Name: 인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-12-02T15:46:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: 배우세요 인간 사전 mRNA에서 리보핵단백질 복합체 결합 부위를 고해상도로 매핑하는 빠르고 비용 효율적인 체외 방법을. 중복되는 올리고뉴클레오티드 풀과 마이크로어레이 분석을 사용하여 RNA-단백질 상호작용을 정밀하게 식별합니다.

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풀 디자인과 oligo 복구 <ol><li> 첫 번째 단계는 공부하는 사전 mRNA 수영장을 설계하는 것입니다. 이것은 UCSC 게놈 브라우저를 사용하고 특정 유전자, 스플 라이스 분기점, 또는 관심있는 다른 분야를 다운로드 할 수 있습니다. </li><li> 관심 창문이 선택되고 나면, 그들에 걸쳐 타일이 계산은 다음 조건을 사용하여 읽을 수 길이는 따라서 각 oligo가 이전부터 20 세포핵을 이동하는 10 염기 오버랩, 30 세포핵해야합니다. * Oligo의 중복은 적절한 범위를 보장하기 위해 스플 라이스 사이트에 가까이 증가한다; 10-20 세포핵에서 중복을 증가하면이 작업을 수행할 수 있습니다. </li><li> 수영장의 하류를 증폭하는 데 사용됩니다 보편적인 뇌관 시퀀스, 각 30 염기 oligo 측면. 기와 oligo 주문은 시퀀스가​​ 지정 oligonucleotide microarray의 인쇄됩니다 애질런트에 제출하여야한다. </li><li> microarray 표면에서 DNA를 oligos를 복구하기 위해서는 슬라이드에 배열 하이브 리다이 제이션 챔버의 배열 커버 슬라이드를 삽입하고 부드럽게 DH 2 O 500 μL를 pipetting으로 시작 </li><li> 표지 슬라이드 위에 샌드위치 배열, 프로세스를 중단 할 수 공기 방울을 피하기 위해주의한다. oligos과 측면이 수면에 닿으 있도록 배열 얼굴을 아래로 배치해야합니다. 엄지의 좋은 규칙은 배열에있는 애질런트의 라벨 커버 슬라이드 애질런트 레이블을 직면하는 "애질런트 감동 애질런트"이라는 의미입니다 </li><li> 하이브리드화 챔버를 닫고 하이브 리다이 제이션 오븐에 99 ° C에서 하룻밤 회전 </li><li> 다음날, 조심스럽게 챔버에서 배열을 제거하고 이제 oligos는 배열 표면에서 해방이 들어있는 물을, 빼다. 이것은 oligo 풀 수 있습니다 </li><li> 3~5초 펄스에 대한 1.5 ML Eppendorf 튜브에있는 수영장을 놓고 50 %의 진폭에 수영장 sonicate </li><li> 다음, 끝에 추가 T7 태그와 보편 primers를 사용하여 낮은 사이클 PCR에 의해 증폭 수영장. 에 대한 94에서 첫 라운드, 변성 ° C는 1 분, 20 초 동안 55 ° C에서 어닐링, 72시 1 분 길어지다 ° C. 후속 라운드 들어, 10 초, 20 초 10 초 72로 5 분 최종 신장 단계 ° C.으로 각 각 온도에서 할 수영장을 증폭하는 데 필요한 사이클의 수를는 oligo 복구의 효율성에 달려 있기 때문에, 여러 사이클 번호를 시도해야 할 수 있습니다. 아크릴 아미드 젤에 발랐습 밴드에 의해 의미있는 수영장,여 - 증폭하지 않도록주의하십시오. PCR 증폭 샘플이 필요 ° C까지 4 저장할 수 있습니다. </li><li> oligo 준비의 마지막 단계는 앰비온에서 MEGAshortscript ™ 키트를 사용하여 RNA를 녹음하는 것입니다. * 다음과 같은 프로토콜은 앰비온에서 적응되었습니다 <ol class="lalpha"><li> 얼음 T7 효소 믹스를 유지하면서 상온에서 T7 10X 반응 완충액, 넷 ribonucleotide 솔루션 및 물을 녹여 </li><li> 상온에서 RNase 무료 microcentrifuge 관에서 반응 혼합물을 조립. 반응이 얼음에 혼합 경우 반응 버퍼의 구성 요소 촉진하기 위해 템플릿 DNA가 발생할 수 있습니다. </li><li> 다음과 같은 순서로, 피펫 3 μL nuclease - 무료 물, 10X 반응 완충액 2 μL, 각각 75 MM NTP 솔루션 2 μL, 템플릿 DNA 5 μL (PCR 증폭 oligo 수영장)과 T7 효소 2 μL에 대한 20 μL의 최종 부피 </li><li> 튜브 다음 간단히 튜브의 하단에있는 혼합물를 수집하는 microfuge 반응을 섞어 부드럽게 플릭. </li><li> ° C 2 시간 37 thermocycler에 반응을 품어. 배양 시간은 템플릿에 의존되며, 따라서 그것은 최대한의 수확량에 대한 최적의 배양 시간을 결정하는 시간 코스 실험을 사용해야 할 수도 있습니다 </li><li> 2 시간 후에, 추가 15 분 37 반응과 부화 터보 DNase 1 μL를 추가 ° C를하여 템플릿 DNA를 제거 </li><li> 반응을 종료하고 페놀 / 클로로포름 추출 및 에탄올 침전으로 RNA를 복구합니다. <ol class="lalpha"><li> 20 μL 반응 볼륨, DH 2 O의 115 μL와 반응 3 M의 아세트산 나트륨 15 μL를 추가합니다. </li><li> 클로로포름의 산성 페놀 75 μL의 75 μL를 추가 철저 다음 섞는다. 실온에서 13,000 rpm으로 일분 후 microfuge, vortexing하여 솔루션을 섞는다. 새로운 튜브로 수성 레이어를 전송하고 추출을 반복 </li><li> 새로운 튜브로 수성 레이어를 전송하고 클로로포름 150 μL를 추가합니다. 소용돌이 이전으로 혼합하고 원심 분리기. 새로운 튜브로 수성 레이어를 전송합니다. </li></ol></li><li> 수성 계층 100 % 차가운 에탄올의 두 볼륨을 추가하고 잘 혼합하여 RNA를 복구합니다. -20 15 분 최소 혼합물을 냉각 ° C 다음 4 원심 분리기 ° 펠렛 RNA 최대 속도로 15 분 C. 조심스럽게 뜨는을 제거하고 0.1x 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (TE) 버퍼 105 μL의 펠렛을 resuspend .. </li></ol></li><li> 그것은 T7 키트 반응에서 무료 세포핵의 모두 제거되므로 가장 정확한 결과를 얻으려면 RiboGreen를 사용하여 RNA를 계량하기가 어렵습니다. <ol class="lalpha"><li> quantitation를 시작하려면 먼저 2300 μL + 50μL/sample 충분한 1X TE를 희석. </li><li> 다음 RiboGreen합니다. 당신이 1000 필요합니다 μL + 50 μL / 샘플. 하이 레인지 샘플 (1 μg / ML 20 NG / ML)은 1X TE에서 RiboGreen 1:200를 섞어, 낮은 범위 샘플 (50 NG / ML 1 NG / ML)는 1X TE에서 RiboGreen 1:2000 믹스 ; 피펫 불투명 판의 각 우물에 RiboGreen 솔루션을 50 μL, A1으로 시작 아래로 이동하지 전체 </li><li> 이 하이 레인지 샘플 또는 100 NG / 낮은 범위의 샘플 μL에 대한 μg / ML하는 RNA 주식 솔루션을 희석 </li><li> 주식 솔루션을 사용하여 원래의 2 μg / ML 또는 100 NG / ML 재고 여섯 이후 1시 2분 dilutions하여 표준 곡선을 작성, PCR 스트립 관에 주식 피펫 240 μL합니다. 나머지 7 튜브에 피펫 1X TE 120 μL. 잘 RNA 재고 120 μL을 가지고, 튜브 2 섞는다. 튜브 2 120 μL를 가지고 튜브 3 섞는다. 튜브 7까지 반복합니다. 튜브 8 단 TE가되고 공란으로 표시됩니다. 불투명 판, A1으로 표준 곡선 솔루션의 피펫 50 μL : H2 (두 번 커브를 실행) </li><li> 새로운 튜브에 oligo 수영장 5 μL와 TE 45 μL를 혼합하고 RiboGreen 50 μL를 포함하는 잘하는 50 μL를 추가합니다. </li><li> 접시 리더를 사용하면 485 나노미터와 530 나노미터의 방출 파장의 여기 파장과 1 분 혼합 후 위로부터 형광 읽고 접시를 읽을 수있는 기계를 설정 </li><li> -20 ° C.에 저장해야합니다 복구된 RNA를 정할 생성된 표준 곡선을 사용 </li></ol></li></ol> 관심 RNP와 oligo 수영장의 공동 immunoprecipitation <ol><li> 이전 공동 immunoprecipitation을 시작하기 위해 A와 Invitrogen에서 단백질 G의 Dynabeads 반응 당 50 μL의 최종 볼륨에 1:1 비율로 그들을 혼합하여 단백질을 준비합니다. 예를 들어, 두 반응에 대해 50 μL 각 비드를 각각 추가합니다. </li><li> 당신은 차가운 1X PBS의 동일한 볼륨 두 번 뜨는을 제거하고 구슬을 씻어 동안 자리에 비즈를 잡아 Novagen에서이 같은 자성 분리 스탠드를 사용하여 </li><li> 두 번째 세척 후, 차가운 1X PBS의 동일한 볼륨에있는 구슬을 resuspend과 반응 당 항체 2 NG를 추가합니다. 이 금액은 항체에 따라 달라질 수 있습니다, 실험의 최적 조건을 찾을 필요가 있도록. </li><li> 4 항체 / 비드 혼합물은 밤새 품어 회전 플랫폼에서 ° C </li><li> 아침에 비 특정 바인딩을 차단 sonicated 효모 총 RNA의 반응 당 2 μg을 추가하고, 4 추가 30 분 회전 ° C. </li><li> 비즈를 잡아 자기 랙를 사용하면, 튜브에서 두번째로 세척에서 PBS를 떠나, 차가운 1X PBS로 두 번 뜨는을 제거하고 구슬을 씻으십시오. </li><li> 새로운 튜브, 각 튜브에 각각의 반응과 비드 혼합물의 나누어지는 50 μL에 대해 하나를 가져가라. 마스터 믹스를 준비하는 동안 비즈 앉아서 </li><li> 각각의 반응은 120 볼륨을 가져 200 oligo 수영장의 NG, 보호 primers의 몰 비율 sonicated 효모 총 RNA 2 μg, 헬라 핵 추출물 (이것은 RNP 소스입니다) 20 μL, 그리고 버퍼 E를 추가에 대한 μL. 보호 primers는 범용 primers의 RNA 버전입니다. 끝에 추가 T7 태그와 유니버셜 primers의 주문 전사 템플릿은 다음 MEGAshortscript ™ 키트를 사용하여 템플릿에서 RNA를 고쳐 쓰다. </li><li> 마스터 믹스 120 μL의 비드 aliquots과 resuspend 구슬의 표면에 뜨는를 제거합니다. 4 ° C 1~2시간에 대한 반응을 바위. </li><li> 부화 후, 각 반응에 대해, "총"RNA 샘플을위한 작은 나누어지는을 (비즈 포함) 삭제 </li><li> 자성 분리 독립에 대한 반응의 나머지를 삽입하고 표면에 뜨는를 제거합니다. 이 샘플을 통해 하류 흐름이 분석하는 데 필요한 것은 아니지만, 그것은 저장하는 것이 유용할 수 있습니다. </li><li> 차가운 1X PBS 50 μL와 비즈 1-2 번 씻으십시오. 비즈에 대한 항체에 바인딩된 RNA는 "IP"예제입니다. </li><li> 0.1x TE 버퍼에 1% SDS 50 μL의 "총"과 "IP"구슬을 Resuspend하고 ° C 15 분 동안 RNA를 elute 65에서 샘플을 가열. </li><li> 이제 이전에 비즈로 바운드되어 에탄올 침전 다음 페놀 / 클로로포름 추출에 의해 깨끗한 RNA를 포함하는 표면에 뜨는를 제거합니다. 펠렛 건조 50 μL 0.1x TE 버퍼에 resuspend. </li></ol> aminoallyl 라벨에 대비하여 역방향 전사와 공동 IP 샘플의 증폭 <ol><li> 다음, RNA 샘플은 역방향 베꼈는데과 PCR은 증폭해야합니다. 반대 전사 반응은 반대로 보편 primers를 사용합니다. </li><li> 각 샘플의 경우, 1 μL를 혼합하여 시작반대 범용 템플릿 RNA 1 μL와 뇌관 (immunoprecipitation 반응에서)와 DH 2 O를 10 μL ° 5 분 C는 다음 얼음에 진정 또는 4에서 보관 ° C. 70 반응 히트 </li><li> 샘플 냉각하는 동안 다음과 같은 마스터 믹스를 확인하십시오. 각각의 반응을위한 10 MM dNTPs 4 μL, 10X Arrayscript 버퍼 ​​2 μL, 1 μL RNase 억제제, 1 μL 역방향 전사 효소를 결합. 철저하게 혼합하고 각 역방향 전사 반응에 마스터 믹스 8 μL를 추가합니다. </li><li> 95 다음 2 시간 동안 42 ° C에서 샘플을 부화 ° 후 5 분 C, 4 ° C 샘플을 증폭에 필요한 때까지. PCR 기계를 사용 </li><li> 반대로 RNA 샘플을 해독 후, PCR은 T7 태그가 포함된 primers 중 하나의 보편 primers를 사용하여 증폭. 그것이 여러 사이클을 시도해야 할 수 있도록 수영장을 증폭하는 데 필요한 사이클의 개수는 공동 IP의 효율성에 따라 달라집니다. 각 반응은 10X DNA 형성 촉매 반응 버퍼, 각각의 프라이머 (100 ㎜), cDNA 템플릿 1 μL (역 전사 반응에서), 10 MM dNTPs 1 μL, DH 2 O의 42.2 μL의 0.2 μL 5 μL 있어야하고, DNA 형성 촉매 효소 0.4 μL. 3 분 94 ° C에서 샘플을 잠복기로 PCR을 시작합니다. 다음, 94 각 사이클, 변성에 대한 ° 45 초 동안 C는 30 초 동안 55 ° C를 어닐링, 10 분 72 ° C에서 최종 연신율과 일분 72 ° C에서 연장하다. </li><li> 다음 MEGAshortscript ™ 키트를 사용하여 다시 샘플을 고쳐 쓰다, 그러나이 시간은 aminoallyl UTP 2 μL를 추가, 대신 T7 UTP니다. aminoallyl UTP는 싸이의 염료와 RNA 레이블을하는 데 사용됩니다. </li><li> 페놀 / 클로로포름과 에탄올의 샘플을 촉진. Glycoblue 또는 암모늄 아세테이트를 사용하지 마십시오, 둘 중 배열에 샘플의 하이브리드화를 방해할 수 있습니다. 0.1 M 나트륨 탄산염 4.5 μL의 펠렛 및 resuspend 건조. </li></ol> 싸이의 염료와 RNA의 아미노 알릴 라벨링 <ol><li> 라벨 프로토콜은 DMSO 45 μL에서, 형광 염료, cy3 및 cy5 각 디졸브 시작합니다. 빛을 피하려면, 어둠 속에 -20 ° C에서 알루미늄 호일과 저장소에있는 튜브를 랩 </li><li> RNA 샘플을 철저히 섞어 nuclease없는 물 2.5 μL 추가 </li><li> 다음, "IP"샘플에있는 "전체"샘플로 Cy3 3 μL와 Cy5 3 μL를 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 어둠 속에서 샘플을 품어, 싸이 - 5은 파란색으로 바뀔 것이다 반면 싸이 - 3 샘플은 빨간색 또는 분홍색으로 바뀔 것이다. </li><li> 반응을 종료하기 위해, 각 샘플 4 M - 히드록 실 아민 HCL 6 UL을 추가 철저하게 혼합하고 짧게 스핀. 실온에서 15 분 동안 품어. </li><li> 0.1x TE 50 μL의 에탄올 강수량과 resuspend 펠렛 다음 페놀 / 클로로포름 추출에 의해 표시된 샘플을 정화 </li></ol> 애질런트의 배열 하이브 리다이 제이션 키트를 사용하여 microarray에 샘플을 잡종 <ol><li> 부드럽게 10X 차단 버퍼의 μL nuclease 무료 H2 O, Cy3 - 라벨 "총"수영장, Cy5 - 라벨 "IP"수영장의 25 μL의 25 μL, 10 140 μL의 50 μL를 혼합하여 하이브 리다이 제이션을 시작 25x 조각 버퍼와 2X 하이브리드화 버퍼 250 μL은 거품을 소개 않도록주의한다. 간단히 튜브의 바닥에있는 솔루션을 수집하고 또한 거품을 줄이기 위해 샘플을 Microfuge. </li><li> 하이브 리다이 제이션 챔버에 O - 링 커버 슬라이드를 삽입하고 조심스럽게 슬라이드에 솔루션을 피펫. </li><li> "샌드위치"솔루션을 위해 커버 슬라이드 위에 감지 배열을 놓습니다. 배열에있는 애질런트의 라벨 커버 슬라이드 애질런트 레이블을 직면 수 있도록 방향 배열 슬라이드 것을 잊지 마십시오. </li><li> 하이브 리다이 제이션 챔버에서 슬라이드 / 배열 샌드위치를​​ 고정하고 3 시간 동안 50 ° C에서 회전. </li><li> 배열 회전하는 동안, 50 - ML 원뿔 튜브에 다음과 같은 50 ML 솔루션을 하나 원뿔 DH 2 O, 별도의 튜브에 두 1X SCC 버퍼 솔루션, 각 한 2X SCC 버퍼 50 ML 가득. </li><li> 3 시간 배양 후, 신중하게 배열 / 슬라이드 샌드위치를​​ unclamp하고 2X SCC 버퍼를 포함하는 50 ML 원뿔에 놓으십시오. 족집게 한 켤레를 사용하여 부드럽게 커버 슬라이드에서 배열을 분리하여 커버 슬라이드를 빼낸다. 슬라이드가 꺼내와 같이 배열을 만지지 않도록주의하십시오. 원뿔을 닫고 부드럽게 60 초 동안 반전. </li><li> 족집게를 사용하여 1X SCC 솔루션에 배열을 전송, 튜브를 마개, 그리고 조심스럽게 1X SCC 솔루션에 배열을 전달하고 다시 부드럽게 다른 분에 대한 반전 후 1 분 반전. </li><li> 마지막으로, DH 2 O의 튜브에 배열을 전달하고 부드럽게 30 초 동안 반전. </li><li> Kimwipe에있는 슬라이드의 가장자리를 배치하여 배열을 건조. 의 배열을 회전 계속 oligos를 포함하는 측면을 방해하지 않도록해야 할 닦으십시오. </li><li> 에서 건조 배열을 플레이스Microarray 스캐너와 빈 50 ML 원뿔 튜브 및 검사 </li></ol> Microarray를 해석 <ol><li> microarray 스캐너는 배열의 TIF 이미지를 생성합니다. 특정 수영장에 고유한 그리드 파일 (애질런트가 제공하는)를 사용하여 애질런트 기능 추출 소프트웨어를 통해이 이미지를 실행합니다. </li><li> 애질런트 소프트웨어는 펄 스크립트 구문 분석 파일을 만들고, 각 기능에서 신호를 해석합니다. 각 기능에서 신호가 해당 채널의 총 농도로 정상화됩니다. 녹색 채널에 특정 기능에 예를 들어, 각각의 기능에 대한 녹색 채널의 강도는 모든 기능을 통해 녹색 채널의 총 농도로 나눈 값입니다. 최종 출력은 배열에있는 각 기능의 녹색 채널을 통해 적색 채널의 로그 비율이다. </li><li> microarray에서 oligo 풀 데이터의 사진을 얻을 수있는 게놈으로 다시 매핑하고, 어떻게 강하게, 관심 RNP는 바운드 수 있습니다. </li></ol> 그림 1. 실험 개략도 <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1a.jpg" alt="그림 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1A"> A.이 계획을 기와. 선택한 관심 사전 mRNA 시퀀스를 다운로드 후, 선택 영역은 그 10 뉴클레오 티드 단위로 교대 30 뉴클레오 티드 창문을 통해 타일​​입니다. 윈도우 유니버셜 프라이머 결합 사이트 플랭크 각 측면. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1b.jpg" alt="그림 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1B"> B. 합성 배열입니다. 기와 oligo 주문은 시퀀스가​​ 지정 oligonucleotide microarray의 인쇄됩니다 애질런트에 제출하여야한다. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig1c.jpg" alt="그림 1c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1C"> C. 공동 immunoprecipitation. 배열에서 oligos를 끓는 후, 헬라 핵 추출물에서 부화 후 관심 RNP에 대한 항체와 준비가되어 자기 구슬로 추출을 추가합니다. Cy3와 함께 시작 oligo 수영장과 Cy5와 바운드 IP 수영장을 분류하고 감지 배열 및 스캔에 적용됩니다. 그림 2. 와 게놈 및 농축 데이터의 분석을 주석. <img src="/files/ftp_upload/1622/1622fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> A.는 평균 기지 - 텐 로그 배열 데이터에서 각 게놈 조정에 점수와지도를 변환하는 주어진 좌표로 점수. 이 평균 단계의 그림 3은 각 10 NT 윈도우의 평균 농축 점수가 위의 그래프는 2 득점, 4 및 0.5, 30 - NT의 oligos를 중복을 위해 제공됩니다. 선택한 게놈 영역은 USCS의 게놈 브라우저에서 사용자 지정 추적을 사용하여 시각하실 수 있습니다. 주어진 예제 브라우저 창이 유전자 기능 (exons / introns / 대체 splicing 등) 진한 빨간색 세로 막대로 표시됩니다 PTB - 바운드 oligos에서 아래와 로그 평균 농축 성적 따라 부여됩니다 clta 유전자에있다. PTB 적극 polypyrimidine 트랙트에 불과 상류 엑슨 2 바인딩합니다.

수영장의 생성을 기억하는이 절차는 중요 할 때하면 RNA 또는 단백질 수준 중 하나에서 유연하고 수정하기 위해 열려 있습니다. RNA 수준에서 orthologous 지역 질병 돌연변이, polymorphisms, 또는 무작위 돌연변이 oligonucleotide 순서에 소개하실 수 있습니다. 단백질 수준에서 RNA 바인딩 요소는 인산화 또는 다른 게시 translational 수정하여 수정할 수 있습니다. 또한 바인딩 환경 중 상호 작용이나 관심의 RNA 결합 단백질과 경쟁할 추가 요인의 수준을 증가 또는 감소로 조작할 수 있습니다.

인간 사전 mrna에 매핑 ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (rnps)

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

RNA 결합 단백질과 공동 immunoprecipitate (CO - IP)는 해당 바인딩 위치를 입증하여 splicing 우리의 이해를 증가했음을 RNAS를 배열하는 것은 종종 splicing 요소의 기능에 영향을 미칩니다. 그러나, 같은 샘플링 전략 splicing 요소에 바인딩된 RNA를 식별의 기회는 셀룰러 풍요에 비례합니다. 우리는 사전 mRNA 달리 과도에 대한 결합 특이성을 조사에 대한 체외 방식의 소설을 개발했습니다. 이 방법은 특별히 설계된 oligonucleotide 풀을 활용되는 introns, exons, 스플 라이스 분기점 또는 사전 mRNA 기타 전체 타일. 수영장은 분자 선택 어떤 종류의를 받게됩니다. 여기, 우리는 바운드와 언바운드 분수에 oligonucleotide를 분리하여 방법을 설명하고 바운드 분수의 각 oligonucleotide의 강화를 기록 두 색상 배열 전략을 사용합니다. 배열 데이터는 순서 특정 및 구조 사전 mRNA에 대한 구속력을 ribonucleoprotein (RNP)의 determinates 식별하는 능력을 가지고 고해상도지도를 생성합니다. 수영장이 특별히 사전 mRNA 순서에서 설계하고 합성이므로이 방법으로 독특한 장점은, 현재 IP와 S​​ELEX 기법과 관련된 mRNA 대한 샘플링 바이어스를 방지하는 기능입니다. 실험자들이 그들의 개인적인 필요에 수영장을 조정, 전체 연구 기와하는 지역을 선택 이후 oligonucleotide 수영장의 유연성은 또 다른 장점이라고 생각합니다. 이 기법을 사용, 하나는 분석 대규모 구속 또는 기능 splicing 기자로 라이브러리를 복제하고 포함 분수에 농축되는 oligonucleotides를 식별에 polymorphisms이나 돌연변이의 효과를하실 수 있습니다. 체외 고해상도 매핑 스키마에서이 소설은 낮은 풍부한 생체내 기술의 현재와 공부하기 어렵 만드는 과도 사전 mRNA 종과 RNP 상호 작용을 연구하는 독특한 방법을 제공합니다.

사전 mRNA의 과도 특성으로 인해, 그것은 분리하고 공부하기에 어려울 수 있습니다<em&gt; 생체내에</em&gt;. 여기, 우리는 소설을 제시<em&gt; 체외에서</em합성 oligo 풀을 사용하여 RNA 단백질 상호 작용을 조사하기&gt; 접근되는 미리 mRNA의 선택 지역에 걸쳐 타일.

인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

RNA 결합 단백질과 함께 공동 면역침전(co-IP)되는 RNA의 시퀀싱은 결합이 ... 함을 입증함으로써 스플라이싱에 대한 우리의 이해를 증진시켰습니다.

pre-mRNA 상의 리보핵단백질 결합 부위를 매핑하려면, 우선 관심 있는 prem NNA의 지정된 영역을 30개 뉴클레오타이드 창(window)으로 타일링하여 타일링된 올리고뉴클레오타이드를 어레이 상에 합성하는 것부터 시작하십시오. 어레이에서 올리고뉴클레오타이드를 가열하여 분리한 후, 관심 있는 RNP와 함께 공동 침전시킵니다. 초기 전체 풀은 SCI 3으로 라벨링하고 결합된 풀은 SCI 5로 라벨링하며, 두 풀 모두를 검출 어레이에 적용합니다.그런 다음 어레이를 스캔하고 특징 추출 소프트웨어를 사용하여 결과를 해석합니다.안녕하세요, 저는 브라운 대학교 MCB 학과의 Will Fairbrother 연구실 소속 Kate Watkins입니다. 오늘은 pre-mRNA 상에서 RNA-단백질 복합체의 정확한 위치를 결정하기 위한 신속하고 저렴한 절차를 보여드리겠습니다. 실험실에서 pre-mRNA를 중첩된 올리고뉴클레오타이드 풀로 재합성합니다.그런 다음 이 풀(pool)을 공동 면역침전법(co immunoprecipitation)을 통해 결합 분획과 비결합 분획으로 분리한 후 마이크로어레이로 분석할 수 있습니다. 이 절차는 많은 응용 분야가 있지만, 여기서는 여러 스플라이싱 인자와 이들이 선택적 스플라이싱에서 하는 역할을 연구하는 데 사용합니다. 그럼 시작하겠습니다.본 절차를 시작하려면 uc SC genome browser를 사용하여 prem A pool 설계에 필요한 특정 유전자, splice junction 또는 기타 관심 영역을 다운로드하십시오. 관심 윈도우를 선택한 다음, 각 oligo가 이전 oligo에서 10 nucleotide만큼 이동하도록 30 nucleotide의 read length와 20 nucleotide의 overlap을 적용하여 컴퓨터로 타일링하십시오. 30 nucleotide 길이의 oligo가 정의되면, 각각의 양 끝에 universal primer 서열을 부착하십시오.맞춤형 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이 제작을 위해 oligo를 Agilent에 제출하십시오. 마이크로어레이가 도착하면, 어레이 하이브리드챔버에 어레이 커버 슬라이드를 넣고 탈이온수 500 µL를 슬라이드 위에 조심스럽게 피펫팅하여 표면에서 DNA oligo를 회수하기 시작합니다. 각 슬라이드의 라벨이 서로 마주보도록 마이크로어레이 슬라이드를 커버 슬라이드 위에 엎어 놓으며, oligo 회수 과정을 방해할 수 있는 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.하이브리다이제이션 챔버를 닫고 하이브리다이제이션 오븐에서 99 °C로 하룻밤 동안 회전시키십시오. 다음 날, 챔버에서 어레이를 조심스럽게 꺼내고, 어레이 표면에서 분리된 올리고가 포함된 물을 흡입하여 제거하십시오. 분리된 올리고 풀을 1.5 mL 에펜도르프 튜브에 넣고, 50% 진폭으로 3~5초씩 3회 초음파 처리하여 응집될 수 있는 덩어리들을 분해하십시오. 그다음, 끝단에 T 프로모터가 부착된 유니버설 프라이머를 사용하여 저사이클 PCR로 해당 풀을 증폭하십시오.필요한 사이클 수는 올리고 회수 효율에 따라 달라질 수 있습니다. 아크릴아마이드 겔에서 스미어 현상으로 나타나는 과증폭이 발생하지 않도록 주의하십시오. 마지막으로, Amon사의 mega short script kit를 사용하여 RNA를 전사합니다.RNA를 페놀-클로로포름으로 추출하여 전사 반응을 종결시킨 후, 아세트산 나트륨과 캐리어로서의 glyco blue를 사용하여 에탄올 침전을 수행합니다. RNA 펠렛을 105 µL의 TE 버퍼에 다시 현탁합니다. 이는 RNA 농도를 정확하게 측정하기 위함입니다.RiboGreen을 사용하여 표준 곡선을 생성하십시오. 그런 다음 형광 플레이트 리더를 사용하여 측정하십시오. 이제 RNA 풀이 준비되어 공동 면역침전(co-immunoprecipitation)을 통한 풀다운(pull down)을 시작할 수 있습니다.먼저, 단백질 A와 단백질 G dyna beads를 1:1 비율로 혼합하여 반응당 최종 부피가 50 µL가 되도록 하여 자성 비드를 준비합니다. 자성 분리 스탠드를 사용하여 비드를 한곳에 모은 뒤 상층액을 제거합니다. 그런 다음 차가운 1x PBS를 동일한 부피로 사용하여 두 번 세척합니다.비드를 동일한 부피의 차가운 1X PBS에 현탁하고, 비드당 2ng의 항체를 첨가합니다. 이 양은 항체에 따라 다를 수 있으므로, 항체를 비드에 결합시키기 위한 최적의 조건을 찾기 위해 실험이 필요할 수 있습니다. 혼합물을 회전 플랫폼 위에서 4°C로 하룻밤 동안 인큐베이션합니다.오전에, 비특이적 결합을 차단하기 위해 반응당 2 µg의 초음파 처리된 효모 총 RNA를 첨가하고 4 °C에서 30분 동안 추가로 회전시킨다. 차단 단계가 완료되면, 다시 자석 랙을 사용하여 상층액을 제거한다. 그런 다음 차가운 1X PBS로 비드를 두 번 세척하고, 두 번째 세척 후의 PBS를 튜브에 남겨둔 채 비드 혼합물 50 µL씩을 새 튜브에 분주한다.각 co IP 반응당 튜브 하나를 준비합니다. 이제 비즈가 co ip 준비되었습니다. 다음으로, RNA 올리고 풀(oligo pool)과 핵 세포 추출물을 혼합하여 마스터 믹스를 준비합니다.RNP 소스로서, 마스터 믹스 50 µL 분취액을 전체 샘플 보호 프라이머로 취합니다. 유니버설 프라이머의 RNA 버전인 보호 프라이머는 단백질이 프라이머 서열에 결합하는 것을 방지하거나 RNA에 이차 구조가 도입되는 것을 막기 위해 추가할 수 있습니다. 공동 면역침전(co immunoprecipitation)을 시작하려면, 비드 분취액에서 상층액을 제거하고 남은 마스터 믹스 120 µL에 비드를 재현탁합니다. 반응물을 4 °C에서 1~2시간 동안 흔들어 섞어줍니다.배양 종료 후, 각 공동 침전물(co ip)에서 비드를 포함한 소량의 Eloqua를 제거할 수 있습니다. 결합 효율이나 특이성을 추가로 테스트하려면, 나머지 반응물을 자석 위에 놓아 상층액을 제거하십시오. 그 후 차가운 one XPDS로 1~2회 세척하십시오.RNP를 통해 비드 상의 항체에 결합된 RNA가 바로 IP 샘플입니다. IP 비드를 0.1 XTE 버퍼 내 1% SDS 50 µL에 재부유시키고, 샘플을 65 °C에서 15분 동안 가열하십시오. RNA를 용출하기 위해 상층액을 제거하는데, 이 상층액에는 이전에 비드에 결합되어 있던 RNA가 포함되어 있습니다. 페놀 클로로포름 추출 후 에탄올 침전법으로 정제하고, 펠릿을 0.1 XT 버퍼 50 µL에 재부유시키십시오.다음으로, 범용 역전사 프라이머(reverse universal primers)를 사용하여 샘플을 역전사합니다. 그 다음, 범용 프라이머(universal primers)를 사용하여 샘플을 PCR 증폭시키며, 이 중 하나의 프라이머는 T7 프로모터를 포함해야 합니다. 풀(pool)을 증폭하는 데 필요한 사이클 수는 co-IP의 효율성에 따라 달라집니다.Ambion의 mega shorts script kit를 사용하여 샘플을 다시 전사하되, 이번에는 키트에 포함된 T7 UTP 대신 2 µL의 amino allyl UTP를 첨가하십시오. amino allyl UTP는 나중에 RNA를 Cy-dye로 표지하는 데 사용됩니다. 전사가 완료되면.페닐 클로로폼 추출물과 에탄올로 시료를 침전시킵니다. 어레이에 대한 시료의 하이브리다이제이션을 방해할 수 있는 glyco blue 또는 아세트산 암모늄은 사용하지 마십시오. 침전물을 4.5 µL의 0.1 M 탄산나트륨에 재현탁합니다.먼저 샘플에 라벨을 지정하려면, 전체 샘플에 nuclease free water 2.5 µL를 추가하십시오. S3 3 µL를 추가하고 IP 샘플에는 SCI five 3 µL를 추가하십시오. 암소에서 1시간 동안 배양하십시오.실온에서 각 샘플에 4 M hydroxyl lamine HCL 6 µL를 첨가하여 반응을 종결시키고, 충분히 혼합한 후 원심분리합니다. 실온에서 15분 동안 짧게 배양한 후, 페닐 클로로포름 추출과 에탄올 침전을 통해 표지된 샘플을 정제합니다. 색상의 대부분은 유리 뉴클레오타이드와 함께 유기상으로 제거되므로, 펠렛에 색이 보이지 않을 수 있습니다.각 펠렛을 50 µL의 0.1 XTE에 다시 현탁합니다. 다음의 예외 사항을 제외하고, Agilent 어레이 하이브리다이제이션 키트 지침에 따라 마이크로어레이 샘플을 준비하십시오. RNA를 단편화하지 마십시오. 단편화 버퍼를 추가한 직후에 하이브리다이제이션 버퍼를 추가하여 단편화를 중단시킵니다.샘플을 어레이에 올리고, 어레이를 회전시키면서 50 °C에서 3시간 동안 하이브리드화합니다. 50 mL 원추형 튜브에 다음과 같이 50 mL 용액들을 준비합니다. 2배 농도 SC 버퍼 1튜브, 1배 농도 SC 버퍼 2튜브, 그리고 탈이온수 1튜브를 준비합니다.3시간의 배양 후, 어레이 슬라이드 샌드위치의 클램프를 조심스럽게 풀고 2 XSSC 버퍼에 넣습니다. 핀셋을 사용하여 커버 슬라이드로부터 어레이를 부드럽게 분리합니다.어레이에 닿지 않도록 주의하며 커버 슬라이드를 조심스럽게 제거합니다. 슬라이드를 꺼내면서 원추형 튜브의 뚜껑을 닫고 60초 동안 부드럽게 뒤집어 섞어줍니다. 핀셋을 사용하여 어레이를 1X SSC 용액으로 옮깁니다.튜브의 캡을 닫고 1분 동안 부드럽게 반전 혼합합니다. 그다음 어레이를 두 번째 XSSC 용액으로 옮겨 다시 1분 동안 부드럽게 반전 혼합합니다. 마지막으로, 어레이를 탈이온수가 담긴 튜브로 옮겨 30초 동안 부드럽게 반전 혼합합니다.슬라이드의 가장자리를 킴와이프(kim wipe) 위에 올려 어레이를 건조시킵니다. 올리고뉴클레오타이드(oligos)가 포함된 면이 손상되지 않도록 주의하며 와이프 위에서 어레이를 계속 회전시킵니다. 어레이를 빈 원추형 튜브(conical tube)에 넣고 어레이 스캔을 진행합니다.어레이 스캔을 진행합니다. 여기 대표적인 어레이가 있습니다. 각 피처 또는 올리고는 전체 비농축 풀의 경우 녹색으로, IP 농축 풀의 경우 빨간색으로 표시됩니다.각 특징점의 신호는 해당 채널의 전체 강도에 대해 정규화됩니다. 최종 출력값은 녹색 채널에 대한 적색 채널의 로그 비(log ratio)입니다. 어레이의 각 특징점에서, 각 게놈 좌표의 평균 점수가 해당 위치에 매핑됩니다.점수가 2, 4, 0.5인 세 개의 중첩된 30 nucleotide oligo에 대한 이 평균화 단계의 예시가 제시되어 있으며, 각 10 nucleotide window에 대한 평균 농축 점수가 표시되어 있습니다. 여기 CLTA 유전자에서 poly pyrimidine track binding protein PTB의 결합 체계 예시가 있으며, 유전자 특징은 하단에 표시되어 있고 PTP 결합 부위의 로그 평균 농축 점수는 진한 빨간색 수직 막대로 나타나 있습니다. 연한 빨간색 막대는 PTP 결합이 농축되지 않은 영역을 나타냅니다.지금까지 선택적 스플라이싱이 일어나는 액손과 같은 관심 영역 전체를 타일링하는 올리고뉴클레오타이드 풀을 빠르고 효율적으로 생성하는 방법을 보여드렸습니다. 저희는 마이크로어레이로 풀을 분석하지만, Illumina, Lexi 시퀀싱 또는 보다 전통적인 Sanger 시퀀싱을 통해 시퀀싱하는 것도 가능합니다. 이 절차를 수행할 때, 풀의 생성 과정이 RNA 또는 단백질 수준에서 수정 가능하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.RNA 수준에서는 올리고뉴클레오타이드 서열에 자가 영역, 질병 돌연변이, 다형성 또는 무작위 돌연변이를 도입할 수 있습니다. 단백질 수준에서는 인산화 또는 기타 번역 후 수정을 통해 RNA 결합 인자를 변형할 수 있습니다. 또한, 관심 대상인 RNA 결합 단백질과 경쟁하거나 상호작용하는 추가 인자의 수준을 증가 또는 감소시키도록 결합 환경을 조절할 수 있습니다.이상입니다. 시청해 주셔서 감사하며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

RIP 칩을 통해 RNA 관련 단지를 분리하고 식별 단계 프로토콜로 단계.

RIP 칩을 사용하여 세포 추출물에서 mRNAs, microRNAs 및 Ribonucleoprotein 단지의 단백질 구성 요소의 분리 및 확인에 방법

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캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략

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RNA의 발자국 의 식별:연속RNA 면역 침전을 통한 단백질 복합체 시퀀싱 (RIPiT-Seq)

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배우세요 인간 사전 mRNA에서 리보핵단백질 복합체 결합 부위를 고해상도로 매핑하는 빠르고 비용 효율적인 체외 방법을. 중복되는 올리고뉴클레오티드 풀과 마이크로어레이 분석을 사용하여 RNA-단백질 상호작용을 정밀하게 식별합니다.

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