بروتوكول لتمييز الخلايا الجذعية المحفزة البشرية المستحثة في الثقافات المختلطة من الخلايا العصبية والجلد للاختبار العصبي
June 9th, 2017
وتعتبر الخلايا الجذعية المحفزة البشرية (هيبسس) أداة قوية للكشف عن المخدرات والكيمياء ولتطوير نماذج جديدة في المختبر لاختبار السمية، بما في ذلك السمية العصبية. هنا، ويرد وصف بروتوكول مفصل للتمايز هيبس في الخلايا العصبية والدبقية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تمييز الخلايا الجذعية العصبية المشتقة من مستعمرات الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان إلى ثقافات مختلطة من الخلايا العصبية والدبقية. هذا النموذج مناسب لفحص السمية الدوائية والكيميائية. يمكن تطبيق هذا النموذج في المختبر لتقييم الاضطرابات المستحثة كيميائيا لمسارات الإشارات التي يتم تنشيطها أثناء عملية التمايز العصبي والدبقي.
الميزة الرئيسية لهذا النظام هي استخدام نموذج بشري مشتق من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات التي تمثل بديلا للخلايا السرطانية المستخدمة تقليديا والثقافات الأولية الحيوانية وتسمح بدراسة السمية العصبية في مجموعات مختلطة من الخلايا العصبية والدبقية. سيتم عرض الإجراء من قبل فرانشيسكا بيستولاتو ، ما بعد الدكتوراه لدينا ، وكارولينا نونيس ، طالبة دراسات عليا من مختبرنا. ابدأ بمرور مستعمرات hiPSC.
العمل تحت مجهر مجسمة بتكبير أربعة X في خزانة التدفق الصفحي ، استخدم حقنة سعة مليلتر واحد بإبرة قياس 30. قطع مستعمرات الخلايا الجذعية في مربعات تبلغ حوالي 200 ميكرون في 200 ميكرون. يتطلب الاستغناء عن المستعمرات مهارات يدوية جيدة للحصول على شظايا متساوية الحجم.
يمكن أن يساعد استخدام أدوات القطع المتاحة تجاريا. ثم استخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لفصل شظايا المستعمرة عن سطح الطبق عن طريق سحب الوسط الموجود تحته برفق لرفع القطع. انقل 100 قطعة مستعمرة أو نحو ذلك إلى طبق 60 ملم مطلي بمصفوفة مؤهلة من DMEM F12 مملوء بأربعة ملليلتر من وسط hiPSC الكامل.
ثم احتضان الطبق الجديد عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بإجراء تغيير متوسط كلي كل يوم وفحص مورفولوجيا المستعمرات باستخدام مجهر تباين الطور بأربعة تكبيرات X و 10X. في اليوم صفر من إجراء التمايز ، قم بتحديث وسيط hiPSC عن طريق إضافة ثلاثة ملليلتر من الوسط لكل طبق بتري 60 ملم.
ثم قم بقص وفصل شظايا 200 ميكرون كما كان من قبل. ماصة الأجزاء المنفصلة والوسط في أنبوب سعة 15 ملليلترا. شطف الطبق مع ملليلتر من كامل hiPSC وسط واسترجع جميع الشظايا.
ثم جهاز الطرد المركزي عند 112 مرة G لمدة دقيقة واحدة. بعد الطرد المركزي ، قم بسحب المادة الطافية وأعد تعليق الشظايا برفق في خمسة ملليلتر من وسط hiPSC EB الكامل. ضع الحجم الكامل في طبق ثقافة الأنسجة المنخفض للغاية مقاس 60 ملم.
احتضن الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي افحص الخلايا بالمجهر المقلوب. يجب أن تظهر الأجسام الجنينية في اليوم مستديرة ومتميزة عن بعضها البعض كما هو موضح هنا.
ثم ماصة الأجسام الجنينية والوسط من الطبق ونقلها إلى أنبوب 15 ملليلتر. الطرد المركزي للأجسام الجنينية عند 112 مرة G لمدة دقيقة واحدة. في اليوم الثاني ، قم بشفط محلول طلاء المصفوفة القياسي من طبق 60 ملم معد مسبقا وأضف خمسة ملليلتر من وسط الحث الظهاري العصبي الكامل ، أو NRI ، إلى الطبق.
العمل تحت المجهر المجسم بتكبير أربعة X وباستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، اجمع حوالي 50 جسما جنينيا عائما ونقله إلى طبق مطلي واحد. ثم احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، اليوم الثالث من إجراء التمايز ، افحص الطبق تحت المجهر بتكبير 10X للتأكد من أن جميع الأجسام الجنينية متصلة.
ثم قم بإجراء تغيير متوسط كلي برفق باستخدام وسيط NRI كامل. قم بتغيير وسط NRI كل يومين حتى اليوم السابع عندما تكون المجاميع الظهارية العصبية الشبيهة بالوردة مرئية. في اليوم السابع ، قم بتغطية صفيحة مكونة من 96 بئرا عن طريق سحب 100 ميكرولتر من المصفوفة القياسية المخففة في وسط الاستزراع في كل بئر.
في اليوم الثامن ، قم بتقطيع الركام الشبيه بالوردة إلى أجزاء تحت مجهر مجسمة بتكبير 10 أضعاف في ظروف معقمة. لاحظ أن الوريدات تميل إلى الانفصال بسهولة عن الطبق عند لمسها بالإبرة. في هذه الحالة ، قم بفصل الوردة المنفصلة جزئيا بطرف الإبرة.
إذا ظلت الوريدات متصلة جزئيا، فاستخدم ماصة سعة 200 ميكرولتر لإكمال فصل شظايا الوردة. تتطلب قصاصات الوردة مهارات يدوية جيدة ودقة لتجنب عدم قطع مشتقات العصب. بعد ذلك ، اجمع شظايا الوردة ووسطها في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
شطف الطبق مع ملليلتر من وسط NRI لاستعادة جميع الشظايا. ثم قم بتدوير شظايا الوردة بمعدل 112 مرة G لمدة دقيقة أو دقيقتين. بعد شفط المادة الطافية ، قم بتعليق الحبيبات برفق في ملليلتر واحد من التسخين المسبق X DPBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم.
قم بتقطيع شظايا الوردة برفق لأعلى ولأسفل لفصلها جزئيا. ثم أضف أربعة ملليلتر من وسط NRI الكامل واحسب الخلايا باستخدام تريبان بلو وعداد خلية آلي. بعد ذلك ، قم بشفط محلول طلاء المصفوفة القياسي من الصفيحة المكونة من 96 بئرا وقم بإيداع الخلايا في الآبار بكثافة حوالي 15،000 خلية لكل سنتيمتر مربع في وسط NRI.
احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم 10 ، قم بإجراء تغيير متوسط كلي باستخدام وسيط التمايز العصبي الكامل. تظهر هذه الصورة التمثيلية وريدات بعد 12 يوما في المختبر ملطخة باللون الأخضر وبيتا ثلاثة توبولين باللون الأحمر.
هنا تم تلطيخ الخلايا التي نمت لمدة 28 يوما في المختبر من أجل بيتا ثلاثة توبولين باللون الأحمر و NF200 باللون الأخضر. تظهر هذه الصورة التمثيلية الخلايا العصبية المتمايزة عن الخلايا العصبية العصبية بعد 21 يوما في المختبر ملطخة ب NF200 باللون الأحمر والسحب باللون الأخضر. هنا يتم تلطيخ الخلايا الدبقية من نفس الثقافة ل GFAP باللون الأحمر.
يقارن هذا الرسم البياني القياس الكمي ل nestin و MAP two و GFAP وحمض جاما أمينو بوتيريك وناقل الغلوتامات الحويصلي الأول والخلايا الإيجابية لهيدروكسيلاز التيروزين في مشتقات IMR90 hiPSC والخلايا المتمايزة عن الخلايا الإشعاعية السرطانية المشتقة من IMR90 hiPSC. تظهر صور تباين الطور هذه التي تم التقاطها باستخدام هدف 10X الخلايا الجذعية العصبية التي تخضع للتمايز لمدة 21 يوما. باتباع هذه الإجراءات ، يمكن إجراء قراءات أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي وإعادة التحليل متعدد الأطراف من أجل تقييم علم وظائف الأعضاء والنمط الظاهري للخلايا العصبية والدبقية وتقييم تأثير المواد الكيميائية.
لا تنس أن العمل مع المركبات الكيميائية يمكن أن يكون خطيرا للغاية. لهذا السبب يجب دائما اتخاذ الاحتياطات ذات الصلة باستخدام نظارات واقية أو قفازات أو قناع تحت غطاء التدفق خاصة عند إجراء العلاجات الكيميائية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على مجموعة متنوعة مختلطة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية بدءا من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية والتي تمثل نموذجا مناسبا ، في نموذج المختبر ، للتطوير في اختبار السمية العصبية.
المحة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً مفصلاً لتمييز الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSCs) إلى مزيج من ثقافات الخلايا العصبية والخلايا الدبقية. يعتبر هذا النموذج في المختبر مفيدًا بشكل خاص لفحص سمية العقاقير والمواد الكيميائية، بما في ذلك تقييمات السمية العصبية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- علم السموم
الخلفية
- الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSCs) هي أداة متعددة الاستخدامات لنمذجة الأمراض البشرية.
- توفر بديلاً لخطوط الخلايا السرطانية التقليدية والنماذج الحيوانية.
- فهم السمية العصبية أمر بالغ الأهمية لتطوير الأدوية واختبار السلامة.
- يهدف هذا البروتوكول إلى إنشاء ثقافة مختلطة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية لأغراض البحث.
غرض الدراسة
- لإنشاء نموذج موثوق به في المختبر لتقييم السمية العصبية.
- لتفريق الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSCs) إلى خلايا عصبية وخلايا دبقية بشكل فعال.
- تسهيل فحص العقاقير والمواد الكيميائية باستخدام الخلايا المستمدة من البشر.
الطرق المستخدمة
- نقل مستعمرات الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSCs) وتحضيرها للتمايز.
- استخدام وسائط محددة لتحريض الخلايا العصبية الظهارية والتمايز العصبي.
- استخدام المجهر لمراقبة شكل الخلايا وتقدم التمايز.
- تحديد أنواع الخلايا المتمايزة كمياً باستخدام تقنيات التلوين المناعي.
النتائج الرئيسية
- تم تحقيق التمايز الناجح للخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSCs) إلى خلايا عصبية وخلايا دبقية.
- تمت ملاحظة تغيرات شكلية مميزة خلال عملية التمايز.
- أظهرت التحليلات الكمية وجود العديد من العلامات العصبية.
- أظهر النموذج إمكانية استخدامه في تطبيقات فحص السمية.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة قوية لتوليد ثقافات مختلطة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSCs).
- يمكن استخدام النموذج المطور لدراسة السمية العصبية وتأثيرات العقاقير.
- قد توسع الدراسات المستقبلية هذا النموذج لاستكشاف العوامل السمية العصبية المختلفة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This protocol enables the generation of human-derived mixed neuronal and glial cultures from hiPSCs, providing a physiologically relevant in vitro system for neurotoxicity testing. By modeling human-specific pathway perturbations—such as Nrf2 activation in response to mitochondrial inhibitors like rotenone—the assay supports mechanistic de-risking in early discovery. The system aligns with pathway-based toxicity paradigms, improving predictive confidence for chemical safety assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by assessing chemical perturbation of differentiation-associated signaling pathways.
- Operational Value: Provides a renewable human cell source that reduces reliance on animal models and cancer cell lines for target validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable outputs (e.g., marker expression via immunostaining, qPCR) for screening compound effects on neuronal and glial phenotypes.
- Operational Value: Supports assay standardization through defined differentiation stages and reproducible morphometric readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical work by modeling human neuroglial interactions and pathway-level responses to toxicants.
- Operational Value: Enables continuity in testing cascades from hit identification to lead optimization using a consistent human-relevant system.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting early target validation through phenotypic screening and enabling downstream lead identification via pathway-specific readouts.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on neurotoxic mechanisms by monitoring glial and neuronal marker dynamics during differentiation.
- Screening: Delivers assay-ready mixed cultures with defined neuronal (e.g., βIII-tubulin, NF200) and glial (e.g., GFAP) populations for compound screening.
- Analytics: Generates quantitative data (e.g., marker-positive cell counts, pathway activation) to compare treatment conditions and assess biological relevance.
- Translational Research: Models human neuroglial co-culture responses, supporting extrapolation to preclinical safety profiling.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, bankable differentiation protocol applicable across multiple neurotoxicant screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target confidence by reducing mechanistic ambiguity in neurotoxicity pathways through human-relevant models.
- Operational Value: Promotes reproducibility via standardized fragmentation, plating, and medium transition steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early insight into pathway-based liabilities, reducing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to perturb conserved neurodifferentiation signaling cascades.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, sterile technique, and microscopy-based morphology assessment.
- Dependent on access to defined media (hiPSC, NRI, neuronal differentiation), extracellular matrix coatings, and low-attachment cultureware.
- Necessitates cross-team standardization for fragment size, plating density, and differentiation timing to ensure batch consistency.
- Adaptation to alternative hiPSC lines may require optimization of dissociation and plating parameters.
- Practical limitations include manual dexterity demands during colony cutting and rosette fragmentation steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:10
Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC) Expansion
7:53
Conclusion
6:36
Results: Differentiation of IMR90-hiPSCs into Mixed Cultures of Neurons and Glia
2:20
HiPSC Differentiation into Mixed Neurons and Glia: Generation of Embryoid Bodies
3:41
Generation of Neuropithelial Aggragates
4:53
Aggregate Dissociation and Neuronal Differentiation
