유전자 특이 발현과 DNA 메틸화 변화와 성상 세포의 전사 활동의 상관 관계

이 실험 절차의 전반적인 목표는 농축된 성상교세포 집단에서 KCNJ 10의 DNA 메틸화 상태를 평가하고, 프로모터의 DNA 메틸화 변화와 전사 활성 사이의 상관관계를 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 FACS sorting을 통해 설치류의 전체 뇌에서 농축된 피질 성상교세포 집단을 분리한 다음, 해당 성상교세포 집단으로부터 DNA를 분리합니다. 그 후, 메틸화 민감성 고해상도 융해 분석(methylation sensitive high resolution melt analysis, MS.HRMA)을 사용하여 KCNJ 10의 DNA 메틸화 상태를 평가합니다.

마지막으로, KCNJ 10 프로모터는 과메틸화되어 있으며, 루시페레이스 분석법을 이용하여 프로모터의 DNA 메틸화 변화와 전사 활성 사이의 상관관계를 분석합니다. 최종적으로 MS-HRMA와 루시페레이스 분석법을 사용하여 KCNJ 10의 DNA 메틸화 상태를 측정하고, 프로모터의 메틸화 변화와 유전자의 전사 활성 간의 상관관계를 측정합니다. 해당 절차의 시연이 이어지겠습니다. 본 실험은 본 연구실의 박사후 연구원이 수행하였으며, 모든 동물 실험은 미국 국립보건원(NIH) 가이드라인을 준수하였고, 앨라배마 대학교 버밍엄 캠퍼스의 동물실험윤리위원회(Animal Care and Use Committee)로부터 동물 사용 승인을 받았습니다.

모든 완충액과 시약은 텍스트 프로토콜에 따라 준비하였습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 안락사시킨 동물의 머리에서 대뇌 피질을 적출한 후, 50 milliliter 원심분리관 상단에 튜브를 삽입할 수 있도록 구멍을 뚫거나 드레멜로 가공합니다. 그 다음, 관에 파파인 용액을 넣습니다.

분리한 피질을 95%O2 및 5%CO2로 평형을 맞춘 해리 배지가 담긴 10 millimeter 배양 접시에 넣고, 깨끗한 면도날을 사용하여 조직을 1 by 1 square millimeter 크기로 잘게 다집니다. 10 milliliter 피펫을 사용하여 조직을 pepane 용액이 들어 있는 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 조직을 배출하기 전, 전송 피펫 바닥에 조직이 가라앉을 때까지 기다립니다.

pepane 용액에 기포가 생기지 않게 하면서 해리 배지의 잔류량을 최소화하기 위해, 37 °C 항온수조에서 20분 동안 배양하는 동안 표면 가스 교환을 통해 95% O2 및 5% CO2를 지속적으로 공급합니다. 배양이 끝나면, 10 mL 전이 피펫을 사용하여 조직을 천천히 10회 팅팅(tate)한 후, 뿌연 세포 현탁액을 실온에서 300 G로 5분 동안 원심 분리합니다. DNA albumin 억제제 용액을 표면 가스 교환으로 평형화하고, 펠렛화된 세포를 해당 용액 3 mL에 재현탁합니다.

그런 다음 제조사의 지침에 따라 상용 불연속 밀도 구배 용액을 준비합니다. 불연속 밀도 구배 용액을 70 G에서 6분 동안 원심 분리합니다. 이후 피펫을 사용하여 배지를 흡입해 제거함으로써 튜브 바닥에서 해리된 세포를 분리합니다.

0.02% bovine serum albumin과 1 mg/mL의 DNA가 포함된 DPBS 또는 선호하는 배지를 2~3 mL 사용하십시오. 재현을 위해 해리된 세포를 현탁시킵니다. 텍스트 프로토콜에 따라 FACS sorting 및 DNA 또는 RNA 추출을 수행하기 전에 40 µm 필터로 세포를 여과하십시오.

바이설파이트(bisulfite) 전환 DNA 서열에 대응하는 프라이머를 설계하고 텍스트 프로토콜에 따라 DNA를 증폭한 후, 선호하는 DNA 폴리머라제와 5 µM 프라이머를 사용하여 각 샘플의 DNA 500~1000 ng 및 동일 동물 종의 0~100% 범위의 메틸화 DNA 표준물을 바이설파이트 전환하십시오. Ms HRM 증폭을 위한 20 µL 반응액을 준비하십시오. 이 표에 따라 DNA 및 메틸화 표준물을 포함한 모든 샘플을 3회 반복 실험으로 수행하고, 분석 소프트웨어 설정에 따라 멜트 곡선(melt curve)의 전이 구간 주변으로 시작 및 종료 파라미터를 설정하십시오.

프리멜트(prem melt) 시작 및 종료 파라미터를 설정하십시오. 이때 두 값의 차이는 0.2에서 0.5 °C가 되어야 합니다. 포스트멜트(post melt) 시작 및 종료 값도 유사하게 설정하고, 메틸화 백분율 표준물질과 그에 해당하는 피크 온도 차이를 이용하여 각 샘플의 피크 온도 차이 데이터를 추출하십시오.

선형 회귀 방정식을 생성합니다. 관심 있는 CpG 섬을 식별하고 텍스트 프로토콜에 따라 CpG 섬 Luc2 플라스미드를 증폭 및 클로닝한 후, 이 선형 회귀 방정식을 사용하여 미지 시료의 메틸화 상태를 추정합니다. Preferred Cutter 소프트웨어를 사용하여 제한효소 절단 부위를 확인하여 이중 절단을 방지하고, 적절한 효소로 시료를 절단한 후 30 µg의 플라스미드를 선형화합니다.

50 µL 반응액 내에서 적절한 온도와 시간 동안 효소를 가열 불활성화합니다. 메틸화를 위해 5 U의 CPG methylate를 사용하십시오. 30 °C에서 13~19시간 동안 700 µg의 선형화된 플라스미드를 처리합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DNA를 정제한 후, 1 µg의 메틸화된 DNA 샘플을 37 °C에서 1시간 동안 배양하여 HpaII 제한 효소 절단을 수행합니다. DNA 정제 후, 시각화를 위해 샘플을 1% agarose DNA 겔에서 100 V로 45분 동안 전기영동합니다. 다음으로, 메틸화된 플라스미드와 비메틸화된 플라스미드를 적절한 제한 효소로 하룻밤 동안 이중 절단하여 전체 길이의 pUC19 벡터와 CpG island 단편을 분리합니다.

소화 후 효소를 열불활성화합니다. 벡터와 삽입물을 분리하기 위해 이중 소화된 샘플을 1% DNA 아가로스 겔에서 100V로 1시간 동안 전기영동합니다. 그 후 UV 차단 보호구를 착용한 상태에서 겔을 블랙라이트에 올리고, 깨끗한 외과용 메스를 사용하여 메틸화된 삽입물과 비메틸화된 삽입물을 절단합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 DNA를 겔 추출한 후, T4 DNA Ligase와 1:4의 벡터 대 삽입물 비율을 사용하여 메틸화 및 비메틸화 삽입물을 비메틸화 벡터에 다시 결합시킵니다. 라이게이션 후 -20°C 또는 얼음 위에서 하룻밤 동안 배양합니다.

DNA를 정제하고 1% DNA agarose gel에 샘플을 전기영동하여 재결합 여부를 확인하며, 재결합된 플라스미드의 농도를 측정합니다. 12-well plate에 well당 140,000개의 CD 54 세포를 분주합니다. 24시간 후, 상용 트랜스펙션 시약을 사용하여 비메틸화된 CpG loop two 플라스미드와 RENilla 또는 다른 대조군 루시퍼레이스 벡터, 또는 메틸화된 CpG loop two 플라스미드와 ELLA 또는 다른 대조군 루시퍼레이스 벡터를 동일한 농도로 세포에 트랜스펙션합니다. 루시퍼레이스 분석을 수행하기 전, 세포가 24시간 동안 트랜스펙션되도록 둡니다.

제조사의 지침에 따라, 루미노미터를 사용하여 각 웰을 3회 반복 측정하십시오. 반딧불이 루시페레이스 활성과 Renilla 또는 다른 대조군의 루시페레이스 활성 비율을 계산하십시오.

메틸화된 반딧불이 대조 루시퍼라아제 활성을 비메틸화된 반딧불이 대조 루시퍼라아제 활성으로 나누어 정규화하십시오. 여기에서 입증된 바와 같이, E-G-F-P-S 100 beta 형질전환 동물의 FACS 정렬을 통해 농축된 성상교세포 집단을 확보했습니다. 전방 및 측방 산란을 기반으로 게이트 집단을 설정하였으며, 브로마이드 사멸 세포 지표를 사용하여 살아있는 세포 집단을 결정했습니다. 여기에 표시된 게이팅은 해리 후 정렬 전과 정렬 후의 EGFP 양성 성상교세포를 나타내는 대표 이미지이며, 이 그림은 성상교세포 특이적 마커의 mRNA가 40배 증가한 것으로 나타난 분리된 EGFP 양성 세포 집단을 보여줍니다.

LDH 1:1. 또한, S100 beta와 NG2가 모두 발현되는 OPC와 성상교세포에도 불구하고, 희소돌기아교 전구세포의 마커인 NG2 mRNA가 4배 감소한 것이 관찰되었으며, 이는 성상교세포 집단이 농축되어 분리되었음을 나타냅니다. 이 표에는 다양한 연령과 마릿수의 동물로부터 분리된 총 RNA 및 DNA가 나열되어 있으며, 이는 이후 단계에서 기대되는 분자 수득량의 참고 자료로 제시되었습니다.

마지막으로, 메틸화된 삽입물을 비메틸화 벡터로 옮긴 후, 관심 유전자의 과메틸화 영역의 전사 활성을 평가하기 위해 듀얼 루시페라아제 분석(dual luciferase assay)을 활용하였습니다. 비메틸화 DNA만을 절단하는 HPA II를 사용하여 플라스미드의 메틸화 상태를 확인하였습니다. 이 영상을 시청하고 나면, FACS를 사용하여 성상교세포(astrocytes)의 농축된 집단을 분리하는 방법뿐만 아니라, 메틸화 민감성 고해상도 멜트 분석(methylation sensitive high resolution melt analysis)과 루시페라아제 분석을 통해 각각 유전자의 DNA 메틸화를 측정하고 프로모터의 DNA 메틸화 변화를 전사 활성과 상관 지어 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.