것입니다. </li><li> 오른쪽 결합 반응을 설정하기 전에, 30, 80 V에서 황산 암모늄의 흔적을 제거하기 위해 + 2.5 % 글리세롤 0.5 배의 TBE에서 5 % 네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔을 미리 실행되지 - 60 분 또는 전류는 더 이상 시간에 따라 변화 할 때까지. </li><li> 20 μL의 최종 부피의 결합 반응을 설정합니다. <ol><li> 4 배의 결합 완충액 μL 80 믹스 - 정제 된 단백질 A를 ng를 200 (즉, 50 % 글리세롤 SOX-2), 0.1 μM 염료 공액 프로브 1 μL (최종 농entration : 5 ㎚), 및 DDH 2 O. </li><li> 선택 사항 : 차가운 프로브 경쟁이 필요한 경우, 다양한 농도 감기 프로브 (배, 10 배, 25 배, 50 배, 100 배, 등)를 추가합니다. </li><li> 선택적 : 단백질 A와 B 사이의 상호 작용 (즉, SOX-2 및 LIM-4)를 시험 할 때 80 추가 - 정제 된 단백질 B 겨 (200) (즉, 50 % 글리세롤, LIM-4). </li><li> 옵션 : 핵 추출물 준비를 사용하고 유효성을 검사 할 수있다 단백질 A의 특이 적 결합하면 단백질 A (즉, 안티 6xHis, 안티 - FLAG 등)에 대한 특이 항체를 추가합니다. </li><li> 15 분 동안 어둠 속에서 R / T에 품어. </li></ol></li><li> 겔에 결합 반응 모두를로드하고 원하는 거리 10 V / cm에서 젤을 실행합니다. </li></ol> 5. 이미지 주 : 겔 진보 적외선 이미징 시스템을 유리판에 직접 주사 하였다. 따라서, 상기 겔이 해결 될 수 있고 반복적으로 스캔 (도 1C 및 <st룽&gt; 2). 주로 웨스턴 블랏을위한 근 적외 형광 영상 시스템은 또한 겔을 검사하기 위해 테스트 하였다 있지만 고급 적외선 이미징 시스템은 양호한 해상도를 갖는 겔을 검사 할 수 있었다. 다른 소프트웨어 패키지가 이용 될 수 있지만, 기술 된 방법은 특정 적외선 이미지 소프트웨어에 고유하다. <ol><li> DDH 2 O와 스캐너의 침대를 청소하고 스캔하기 전에 잘 건조. 겔의 유리판을 건조 닦아 스캐너 침대에 젤을 포함하는 판을 배치합니다. </li><li> 적외선 이미징 소프트웨어를 열고 &#39;획득&#39;탭으로 이동합니다. 얇은 판 (1 mm)가 스캐너 침대에 배치되면, 채널의 설정을 사용 : 700, 밝기 : 자동, 해상도 : 169 μm의 품질 : 중간, 그리고 초점 오프셋 (offset) : 1.5 mm입니다. 두꺼운 판 (3 mm)가 스캐너 침대에 배치되면, 채널의 설정을 사용 : 700, 밝기 : 자동, 해상도 : 84 μm의 품질 : 중간, 그리고 초점 오프셋 (offset) : 3.5 mm. 오프셋 초점은에 따라 달라집니다유리판의 두께. </li><li> 젤 스캐너에 차지하는 영역을 선택합니다. 스캔을 시작하려면 &#39;시작&#39;을 클릭합니다. </li><li> 전기 영동을 반복하고 추가로 필요한 검사합니다. </li></ol>

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</ol>

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fEMSAs 단백질-DNA의 상호 작용을 조사 할 수있는 효율적인 수단이고, DNA의 방사성 표지에 대한 대안이다. 적외선 염료, 형광 염료는 시판되고 있으며, 방사성 표지 DNA와 비교하여 친환경 안전하고 방법을 제공한다. 적외 형광 염료 - 표지 된 올리고 뉴클레오티드를 사용 EMSAs는 postrun 겔 공정 단계를 필요로하므로 다른 DNA 라벨링 기술에 비해 시간과 비용을 저장하지 않는다. 시간은 방사성 EMSAs을 사용 대역 1 테스트 DNA 프로브 방사능 농도에 따라, 30 분 내지 수일의 범위 검출한다. 반대로 fEMSA 겔 스캐닝함으로써 상당히 프로토콜 시간을 단축 평균 25 분에 걸린다. 겔 분석 유리판으로부터 제거 할 필요가 없기 때문에 fEMSAs 또한 방사성 표지 비해 상당한 이점을 제공한다. 초기 실행 시간이 충분하지 않은 경우에 겔이 다시 검사 될 수 있도록단백질-DNA 복합체를 해결합니다. 전기 영동을 연장 할 수있는 옵션은 방사성 동위 원소 또는 바이오틴 / 스트렙 타비 딘을 사...

EMSAs은 목적 단백질과 단백질의 하나의 잠재적 표적 부위를 함유하는 표지 된 DNA 프로브의 혼합물을 해결하기 위해 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동 네이티브 (PAGE)을 이용하여 DNA와 단백질 사이의 상호 작용을 분석하는데 사용된다. 단백질과 결합 된 DNA 프로브는 느린 무료 DNA 프로브와 비교하고, 폴리 아크릴 아미드 매트릭스를 통해 자사의 이동에 따라서 지각 마이그레이션합니다. (32) P에 의해 DNA의 방사성 표지는 EMSAs의 검출을위한 주된 방법이었다. 생화학 적 연구에서의 방사선의 적용이 유용 하였지만, 유사한 감도 대안 DNA 라벨링 방법 인해 방사선 처리와 연관된 건강 및 안전 위험에 채용되고있다. 이러한 대안적인 방법은 바이오틴이 나 디그 옥시 제닌 (DIG) 3 (둘 다음 화학 발광 시스템에 의해 검출된다)와 DNA의 결합은 PAGE 겔 (4)의 SYBR 그린 염색법 포함또는 겔 5,6-를 스캔하여 DNA 형광 염료 접합체 직접 검출. 방사성 표지 된 DNA 프로브를 사용 EMSAs의 해결 겔 postrun자가 방사선 필름을 통해 처리 또는 방사성 1,7- 신호를 검출하는은 phosphorimager 시스템을 필요로한다. 바이오틴 2 DIG-복합 3 DNA 프로브를 사용하여 EMSAs의 젤도 처리하고 적절한 막에 전사 한 후 화학 발광 (6)에 의해 감지해야합니다. 겔의 SYBR 녹색 염색 postrun 젤 염색 및 형광 스캐너 (4)이 필요합니다. postrun 겔 처리 단계가 이러한 DNA 라벨링 기술을 사용 EMSAs 필요하기 때문에, 겔을 해결 한 번만 분석 될 수있다. 대조적으로, 형광 표지 DNA 프로브에 직접 스캐너에 의해 유리판 내부 겔에서 검출 될 수있다. 따라서, DNA - 단백질 상호 작용을 모니터링 할 수 있고, 실행시에 다른 시점에서 여러 번 분석하는크게 시간과 비용을 줄일 수 있습니다. EMSAs에 사용 된 DNA 형광 염료 접합체를 Cy3 6,8-, 6,8- Cy5에, 형광 9 및 적외 형광 염료 4-6을 포함한다. 전사 조절은 전사 인자와 그 표적 유전자의 단백질 DNA 상호 작용을 필요로한다. 이러한 상호 작용의 조정 동물 개발하는 동안 공통 조상에서 다양한 세포 유형을 생성합니다. 순방향 바이어스되지 유전 화면 Caenorhabditis 엘레 간스 전사 인자 SOX-2의 고도로 보존 된 HMG-DNA 결합 도메인, 과오 돌연변이 G73E 식별. 분자 형태 및 기능 수준 5, 10에 AWC 후각 신경 세포에 AWB 후각 신경 세포의 정체성 변화의 돌연변이 결과. SOX-2 차동 문맥 의존적 파트너 전사 인자와 함께 각각 상호 작용하여 AWB 및 AWC 뉴런의 말단 분화를 조절DNA의 표적 부위 5,10. SOX-2 터미널 AWB 신경 세포 분화에 LIM-4 (LHX) 파트너, SOX-2 터미널 AWC 신경 세포 분화에 CEH-36 (OTX / OTD)와 파트너. 루시 페라 제 기자의 분석은 표시하면서 그 SOX-2 및 돌연변이 SOX-2 G73E 단백질은 AWB 및 AWC 신경 세포에서 발현 프로모터를 활성화하는 전사 보조 인자 LIM-4 및 CEH-36와 협력의 상호 작용을 가지고있다. 그러나, SOX-2 및 돌연변이 SOX-2 G73E는 프로모터의 차동 활성화 속성을 표시. SOX-2 및 SOX-2 G73E의 차동 DNA 바인딩 활동의 분자 기초를 조사하기 위해, fEMSAs이 단백질과 잠재적 인 대상 사이트와 수행 하였다. 먼저, 생물 정보학 방법은 루시퍼 라제 분석에 사용 1킬로바이트 프로모터 영역 내의 서열 결합 생물학적 관련 DNA를 식별 하였다. 여러 잠재적 인 SOX-2 결합 부위가 프로모터에 걸쳐 존재하기 때문에, 우리는 집중추정 CEH-36 또는 LIM-4 결합 부위에 인접 진화 다양한 선충 종 사이 보존 예측 SOX-2 결합 부위에. 이 시퀀스는 삭제 또는 돌연변이, 이후 AWB 또는 AWC 뉴런에 GFP 리포터 유전자를 표현하는 그들의 활동에 대한 생체 내에서 시험 하였다. 이 방법을 통해, 우리는 구체적으로 AWB 및 AWC 뉴런, 각각 5 GFP의 발현에 필요한 LIM-4 / SOX-2 전위와 CEH-36 / SOX-2 인접한 타겟 사이트를 확인했다. 우리는 SOX-2 및 SOX-2 LIM-4 / SOX-2 식별 CEH-36 / SOX-2 인접한 타겟 사이트와 fEMSA를 사용 G73E의 결합 DNA의 잠재적 인 차이를 조사 하였다. 우리 EMSA 분석 SOX -2- G73E가 효율적 WT SOX-2처럼 (AWB의 유전자 발현에 필요한)를 LIM-4 / SOX -2- 인접한 표적 부위를 포함하는 DNA 프로브에 결합하지 않았 음을 보여 주었다. 그러나, SOX-2, SOX-2 G73E가 포함 된 DNA 프로브를 바인딩에 차이가 있었다없는 CEH-36 / SOX-25, 10 (AWC의 유전자 발현에 필요) djacent 대상 사이트. 우리 fEMSA는 AWB - 투 - AWC 세포의 정체성 변환 표현형에 대한 특정 DNA 결합 활성에 영향을 미치는의 SOX-2 G73E 돌연변이의 성격에 기계적인 통찰력을 제공 분석한다. 여기, 우리는 정제 6xHis-SOX-2 또는 6xHis-SOX-2 해결하기 위해 사례 연구로 LIM-4 / SOX-2 인접 대상 사이트를 포함하는 적외선 형광 염료 표지 DNA 프로브와 함께 G73E를 사용 fEMSA의 최적화 된 프로토콜을 설명 중요한 생물학적 질문입니다.

<table><tbody><tr><td>30% 아크릴아미드/비스 용액, 37.5:1&nbsp;</td><td>바이오 라드</td><td>1610158</td><td>아크릴아마이드는 유해하고 독성이 있습니다.</td></tr><tr><td>6x-HIS 에피토프 태그 항체(HIS. H8)</td><td>ThermoFisher</td><td>MA1-21315</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Flag M2 항체&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA) 분자 생물학 등급</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>5'IRDye700 표지 DNA 올리고</td><td>통합 DNA 기술</td><td>맞춤형 DNA 올리고</td><td>원고에서는 이를 "5' 염료 표지 또는 적외선 형광 염료 표지 DNA 올리고"라고 합니다. 이 회사는 5' IRDye 표지 DNA 올리고뉴클레오티드를 맞춤 합성할 것입니다. 최소 100이 필요합니다&nbsp; &뮤; M 스케일 합성 및 HPLC 정제.</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'-->5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>LightShif Poly (dI-dC)</td><td>ThermoFisher</td><td>20148E</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp; 수직 전기영동 셀&nbsp;</td><td>바이오-라드</td><td>1658000FC&nbsp;</td><td>이를 원고에서는 '미니 단백질 겔 시스템(mini protein gel system)'이라고 부른다. 모든 전기 영동 시스템은 크기가 25cm x 25cm 미만인 투명 유리판인 한 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Odyssey CLx 적외선 이미징 시스템</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Odyssey CLx 적외선 이미징 시스템</td><td>이것은 원고에서 '고급 적외선 이미징 시스템'이라고 합니다.</td></tr><tr><td>오디세이 FC 이미징 시스템&nbsp;</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System</td><td>원고에서는 '주로 서양 블롯을 위한 근적외선 형광 이미징 시스템'이라고 합니다.</td></tr><tr><td>Image Studio 소프트웨어 (버전 4.0)</td><td>LI-COR Biotechnology</td><td>Image Studio 소프트웨어&nbsp;</td><td>이를 원고에서는 '특정 이미징 소프트웨어'라고 합니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>오렌지 G</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>O3756-25G</td><td></td></tr><tr><td>6x 오렌지 로딩 염료</td><td></td><td></td><td>0.25 % 오렌지 G; 30 % 글리세롤</td></tr><tr><td>0.5x TBE</td><td></td><td></td><td>45 mM 트리스 - 붕산염; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x TE</td><td></td><td></td><td>10 mM 트리스 -HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>1x STE</td><td></td><td></td><td>100 mM NaCl; 10 m M 트리스 -HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA</td></tr><tr><td>5x 바인딩 버퍼</td><td></td><td></td><td>50mM 트리스-HCl, pH 7.5; 50mM 염화나트륨; 200 mM KCl; 5mM MgCl<서브>2</서브>; 5mM EDTA, pH 8.0; 5mM DTT; 250 &#956; g/mL BSA</td></tr></tbody></table>

적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

전기 영동 이동성 이동 분석 (EMSA)는 단백질과 타겟 DNA 서열 사이의 상호 작용을 특성화하기위한 수단 도구입니다. 방사능은 EMSAs의 DNA 라벨의 주된 방법이었다. 그러나, 형광 염료 및 검사 방법의 최근 발전은, 시간을 절약 비용을 절감하고, 안전성을 향상 취급 용이성의 이점에 대한 방사능의 대안으로 DNA의 형광 태그의 사용을 자극했다. 우리는 최근 성공적으로 중요한 생물학적 문제를 해결하기 위해 형광 EMSA (fEMSA)을 사용했다. 우리 fEMSA 분석은 매우 보존 HMG 전사 인자의 SOX-2 후각 신경 세포 유형의 다양 화에에서는, 과오 돌연변이, G73E의 효과에 기계적인 통찰력을 제공합니다. 우리는 돌연변이 SOX-2 G73E 단백질함으로써 후각 신경 세포 정체성 변환을 일으키는 특정 DNA 결합 활성을 변경 한 것으로 나타났습니다. 여기서는 현재 최적화 단계별 프로토콜 경제적fEMSA 생물학적 예와 LIM-4 / SOX -2- 인접한 타겟 사이트 정제 SOX-2 단백질 (WT 및 돌연변이 SOX G73E-2 단백질)을 함유하는 적외 형광 염료 - 표지 된 올리고 뉴클레오티드를 사용.

오렌지 G 로딩 염료 (6 배 : 100 mL의 30 % 글리세롤에서 0.12 g 오렌지 G)는 전기의 진행 상황을 시각화로드되기 전에 결합 반응에 추가 할 수 있습니다. 브로 모 페놀 블루 등 기타 적재 염료 스캔 중에 감지하기 때문에 이미지 분석 (그림 1B)에 방해가됩니다. EMSAs 일부 예들에서, 핵 추출물 제제가 사용되는 경우 특히 폴리 deoxyinosinic-deoxycytidylic (DI-DC)가 DNA 11 단백질의 비특이적 결합을 감소시키기 위해 결합 반응에 포함된다. 그러나, 디 - 직류를 50㎍ / ㎖의 정제 6xHis-SOX -2- 5&#39;Dye DNA 프로브 (도 1b)과의 결합을 폐지. <p class="jove_content" fo:kee...

우리는 여기서 중요한 생물학적 문제를 해결하기 위해 사례 연구와 같은 적외선 형광 염료 표지 DNA 프로브와 함께 정제 된 SOX-2 단백질을 사용하여 형광 전기 영동 이동성 이동 분석 (fEMSA)의 최적화 된 프로토콜을 설명합니다.

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

본 분석의 전반적인 목표는 비방사성 프로브를 사용하여 단백질-DNA 상호작용을 검출하는 것입니다. 이 방법은 단백질의 DNA 표적 서열을 결정하는 것과 같이 분자생물학 및 생화학 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 방사성 프로브를 사용하는 대신 쉽고 안전하며 시간을 절약할 수 있는 대안이라는 점입니다.이 절차를 시작하려면, 미니 단백질 겔 시스템을 사용하여 0.5x tris borate EDTA(TBE)와 2.5% glycerol이 포함된 5% native polyacrylamide 겔을 준비하십시오. 4개의 겔을 만들기 위한 30 mL의 겔 용액을 준비하려면, 증류수, TBE, ammonium persulfate, TEMED, acrylamide bis 및 glycerol을 혼합하십시오. 겔 용액을 즉시 주입하십시오.중합 후, 0.5x TBE로 미리 적신 투명 플라스틱 랩으로 겔을 감싸 4°C에서 보관합니다. 다음으로, 약 51mer 길이의 긴 올리고뉴클레오타이드를 설계합니다. 5' 말단에 적외선 형광 염료가 수식된 약 14mer 길이의 상보적 짧은 올리고뉴클레오타이드를 설계합니다.올리고뉴클레오타이드가 준비되면, 1x Tris-EDTA 버퍼에 재현탁하여 최종 농도를 100 µM로 맞춥니다. 어닐링(annealing)을 위해, 1.5 mL 튜브에 5' 염료가 표지된 짧은 올리고뉴클레오타이드 0.6 µL, 긴 올리고뉴클레오타이드 1.2 µL, 그리고 sodium chloride Tris-EDTA 버퍼 28.2 µL를 혼합합니다. 튜브를 끓는 물에 5분 동안 넣은 다음, 열원을 끄고 어닐링된 올리고뉴클레오타이드가 포함된 물을 암소에서 하룻밤 동안 식힙니다.이중 가닥 DNA 프로브를 제작하려면, 0.2 milliliter PCR 튜브에 어닐링된 올리고뉴클레오타이드 30 microliters를 DNTPs, Klenow 버퍼, Klenow five prime 다이 태그 및 이중 증류수와 함께 혼합합니다. 이 혼합물을 PCR 기기에서 37 degrees Celsius로 60분 동안 배양합니다. 그 다음, 반응을 중단시키기 위해 0.5 molar EDTA 3.4 microliters를 첨가하고, PCR 기기에서 75 degrees Celsius로 20분 동안 가열 불활성화합니다.그 다음, 충전된 프로브를 sodium chloride Tris-EDTA 버퍼로 희석하여 최종 농도를 0.1 µM로 맞춥니다. 올리고뉴클레오타이드는 사용 전까지 -20 °C의 암소에 보관하십시오. 라벨이 붙지 않은 프로브를 준비하려면, 1.5 mL 튜브에 20 µL의 long oligonucleotide, 20 µL의 Long R oligonucleotide, 그리고 60 µL의 sodium chloride Tris-EDTA 버퍼를 혼합합니다.튜브를 끓는 물에 5분 동안 넣은 다음, 열원을 끄고 어닐링된 올리고가 들어 있는 물을 하룻밤 동안 식힙니다. Tris HCl, Sodium Chloride, Potassium Chloride, Magnesium Chloride, EDTA, DTT, BSA 및 2회 증류수를 혼합하여 1 mL의 5x 결합 완충액을 준비합니다. 결합 반응을 설정하기 전에, ammonium persulfate의 모든 흔적을 제거하기 위해 0.5x TBE 및 2.5% glycerol 내의 5% native polyacrylamide 겔을 80 V에서 30분에서 1시간 동안, 또는 전류가 더 이상 시간에 따라 변하지 않을 때까지 사전 전기영동합니다.다음으로, 5x 결합 완충액 4 µL, 정제된 단백질 A 80~200 ng, 0.1 µM 염료 결합 프로브 1 µL 및 2중 증류수를 혼합합니다. 혼합물을 암실 상태의 상온에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후, 결합 반응액 전체를 겔에 로딩하고 cm당 10 V의 전압으로 원하는 거리까지 겔 전기영동을 수행합니다.겔을 최대한 어두운 상태로 유지하기 위해 겔 장치를 알루미늄 호일로 덮습니다. 적외선 이미징 시스템의 스캐너 베드를 증류수로 세척합니다. 겔이 담긴 유리 플레이트를 닦아 건조시킨 후 스캐너 베드 위에 놓습니다.적외선 이미징 소프트웨어를 열고 Acquire 탭을 클릭하십시오. 두꺼운 플레이트의 경우, 채널은 700, 강도는 auto, 해상도는 84 micrometers, 품질은 medium, 초점 오프셋은 3.5 millimeters로 설정하십시오. 스캐너 상에서 젤이 차지하는 영역을 선택하십시오.마지막으로, Start를 클릭하여 스캔을 시작합니다. 전기영동의 진행 상황은 Orange G 로딩 다이로 시각화할 수 있는 반면, Bromophenol blue는 스캔 중에 검출되어 이미지 분석을 방해합니다. 결합 반응에 dI-dC를 첨가하면 정제된 6xHis-SOX-2와 5' 말단 다이 표지 DNA 프로브 간의 결합이 억제되었습니다.LIM-4 돌연변이체와 LIM-4 결합 부위에 돌연변이가 일어난 SOX-2 콜드 프로브는 6xHis-SOX-2 결합을 위해 적외선 형광 염료가 표지된 프로브와 경쟁하는 효율이 야생형 콜드 프로브와 동일합니다. 그러나 SOX-2 결합 부위에 돌연변이가 일어난 LIM-4 및 SOX-2 돌연변이 콜드 프로브의 경쟁 효율은 6xHis-SOX-2 결합 시 야생형 콜드 프로브보다 훨씬 낮습니다. 6xHis 및 flag 에피토프를 이용한 SOX-2 DNA 복합체의 슈퍼시프트 분석 결과, 슈퍼시프트된 SOX-2 DNA 밴드가 나타났습니다.이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 2~4시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 적외선 프로브를 암소 상태로 유지하는 것이 중요함을 기억하십시오. 이 절차 이후에는 특정 DNA 결합 서열의 중요성과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 CRISPR cas9 게놈 편집과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 기술의 개발 이후, 생화학 분야의 연구자들은 다양한 모델 생물체에서 단백질-DNA 상호작용을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 비방사성 DNA 표지를 사용하여 단백질-DNA 상호작용을 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 아크릴아마이드를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 개인 보호 장비와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 이동성-이동 친화성 모세관 전기영동을 통해 단백질-리간드 상호 작용을 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 다양한 하전 리간드를 가진 단백질의 결합 거동을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다.

Mobility Shift Affinity Capillary 전기영동: 단백질-리간드 복합체의 차등 이동에 따른 샘플-리간드 상호 작용을 분석하는 방법

이 비디오에서는 적외선 형광 표지 DNA 프로브를 사용하여 단백질-DNA 상호 작용을 감지하는 전기영동 이동성 이동 분석을 시연합니다. 단백질이 DNA 프로브에 결합할 때, 천천히 이동하며 겔에 이동된 밴드로 나타나는 큰 복합체를 형성합니다.

transcription factor-DNA 복합체 검출을 위한 전기영동 이동성 전환 분석

생체 내 생체 분자에 대한 연구는 생물학적 맥락에서 분자 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기에서는 DNA 또는 단백질과 같은 형광 생체 분자를 살아있는 미생물로 내재화할 수 있는 새로운 방법을 설명합니다. 형광 현미경 검사로 기록된 생체 내 데이터 분석도 제시되고 논의됩니다.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

여기에서 우리는 RNA / 단백질 상호 작용을 분석하는 프로토콜을 제시한다. 전기 영동 이동성 변화 분석 (EMSA)이 네이티브 겔 전기 영동시 RNA / 단백질 복합체 및 무료 RNA의 차분에 기초하여 이동된다. 방사성 표지 된 RNA 프로브를 사용함으로써, RNA / 단백질 복합체는 오토 라디오 그래피에 의해 시각화 될 수있다.

IRE / IRP 예 : RNA - 단백질 상호 작용의 연구에 대한 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA)

우리는 전사 인자(TF) DNA 결합에 영향을 미치는 비암호화 유전적 변이를 식별하기 위한 전략적 계획과 프로토콜을 제시합니다. 유전자형 의존성 TF DNA 결합의 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA) 및 DNA 친화성 침전 분석(DAPA) 분석을 위한 자세한 실험 프로토콜이 제공됩니다.

전기 영동 이동성 분석 (EMSA) 및 Shift 키를 사용하여 기능 비 코딩 유전자 변형에 대한 심사 DNA 화성 강수 분석 (DAPA)

네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동은 RNA- 단백질 상호 작용을 분석하기위한 기본적인 도구입니다. 전통적으로 대부분의 실험에서는 수직 겔을 사용했습니다. 그러나, 수평 겔은 전기 영동 중에 복합체를 모니터링 할 수있는 기회와 같은 몇 가지 이점을 제공합니다. 우리는 수평 네이티브 겔 전기 영동을 생성하고 사용하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

단백질 -RNA 복합체의 향상된 검출을위한 수평 겔 전기 영동

이 프로토콜의 근처-적외선 붙일 레이블된 DNA 젤 전기 이동 법 젤 이미지를 사용 하 여 변경 내용 관찰을 통해 수정 된 DNA의 DNA 중 합 효소 합성의 특성을 설명 합니다. 아크릴 아 미드 젤의 크기에 따라 다른 속도로 이동 하는 짧은 핵 산 분리의 고해상도 이미징에 사용 됩니다.

근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

여기, 선물이 젤 전기 이동 법 실험에서 DNA의 검출을 위한 thiazole 오렌지를 사용 하는 프로토콜. Thiazole 오렌지의 사용 ethidium 평범한 사람의 제거를 허용 하 고 형광 탐지 UV 또는 푸른 빛으로 달성 될 수 있다.

Ethidium 평범한 사람 또는 대체 염료 대신 Thiazole 오렌지를 사용 하 여 DNA 전기 이동 법

여기에 제시된 단백질-핵산 상호작용을 연구하기 위해 널리 적용될 수 있는 비오틴 라벨을 이용한 시험관내 생화학적 분석에 대한 프로토콜이다.

비오틴 라벨을 사용하여 단백질-핵산 상호 작용을 연구하는 생체외 생화학 적 분석을 통해

여기에서는 리가아제(ligase), 뉴클레아제(nuclease) 및 중합효소(polymerase enzymes)의 예를 사용하여 핵산 대사 효소를 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 RNA 및/또는 DNA 손상 또는 경로 중간체를 모방하는 듀플렉스를 형성하기 위해 결합할 수 있는 형광 표지 및 표지되지 않은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 효소 행동의 특성을 분석할 수 있습니다.

핵산-대사 효소를 분석하기 위해 변형된 합성 올리고뉴클레오티드를 사용

학습하세요 적외선 형광 염료를 사용한 비방사성 전기 영동 이동성 시프트 분석법으로 SOX-2 단백질과 DNA의 상호작용을 안전하게 검출하는 방법을. 이 기술은 분자생물학 연구에 효율적입니다.

적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

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