الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة وبناء التنموي سمية فحوصات للسلامة الكيميائية الفحص وبيولوجيا الأنظمة توليد البيانات

الهدف العام من هذا الإجراء هو وصف نظامين لاختبار السمية النمائية في المختبر بناءً على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ودراسات النسخ المتعددة (transcriptome). ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية على الخلايا الليفية الجنينية للفئران. وتتمثل الخطوة الثانية إما في ترك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لتكوين أجسام جنينية (Embry bodies) يمكنها من خلالها توليد خلايا من الطبقات الجرثومية الثلاث جميعها، أو تمايزها إلى سلائف عصبية خارجية المنشأ.

بعد ذلك، يتم معالجة أجسام الأجنة أو أسلاف الأديم الظاهر العصبي بالمركبات محل الدراسة بتركيزات مختلفة أثناء التمايز. وتتمثل الخطوات النهائية في تقييم حيوية الخلايا وعزل الـ RNA. وفي نهاية المطاف، يُستخدم تحليل المصفوفات الدقيقة للترانسكريبتوم لإظهار التغيرات في تعبير الـ RNA للخلايا المعالجة بالمركبات محل الدراسة مقارنة بخلايا التحكم غير المعالجة. واستناداً إلى الخلايا الجذعية العصبية البشرية والمصفوفات الدقيقة للحمض النووي DNA، قمنا بتطوير منهجية مخبرية تتيح مراقبة تأثيرات السمية التنموية ذات الصلة بالبشر.

يمكن تطبيق هذه المنهجية من قبل الصناعات الدوائية والكيميائية لإجراء فحص السلامة للأدوية المحتملة والسموم البيئية. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال السمية النمائية، مثل تأثير المواد الكيميائية على التطور العصبي في مراحله المبكرة جداً. للبدء، يتم إذابة مكمل وسط الخلايا الجذعية في درجة حرارة الغرفة، ثم تضاف 100 milliliters منه إلى 400 milliliters من وسط الخلايا الجذعية الأساسي.

بعد ذلك، قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي على الثلج، ثم أضف الحجم التكميلي من المصفوفة إلى 24 milliliters من وسط dmm. F 12 الأساسي المبرد وفقاً لتوصيات الشركة المصنعة، وامزج المحلول عن طريق السحب والضخ برفق باستخدام الماصة، ثم أضف two milliliters من الخليط إلى 12 طبقاً منفصلاً بقطر ستة سنتيمتر. قم بتحضين الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة حتى تغطي المصفوفة الأطباق.

بعد ذلك، قم بإزالة الوسط وأضف 2 mL من وسط الخلايا الجذعية. ثم، أخرج أربعة أطباق وصلت إلى حالة الالتحام من الحاضنة، والتي تحتوي على خلايا H9 الجنينية البشرية المنماة على طبقات مغذية من الخلايا الليفية الجنينية للفئران والمعدة كما هو موضح في البروتوكول المرفق؛ وباستخدام رأس ماصة سعة 1 mL وتحت المجهر المجسم (stereoscope)، قم بإزالة المستعمرات المتمايزة من الطبق.

تتميز المستعمرات غير المتمايزة بحدود واضحة وتكون الخلايا فيها متراصة، بينما تبدأ الخلايا المتمايزة في الانتشار خارج الحدود وتكون خلاياها أكبر حجماً. قم بشفط الوسط وغسل الخلايا بأربعة milliliters من PBS. ثم أضف اثنين milliliters من وسط الخلايا الجذعية باستخدام المجهر المجسم (stereoscope).

قم بتقطيع المستعمرات إلى ست إلى تسع قطع باستخدام إبرة قياس 26 gauge، ثم اكشط التجمعات باستخدام رؤوس ماصات سعة 1 milliliter. اجمع المستعمرات المقطعة برفق في أنبوب فالكون سعة 50 milliliter وقم بترسيبها عند 200 G لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، اسحب السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 12 milliliters من وسط زراعة الخلايا الجذعية.

ضع 20 µL من معلق الخلايا على شريحة زجاجية وقم بعدد الكتل تحت المجهر. اضبط تركيز المعلق ليصل إلى 150 كتلة لكل mL، ثم أضف 2 mL من المعلق في كل طبق قطر 6 cm. حرك الأطباق للأمام والخلف ومن جانب إلى آخر لتوزيع الخلايا بشكل متجانس، ثم قم بحضن الأطباق في حضانة زراعة الخلايا يوماً بعد يوم.

تغيير الوسط بعناية: بعد إزالة المستعمرات المتمايزة، أضف 40 µL من محلول بوليمر إسهامي تساهمي (block copolymer) معقم بتركيز 5% إلى كل بئر في طبق Vbo ذو 96 بئراً، واتركه ليحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة. أخرج الطبق المكتمل الذي يحتوي على مستعمرات من الحاضنة، وانتقِ أي مستعمرات متمايزة تحت مجهر ستيريوبوكوب (stereo microscope) باستخدام طرف ماصة سعة 1 mL. بعد ذلك، اسحب الوسط من الطبق واغسل الخلايا بلطف باستخدام 4 mL من PBS.

بعد ذلك، أضف 2 mL من وسط التمايز العشوائي إلى كل طبق. استخدم أداة النقل لتقطيع مستعمرات خلايا H9 إلى كتل ذات حجم موحد. اكشط الكتل باستخدام مكشطة الخلايا واجمعها برفق في أنبوب فالكون سعة 50 mL للطرد المركزي.

يتم طرد المستعمرات مركزياً عند 200 G لمدة خمس دقائق، ثم يتم سحب السائل وإعادة تعليق الخلايا في وسط تمايز عشوائي بتركيز 1000 مستعمرة لكل milliliter. بعد ذلك، يتم سحب البوليمر المشترك الكتلي من طبق 96 بئراً ذي قاع على شكل V. وبمساعدة ماصة متعددة القنوات، يتم إضافة 100 µL من معلق المستعمرات إلى كل بئر، ثم يتم تجميع المستعمرات في قاع الآبار ذات الشكل V عن طريق طرد الطبق مركزياً عند 4 °C لمدة أربع دقائق عند 400 G. ثم يوضع الطبق في الحاضنة لمدة أربعة أيام. وباستخدام رؤوس ماصات ذات فتحة واسعة سعة 200 µL، يتم إزالة الأجسام الجنينية من طبق 96 بئراً ووضعها في طبق مربع معقم مقاس 122 millimeter.

بعد ذلك، استخدم ماصة سيرولوجية معقمة سعة 10 milliliter لنقل أجسام الأجنة من الطبق المربع إلى أنبوب فالكون سعة 15 milliliter. اترك أجسام الأجنة لتترسب لمدة دقيقتين، ثم اسحب السائل السطحي واغسل أجسام الأجنة باستخدام 5 milliliter من PBS. مرة أخرى، انتظر حتى تترسب أجسام الأجنة لمدة دقيقتين، ثم اسحب السائل السطحي.

في هذه الخطوة، أعد تعليق أجسام الأجنة في 5 mL من وسط التمايز العشوائي. بعد ذلك، انقل أجسام الأجنة إلى طبق بكتيري بقطر 10 cm وأضف 10 mL إضافية من وسط التمايز العشوائي. حضّن الأطباق عند 37 °C و 5% CO2 على هزاز أفقي.

تظهر أجسام الأجنة النموذجية لليوم الخامس واليوم التاسع واليوم 14 عند سرعة 50 RPMs. قم بتغيير الوسط بعناية كل يومين، مع استبدال جميع الـ 15 milliliters بوسط تمايز عشوائي طازج. ولتقييم تأثير الدواء على التمايز، ابدأ بإضافة الدواء إلى الوسط في اليوم الخامس لمدة 10 أيام كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق.

باستخدام ماصة معقمة، اجمع أجسام الأجنة من أطباق الـ 10 centimeter في أنبوب falcon سعة 15 milliliter. اتركها لتترسب لمدة دقيقتين، ثم اسحب السائل الطافي. اغسلها باستخدام 5 milliliter من PBS وانقلها إلى أنبوب سعة 1.5 milliliter خالٍ من النوكلياز.

اتركها لتترسب ثم اسحب السائل الطافي. قم بتعليق أجسام الأجنة في 1 mL من كاشف triol ومرر المحلول عبر إبرة قياس 24 باستخدام حقنة سعة 1 mL حوالي 15 مرة لتفتيت الخلايا. بعد ذلك، أضف 200 µL من الكلوروفورم إلى كل عينة.

قم برج المحتويات باستخدام جهاز الـ Vortex لفترة وجيزة، ثم قم بطرد العينات مركزياً عند 12, 000 G لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية، واجمع السائل الطافي في أنابيب سعة 1.5 milliliter دون تعكير أي من الطبقات الأخرى. بعد ذلك، أضف حجماً مساوياً من الإيثانول 70% المبرد إلى السائل الطافي واخلط المحتويات برفق عن طريق الرج. انقل 700 microliters من الخليط إلى عمود طرد مركزي صغير (mini spin column) واتبع تعليمات الشركة المصنعة لتنقية الـ RNA في خطوة الاسترداد النهائية.

أضف 22 µL من الماء الخالي من النيوكلياز إلى عمود الطرد المركزي، ثم قم بطرد الأنابيب مركزياً عند 12,000 G لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، أخرج أنبوب التجميع وضع الـ RNA على الثلج. أضف 1 mL من الـ prewarm disc space لكل قارورة T 25 متراصة من خلايا H nine، ثم قم بحضن القارورة لمدة تسع دقائق عند 37 °C.

بعد ذلك، أضف 2 mL من وسط الغسيل المُدفأ مسبقاً إلى الخلايا المعالجة التي تم إزاحتها، واستخدم ماصة سعة 5 mL للسحب والتفريغ بلطف خمس مرات. ثم انقل محلول الخلايا إلى أنبوب فالكون.

بعد ذلك، اغسل الدورق بتسعة ملليلترات من وسط الغسيل وأضفه إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا. قم بطرد مركزي للخلايا المحصودة لمدة ثلاث دقائق ونصف عند 500 G. ثم قم بإزالة السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 10 ملليلترات من وسط الغسيل. قم بطرد مركزي للخلايا مرة أخرى لمدة ثلاث دقائق ونصف عند 500 G، ثم قم بإزالة السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في أربعة ملليلترات من وسط الخلايا الجذعية الجنينية البشرية، وأضف 0.5 ملليلتر من معلق الخلايا و 4.5 ملليلتر من الوسط الطازج في دورق T 25 طازج مغسول بـ PBS يحتوي على أرومات ليفية جنينية للفئران مثبطة انقسامياً.

قم بتغيير الوسط الزرعي في الدورق يومياً. قم بطلاء طبق بقطر 10 سنتيمتر بـ 0.1% gelatine في PBS واحضه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك، قم بحصد الخلايا الجذعية الجنينية البشرية عن طريق إزالة الوسط الزرعي وإضافة 1 مل من acuta إلى دورق T 25 بينما تنفصل الخلايا.

أضف 6.6 milliliters من الوسط البارد إلى 330 microliters من مصفوفة الغشاء القاعدي المجمدة. قم بترشيح المحلول عبر مصفاة خلايا بمسامية 40 micrometer واستخدم one milliliter من المحلول المُرشح لتغطية كل بئر في طبق سداسي الآبار. سيتم لاحقاً زرع الخلايا على الأطباق المطلية بعد تحضين الخلايا الجنينية البشرية لمدة 30 minute مع Accutane، ثم أوقف التفاعل بإضافة 1.5 milliliters من وسط Hess.

قم بكشط الخلايا من الدورق، ثم أضف ثمانية ملليلترات إضافية من وسط Hess. قم بتحضير محلول خلوي أحادي عن طريق السحب والضخ بلطف باستخدام ماصة سعة 10 ملليلتر، ثم قم بترشيح الخلايا عبر مصفاة خلايا بمسامية 40 ميكرومتر، وبعد ذلك قم بطرد الخلايا مركزياً لمدة ثلاث دقائق عند 500 G، وأزل الطافي ثم أعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من الوسط، وقم بطرد الخلايا مركزياً مرة أخرى لمدة ثلاث دقائق عند 500 G. ثم أزل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من وسط Hess S المحتوي على مثبط rock Y 2 7 6 3 2 بتركيز نهائي قدره 10 ميكرومولار.

بعد ذلك، قم بإزالة الطافي من طبق الطبقة المغطى بالجيلاتين، واترك معلق الخلايا على الطبق المغطى بالجيلاتين ثم حضّنه لمدة ساعة واحدة بالضبط عند 37 درجة مئوية. خلال هذه الخطوات، ستترسب الخلايا الليفية (hypoplast) على الأطباق المغطاة بالجيلاتين بينما تظل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية حرة. يعد وقت الطفو أمراً بالغ الأهمية، حيث إن التحضين لفترة طويلة جداً سيؤدي إلى تكتل الخلايا الجذعية، بينما سيؤدي التحضين لفترة قصيرة جداً إلى إزالة عدد قليل فقط من هذه الخلايا الليفية بمجرد التصاقها.

استخدم الوسط الموجود في الطبق لغسل الخلايا الجذعية غير الملتصقة بلطف وإزالتها من الطبق. اغسل الطبق مرة ثانية باستخدام 10 milliliters من وسط Hess، ثم اجمع الخلايا وقم بطردها مركزياً لمدة ثلاث دقائق عند 500 G، وأزل السائل الطافي الناتج وأعد تعليق الخلايا في حوالي أربعة milliliters من الوسط المكيف الذي يحتوي على 10 micromolar من مثبط rock Y 2, 7, 6, 3, 2 و 10 nanograms per milliliter من عامل نمو الخلايا الليفية الثاني fiberblast growth factor two. بعد ذلك، اخلط الخلايا مع trian blue وقم بعدها باستخدام لوحة hemo cytometer.

18,000 خلية لكل سنتيمتر مربع على الطبق قبل الغشاء القاعدي. تُغطى الخلايا في الأطباق المطلية بـ 1.5 ملليلتر من الوسط لكل بئر، وتُحضن عند 37 درجة مئوية و5% ثاني أكسيد الكربون. بعد 24 ساعة، يتم تجديد الوسط. وبعد 24 ساعة أخرى، يُستبدل الوسط بوسط مكيف طازج مُدعم بـ 10 نانوغرام لكل ملليلتر فقط من عامل نمو الخلايا الليفية 2 لمدة 72 ساعة.

بعد استزراع الخلايا، استبدل الوسط بوسط بديل المصل لتعطيل الجينات (knockout serum replacement medium). وتعتبر هذه النقطة الزمنية هي اليوم صفر من عملية التمايز. قم بتجديد وسط الخلايا بوسط جديد يومياً خلال الأيام الثلاثة التالية.

عند تغيير الوسط الغذائي في اليومين الرابع والخامس، أضف وسطاً يتكون من 25% من الوسط الغذائي المكمل N2 و 75% من بديل مصل الخلايا المعطلة (knockout serum replacement). وفي اليوم السادس، يتم حصاد الخلايا من الوسط الغذائي لإجراء التحليل. يمكن استخدام الأجسام الجنينية في العديد من الدراسات المختلفة.

فيما يلي مثال لدراسة سمية خلوية توضح تأثير تركيزات متفاوتة من ميثيل الزئبق على حيوية الخلايا. ومن خلال هذا الرسم البياني، تم تحديد أن تركيز 24 micromolar تسبب في موت الخلايا بنسبة 10%، وأن تركيز 1.61 micromolar تسبب في موت الخلايا بنسبة 50% بعد التعرض لمدة 14 يوماً. تم تحليل جزيئات الـ RNAs المعزولة من أجسام أجنة ثلاث مجموعات عولجت بميثيل الزئبق باستخدام مصفوفة دقيقة (microarray) لفحص مجموعة متنوعة من المؤشرات الحيوية.

تظهر العينات التي تعرضت لـ 25 micromolar من الزئبق باللون الأحمر. وتظهر العينات التي تعرضت لـ one micromolar من ميثيل الزئبق باللون الأزرق، بينما يظهر الحمض النووي الريبوزي (RNA) الضابط باللون الأخضر. وتوضح خريطة تحليل المكونات الرئيسية هذه أن الخصائص الجينية لكل مجموعة علاجية تختلف بشكل ملحوظ عن المجموعات الأخرى، حيث تم تعديل أكثر من 276 جيناً بأكثر من ضعفين عند التعرض لتركيز one micromolar من ميثيل الزئبق.

كما تم تعديل 30 من هذه الجينات بواسطة مجموعة التركيز المنخفض عند النقطة 25 micromolar. ويمكن ملاحظة أن 233 من الجينات التي تم تعديلها في مجموعة العلاج بتركيز one micromolar كانت جينات قد انخفض تعبيرها (downregulated)، بينما تم زيادة تعبير 43 جينًا فقط (upregulated) بفعل العلاج. لا تنسَ أن التعامل مع التريازول (triazole) أو النمل التطويري يمكن أن يكون خطيرًا للغاية، ويجب دائمًا مراعاة اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء نظارات الوقاية، وقفازات اليد المقاومة للمواد الكيميائية، وإجراء جميع الأعمال المتعلقة بالتريازول داخل خزانة استخلاص الغازات (fume hood) أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

باتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التلوين، وتكوين الـ feros، والتي قد تختلط مع تكوين الأنابيب لديك، وذلك من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل التثبيت المظهري.