적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

본 분석의 전반적인 목표는 비방사성 프로브를 사용하여 단백질-DNA 상호작용을 검출하는 것입니다. 이 방법은 단백질의 DNA 표적 서열을 결정하는 것과 같이 분자생물학 및 생화학 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 방사성 프로브를 사용하는 대신 쉽고 안전하며 시간을 절약할 수 있는 대안이라는 점입니다.

이 절차를 시작하려면, 미니 단백질 겔 시스템을 사용하여 0.5x tris borate EDTA(TBE)와 2.5% glycerol이 포함된 5% native polyacrylamide 겔을 준비하십시오. 4개의 겔을 만들기 위한 30 mL의 겔 용액을 준비하려면, 증류수, TBE, ammonium persulfate, TEMED, acrylamide bis 및 glycerol을 혼합하십시오. 겔 용액을 즉시 주입하십시오.

중합 후, 0.5x TBE로 미리 적신 투명 플라스틱 랩으로 겔을 감싸 4°C에서 보관합니다. 다음으로, 약 51mer 길이의 긴 올리고뉴클레오타이드를 설계합니다. 5' 말단에 적외선 형광 염료가 수식된 약 14mer 길이의 상보적 짧은 올리고뉴클레오타이드를 설계합니다.

올리고뉴클레오타이드가 준비되면, 1x Tris-EDTA 버퍼에 재현탁하여 최종 농도를 100 µM로 맞춥니다. 어닐링(annealing)을 위해, 1.5 mL 튜브에 5' 염료가 표지된 짧은 올리고뉴클레오타이드 0.6 µL, 긴 올리고뉴클레오타이드 1.2 µL, 그리고 sodium chloride Tris-EDTA 버퍼 28.2 µL를 혼합합니다. 튜브를 끓는 물에 5분 동안 넣은 다음, 열원을 끄고 어닐링된 올리고뉴클레오타이드가 포함된 물을 암소에서 하룻밤 동안 식힙니다.

이중 가닥 DNA 프로브를 제작하려면, 0.2 milliliter PCR 튜브에 어닐링된 올리고뉴클레오타이드 30 microliters를 DNTPs, Klenow 버퍼, Klenow five prime 다이 태그 및 이중 증류수와 함께 혼합합니다. 이 혼합물을 PCR 기기에서 37 degrees Celsius로 60분 동안 배양합니다. 그 다음, 반응을 중단시키기 위해 0.5 molar EDTA 3.4 microliters를 첨가하고, PCR 기기에서 75 degrees Celsius로 20분 동안 가열 불활성화합니다.

그 다음, 충전된 프로브를 sodium chloride Tris-EDTA 버퍼로 희석하여 최종 농도를 0.1 µM로 맞춥니다. 올리고뉴클레오타이드는 사용 전까지 -20 °C의 암소에 보관하십시오. 라벨이 붙지 않은 프로브를 준비하려면, 1.5 mL 튜브에 20 µL의 long oligonucleotide, 20 µL의 Long R oligonucleotide, 그리고 60 µL의 sodium chloride Tris-EDTA 버퍼를 혼합합니다.

튜브를 끓는 물에 5분 동안 넣은 다음, 열원을 끄고 어닐링된 올리고가 들어 있는 물을 하룻밤 동안 식힙니다. Tris HCl, Sodium Chloride, Potassium Chloride, Magnesium Chloride, EDTA, DTT, BSA 및 2회 증류수를 혼합하여 1 mL의 5x 결합 완충액을 준비합니다. 결합 반응을 설정하기 전에, ammonium persulfate의 모든 흔적을 제거하기 위해 0.5x TBE 및 2.5% glycerol 내의 5% native polyacrylamide 겔을 80 V에서 30분에서 1시간 동안, 또는 전류가 더 이상 시간에 따라 변하지 않을 때까지 사전 전기영동합니다.

다음으로, 5x 결합 완충액 4 µL, 정제된 단백질 A 80~200 ng, 0.1 µM 염료 결합 프로브 1 µL 및 2중 증류수를 혼합합니다. 혼합물을 암실 상태의 상온에서 15분 동안 배양합니다. 배양 후, 결합 반응액 전체를 겔에 로딩하고 cm당 10 V의 전압으로 원하는 거리까지 겔 전기영동을 수행합니다.

겔을 최대한 어두운 상태로 유지하기 위해 겔 장치를 알루미늄 호일로 덮습니다. 적외선 이미징 시스템의 스캐너 베드를 증류수로 세척합니다. 겔이 담긴 유리 플레이트를 닦아 건조시킨 후 스캐너 베드 위에 놓습니다.

적외선 이미징 소프트웨어를 열고 Acquire 탭을 클릭하십시오. 두꺼운 플레이트의 경우, 채널은 700, 강도는 auto, 해상도는 84 micrometers, 품질은 medium, 초점 오프셋은 3.5 millimeters로 설정하십시오. 스캐너 상에서 젤이 차지하는 영역을 선택하십시오.

마지막으로, Start를 클릭하여 스캔을 시작합니다. 전기영동의 진행 상황은 Orange G 로딩 다이로 시각화할 수 있는 반면, Bromophenol blue는 스캔 중에 검출되어 이미지 분석을 방해합니다. 결합 반응에 dI-dC를 첨가하면 정제된 6xHis-SOX-2와 5' 말단 다이 표지 DNA 프로브 간의 결합이 억제되었습니다.

LIM-4 돌연변이체와 LIM-4 결합 부위에 돌연변이가 일어난 SOX-2 콜드 프로브는 6xHis-SOX-2 결합을 위해 적외선 형광 염료가 표지된 프로브와 경쟁하는 효율이 야생형 콜드 프로브와 동일합니다. 그러나 SOX-2 결합 부위에 돌연변이가 일어난 LIM-4 및 SOX-2 돌연변이 콜드 프로브의 경쟁 효율은 6xHis-SOX-2 결합 시 야생형 콜드 프로브보다 훨씬 낮습니다. 6xHis 및 flag 에피토프를 이용한 SOX-2 DNA 복합체의 슈퍼시프트 분석 결과, 슈퍼시프트된 SOX-2 DNA 밴드가 나타났습니다.

이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 2~4시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 적외선 프로브를 암소 상태로 유지하는 것이 중요함을 기억하십시오. 이 절차 이후에는 특정 DNA 결합 서열의 중요성과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 CRISPR cas9 게놈 편집과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 기술의 개발 이후, 생화학 분야의 연구자들은 다양한 모델 생물체에서 단백질-DNA 상호작용을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 비방사성 DNA 표지를 사용하여 단백질-DNA 상호작용을 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 아크릴아마이드를 다루는 것은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 개인 보호 장비와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 점을 잊지 마십시오.