인간 사전 mRNA에 매핑 Ribonucleoproteins에 대한 신속한 하이 스루풋 방법 (RNPs)

pre mRNA에서 ribo 핵 단백질의 결합 부위를 매핑하려면 먼저 30개의 뉴클레오티드 창에서 관심 prem NNA의 지정된 영역을 가로질러 타일링하고 타일링된 올리고를 어레이에 합성합니다. 올리고는 어레이에서 끓어오르고 관심 RNP로 침전됩니다. 총 시작 풀은 SCI 3으로 레이블이 지정되고 바인딩된 풀은 SCI 5로 레이블이 지정되며, 둘 다 감지 어레이에 적용됩니다.

그런 다음 어레이를 스캔하고 특징 추출 소프트웨어를 사용하여 결과를 해석합니다. 소금. 안녕하세요, 저는 브라운 대학의 MCB 부서에서 윌 페어 형제의 실험실에서 온 케이트 왓킨스입니다. 오늘은 실험실에서 prem RA에서 RNA 단백질 복합체의 정확한 위치를 결정하기 위한 빠르고 저렴한 절차를 보여 드리고, prem A를 겹치는 올리고뉴클레오티드 풀로 재합성합니다.

그런 다음 이 풀은 co immunoprecipitation에 의해 결합 및 결합되지 않은 분획으로 분리된 다음 마이크로어레이로 분석할 수 있습니다. 이 절차에는 많은 응용 분야가 있지만 여러 접합 계수와 그 역할 및 대체 접합을 연구하는 데 사용합니다. 시작하겠습니다.

이 절차를 시작하려면 uc SC 게놈 브라우저를 사용하여 특정 유전자, 스플라이스 접합 또는 prem A 풀을 설계할 기타 관심 영역을 다운로드합니다. 관심 있는 창을 선택한 다음 30개의 뉴클레오티드 판독 길이와 20개의 뉴클레오티드 겹침을 사용하여 각 올리고가 이전 올리오티드에서 10개의 뉴클레오티드가 이동하도록 계산적으로 타일링합니다. 이제 30개의 뉴클레오티드 긴 올리고가 정의되었으며, 각 올리고는 보편적인 프라이머 서열을 가지고 있습니다.

맞춤형 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이에 프린팅하기 위해 올리고를 애질런트에 제출합니다. 마이크로어레이가 도착하면 어레이 커버 슬라이드를 어레이 혼성화 챔버에 배치하고 500마이크로리터의 탈이온수를 슬라이드에 부드럽게 피펫팅하여 표면에서 DNA 올리고를 회수하기 시작합니다. 각 슬라이드의 라벨이 서로 마주보도록 마이크로어레이 슬라이드를 커버 슬라이드 위에 뒤집어 놓고 올리고 회수 프로세스를 방해할 수 있는 기포를 피하도록 주의하십시오.

혼성화 챔버를 닫고 혼성화 오븐에서 섭씨 99도에서 밤새 회전합니다.다음 날, 챔버에서 어레이를 조심스럽게 제거하고 어레이 표면에서 방출된 올리고를 포함하는 물을 빼냅니다. 방출된 올리고 풀을 1.5ml einor 튜브에 넣고 초음파 처리하여 50% 진폭에서 잠재적인 덩어리를 매번 3-5초 펄스로 세 번 분해합니다. 다음으로, 말단에 T promoter가 추가된 범용 프라이머를 사용하여 저주기 PCR로 풀을 증폭합니다.

필요한 사이클의 수는 올리고 회수의 효율성에 따라 달라질 수 있습니다. 아크릴아마이드 겔에 번진 띠로 보이는 과도한 증폭을 피하십시오. 마지막으로, Amon의 메가 쇼트 스크립트 키트를 사용하여 RNA를 전사합니다.

RNA의 페닐 클로로포름 추출로 전사 반응을 종료한 다음 아세트산나트륨과 글리코 블루를 담체로 사용하여 에탄올 침전을 수행합니다. Resus는 105마이크로리터의 TE 완충액에 RNA 펠릿을 현탁시킵니다. RNA의 농도를 정확하게 결정하기 위해.

ribo green을 사용하여 표준 곡선을 생성합니다. 그런 다음 형광 플레이트 리더를 사용하여 측정합니다. RNA 풀은 이제 풀다운을 시작하기 위해 co immunoprecipitation을 할 준비가 되었습니다.

먼저, 단백질 A와 단백질 G dyna 비드를 반응당 50마이크로리터의 최종 부피에 대해 1:1 비율로 결합하여 마그네틱 비드를 준비합니다. 상등액을 제거하기 위해 Magnetic separation stand를 사용하여 비드를 한 곳에 집중시킵니다. 그런 다음 두 번째 세탁 후 동일한 양의 차가운 XPBS로 두 번 세탁하십시오.

Resus, 동일한 부피의 차가운 1 XPBS에 비드를 현탁시키고 2 나노그램의 항체 페리온을 첨가합니다. 이 양은 항체에 따라 달라질 수 있으므로 항체를 비드에 결합하기 위한 최적의 조건을 찾기 위해 실험이 필요할 수 있습니다. 혼합물을 회전 플랫폼에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

아침에 초음파 처리된 효모 총 RNA의 반응당 2마이크로그램을 첨가하여 비특이적 결합을 차단하고 섭씨 4도에서 추가로 30분 동안 회전합니다. 차단 단계가 완료되면 다시 마그네틱 랙을 사용하여 상등액을 제거합니다. 그런 다음 차가운 XPBS로 비드를 두 번 세척하고 두 번째 세척의 PBS를 튜브에서 추출하고 비드 혼합물의 50 마이크로 리터를 새 튜브로 분취합니다.

각 co IP 반응에 대해 하나의 튜브. 이제 비드가 co ip에 사용할 준비가 되었습니다. 다음으로, RNA 올리고 풀(oligo pool)과 핵 세포 추출물을 결합하여 마스터 믹스를 준비합니다.

RNP 소스로, 마스터 믹스의 50마이크로리터 분취액을 총 샘플 보호 프라이머로 취하며, 이는 프라이머 염기서열에 단백질이 결합하거나 RNA에 2차 구조가 도입되는 것을 방지하기 위해 추가할 수 있는 범용 프라이머의 RNA 버전입니다. CO 면역침전을 시작하려면 비드 분취액에서 상등액을 제거하고 나머지 마스터 믹스의 120마이크로리터에 비드를 다시 현탁합니다. 섭씨 4도에서 1-2시간 동안 반응을 흔듭니다.

배양이 끝나면 비드를 포함한 작은 Eloqua를 각 co ip에서 제거할 수 있습니다. 결합 효율 또는 특이성에 대한 추가 테스트를 위해 나머지 반응을 자석에 놓고 상층액을 제거합니다. 차가운 XPDS로 1-2회 세척합니다.

RNP를 통해 비드의 항체에 결합된 RNA는 IP 샘플입니다. 0.1 XTE 버퍼에 1%SDS 50마이크로리터에 IP 비드를 다시 현탁시키고 샘플을 섭씨 65도에서 15분 동안 가열합니다. RNA를 용리하려면 이전에 비드에 결합하고 페닐 클로로포름 추출로 세척한 다음 에탄올 침전으로 세척한 RNA를 포함하는 상등액을 제거하고 펠릿을 0.1XT 완충액 50마이크로리터에 다시 현탁시킵니다.

다음으로, 리버스 범용 프라이머를 사용하여 샘플을 리버스 트랜스크립션합니다. 다음 PCR는 보편적인 뇌관을 가진 표본을 증폭합니다, 그 중 하나는 T 7 프로모터를 포함해야 합니다. 풀을 증폭하는 데 필요한 사이클 수는 co ip의 효율성에 따라 달라집니다.

ambion의 메가 반바지 스크립트 키트를 사용하여 샘플을 다시 전사하되 이번에는 키트와 함께 제공되는 T seven UTP 대신 2마이크로리터의 아미노 대립유전자 UTP를 추가합니다. 아미노 대립유전자 UTP는 나중에 옆 눈으로 RNA를 표지하는 데 사용됩니다. 전사가 완료된 경우.

페닐 클로로포름 추출물과 에탄올이 샘플을 침전시킵니다. 샘플의 어레이에 대한 혼성화를 방해할 수 있는 글리코 블루 또는 암모늄 아세테이트를 사용하지 마십시오. Resus는 펠릿을 4.5마이크로리터의 0.1몰 탄산나트륨에 현탁시킵니다.

먼저 샘플에 라벨을 지정하려면 총 샘플에 2.5마이크로리터의 뉴클레아제 자유수를 추가합니다. 3 마이크로 리터의 S3와 3 마이크로 리터의 SCI 5에서 IP 샘플에 추가합니다. 어둠 속에서 1시간 동안 배양합니다.

실온에서 각 샘플에 6마이크로리터의 4몰 하이드록실 라민 HCL을 첨가하고 철저히 혼합한 후 회전시켜 반응을 종료합니다. 실온에서 15분 동안 잠시 배양하고 페닐 클로로포름 추출로 라벨링된 샘플을 정제한 다음 에탄올 침전을 수행합니다. 대부분의 색상은 유리 뉴클레오티드와 함께 유기상으로 당겨지기 때문에 펠릿이 눈에 띄게 착색되지 않을 수 있습니다.

Resus는 각 펠릿을 0.1XTE의 50마이크로리터에 현탁합니다. Agilent 어레이 혼성화 키트 지침에 따라 마이크로어레이 샘플을 준비하지만 다음 예외가 있습니다. RNA를 단편화하지 마십시오: 단편화 완충액을 추가한 후 즉시 혼성화 완충액을 추가하여 단편화를 중지하십시오.

샘플을 어레이에 놓고 어레이가 회전하는 동안 3시간 동안 섭씨 50도에서 혼성화합니다. 50ml 원뿔형 튜브에 다음 50ml 용액을 준비합니다. 2개의 초과 SC 완충액으로 구성된 튜브 1개, 1개의 초과 해상 완충액으로 구성된 튜브 2개 및 탈이온수 튜브 1개.

3시간 배양 후 어레이 슬라이드 샌드위치를 조심스럽게 풀고 두 개의 XSSC 버퍼에 넣습니다. 핀셋을 사용합니다. 덮개 슬라이드에서 어레이를 부드럽게 분리합니다.

어레이를 만지지 않도록 주의하면서 커버 슬라이드를 부드럽게 제거합니다. 슬라이드를 당겨 빼내면 원뿔형을 닫고 60초 동안 부드럽게 뒤집습니다. 핀셋을 사용하여 어레이를 하나의 XSSC 솔루션으로 전송합니다.

튜브의 뚜껑을 덮고 1분 동안 부드럽게 뒤집습니다. 그런 다음 어레이를 두 번째 XSSC 솔루션으로 옮기고 다시 1분 동안 부드럽게 반전시킵니다. 마지막으로 어레이를 탈이온수 튜브로 옮기고 30초 동안 부드럽게 뒤집습니다.

슬라이드의 가장자리를 김 물티슈에 올려 어레이를 건조시킵니다. 와이프에서 어레이를 계속 회전하면서 올리고가 포함된 면이 방해받지 않도록 합니다. 빈 원뿔형 튜브에 어레이를 놓고 어레이 스캔을 진행합니다.

어레이 스캔을 진행합니다. 다음은 대표적인 배열입니다. 각 피처 또는 올리고는 총 비보강 풀의 경우 녹색으로, IP 보강 풀의 경우 빨간색으로 표시됩니다.

각 특징의 신호는 해당 채널의 총 강도로 정규화됩니다. 최종 출력은 녹색 채널에 대한 빨간색 채널의 로그 비율입니다. 어레이의 각 기능에서 각 게놈 좌표의 평균 점수가 지정된 위치에 매핑됩니다.

이 평균 단계의 그림은 2, 4 및 0.5의 점수와 함께 3개의 중첩되는 30개의 뉴클레오티드 올리고에 대해 제공되며, 여기서 각 10개의 뉴클레오티드 창에 대한 평균 농축 점수가 표시됩니다. 다음은 CLTA 유전자에서 poly perine 추적 결합 단백질 PTB에 대한 결합 체계의 예이며, 유전자 특징은 하단을 따라 제공되며 PTP 결합 S에 대한 로그 평균 농축 점수는 짙은 빨간색 수직 막대로 표시됩니다. 연한 빨간색 막대는 PTP 바인딩에 대해 보강되지 않은 영역을 표시합니다.

방금 양자택일로 얇게 썬 축삭돌기와 같은 관심 영역을 가로질러 타일링하는 올리고뉴클레오티드 풀을 빠르고 효율적으로 만드는 방법을 보여드렸습니다. 우리는 마이크로어레이로 풀을 분석하지만 발광, Lexi 염기서열분석 또는 보다 전통적인 Sanger 염기서열분석으로 염기서열분석을 할 수도 있습니다. 이 절차를 수행할 때 풀 생성은 RNA 또는 단백질 수준에서 변형될 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

RNA 수준에서는 자가 영역, 질병 돌연변이, 다형성 또는 무작위 돌연변이를 올리고뉴클레오티드 염기서열에 도입할 수 있습니다. 단백질 수준에서, RNA 결합 인자는 인산화(phosphorylation) 또는 다른 번역 후 변형(post-translational modification)에 의해 변형될 수 있습니다. 또한, 결합 환경은 관심 있는 RNA 결합 단백질과 경쟁하거나 상호 작용하는 추가 인자의 수준을 높이거나 낮추도록 조작할 수 있습니다.

그게 다야. 시청해 주셔서 감사드리며 실험에 행운을 빕니다.