Name: 유전자 특이 발현과 DNA 메틸화 변화와 성상 세포의 전사 활동의 상관 관계 KCNJ10 (Kir4.1) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 배우세요 KCNJ10 유전자의 DNA 메틸화 상태를 성상 세포에서 평가하고 메틸화 변화와 전사 활동의 상관 관계를 분석하는 방법을. MS.HRMA와 루시퍼라제 분석을 활용하여 후성유전학적 조절 메커니즘을 규명합니다.

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이 작업은 R01NS075062-01A1에 의해 지원되었습니다. UAB Comprehensive Flow Cytometry Core 시설(P30 AR048311, P30 A1027767)에서 수행된 FACS 분류. UAB 신경생물학 핵심 시설의 Scott Philips 박사와 UAB CDIB의 Susan Nozell 박사는 루시페라제 분석의 기술적 측면을 지원했습니다.

모든 동물은 건강 지침의 국립 연구소에 따라 처리되었다. 버밍엄에서 알라바마 대학의 동물 관리 및 사용위원회는 동물의 사용을 승인했다. 1. 전체 뇌 조직에서 성상 (FACS)을 정렬 형광 활성 셀을 사용하여 풍부한 성상 세포 인구에서 RNA와 DNA를 얻기 <ol><li> 1 분 동안 이산화탄소 후 빠르게 목을 벨과 진정 동물. 앨버 커키 등의 알에 설명 된대로 피질을 해부, 26.; 그것은 수막을 제거 할 필요가 없다. 참고 :. S100β에서 eGFP는 (성상 세포 마커) 프로모터를 발현하는 형질 전환 쥐 이타 쿠라 등 (27)에 의해 생성 및 성상 세포의 FACS 정렬을 위해 사용되었다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 비 멸균 조건 하에서 파파인 해리 키트를 사용하여 전체 뇌 균질 물을 준비한다. 10 분 동안 물을 욕조에 37 ℃에서 파파인을 열 활성화합니다. 노트 :파파인 솔루션은 제조업체에서 제공 및 L 시스테인 및 EDTA를 (재료의 표 참조)이 포함된다. <ol><li> 절단 또는 튜브는 95 % O 2 반송하도록 50 ㎖ 원뿔형 튜브의 상단에 구멍을 드레 멜 : 5 % CO 2는 폐쇄 원추형 튜브에 공급되는 (도 1a 참조). 해리 미디어 함유 10mm 배양 접시에 해부 피질 배치 (하여 20 mM 글루코스 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (500 U / ml)로 보충 된 95 %의 O를 평형화 MEM을 2 : 5 % CO 2) (1)에 조직을 말하다 깨끗한 면도날을 사용 X 1mm 2 개. </li></ol></li><li> 파파인 함유 용액 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 10 ㎖를 사용하여 수동 pipetman 전사 조직. 조직이 이월 해리 미디어의 양을 최소화하기 위해 배출 전에 전송 피펫의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 95 % O 2로 평형화 파파인 용액을 보관 : 5 % CO 2 항온 처리 기간 동안 표면을 통하여 가스 교환. 하지 거품 파파인 soluti를 수행에. 37 ° C의 물을 욕조에 20 분 동안 조직을 품어. </li><li> 파파인 솔루션에 다음과 배양, 씹다 조직 느린 속도로 10 ml의 전송 피펫으로 10 배. 실온에서 5 분 1,000 XG에 원심 분리기 흐린 세포 현탁액. <ol><li> 표면을 통한 가스 교환 (제조사에 의해 제공된)의 DNase / 억제제 알부민 용액과 평형의 DNase / 억제제 알부민 용액 3 ml의 세포 펠렛을 다시 일시. 제조업체의 지침에 따라 상업 불연속 밀도 기울기를 준비합니다. </li></ol></li><li> 6 분 동안 1,000 XG 불연속 밀도 구배 스핀. 피펫을 사용하여 바닥 펠렛을 흡입에 의해 튜브의 바닥에서 해리 세포를 분리. </li><li> 0.02 % 소 혈청 알부민 및 1 ㎎ / ㎖의 DNase 또는 배양 배지 HEPES 완충 바람직 DPBS로 2-3 ml 중에 해리 된 세포를 다시 일시 중지. FACS (그림 2A) 전에 40 μm의 필터를 통해 전달합니다. 정렬 될 때까지 얼음 세포를 유지합니다. <ol><li> 외과 (28)를 수행합니다. &lt;/ 리&gt; <li> 4 ℃에서 5 분 2,000 XG에 1.5 ㎖의 원심 분리기 튜브에서 펠렛 세포. 주 : 펠릿의 성상은 즉시 사용 또는 DNA 추출까지 -80 ° C에 보관 될 수있다. </li></ol></li><li> RNA와 DNA를 선호하는 분리 방법 (29) (30)를 사용하여 압축을 풉니 다. 분광 광도계와 bioanalyzer (31)를 통해 RNA 및 DNA 농도와 품질을 평가합니다. 주의 : 후속 단계에서 단지 고품질 RNA 및 DNA를 활용하여 각각 280분의 260 = 2.0~2.2 및 1.8-1.9를. Bioanalyzer 분석은 RNA 분해 또는 DNA 파편에 대해 평가하는 것이 필수적이다. RNA 또는 DNA는 즉시 사용하거나 또는 -20 ° C, 각각 후속 연구를위한 C °에서 -80 저장할 수 있습니다. </li></ol> 2. 메틸화에 민감한 고해상도 용융 분석 (MS-르마)를 사용하여 유전자의 DNA 메틸화 상태를 평가 <ol><li> 유전자에 어떤의 CpG 섬을 식별하는 것이 바람직 온라인 메틸화 매핑 소프트웨어에 관심의 유전자 서열을 입력관심 (32). <ol><li> 중아 대해 디자인 된 프라이머는 DNA 서열 (33)를 변환하여 제조사의 프로토콜에 따라 바람직한 DNA 중합 효소를 이용하여 증폭한다. 45 분 동안 100 V에서 1 % 아가 로스 DNA 젤을 실행하여 증폭 산물의 크기를 확인합니다. -20 ° C에서 20 μM의 재고 농도 스토어 프라이머. </li></ol></li><li> 중아는 같은 동물 종 (34)로부터 0~100%에 이르기까지 각각의 샘플과 메틸화 된 DNA 표준 DNA의 500 ~ 1,000 NG를 변환합니다. 용출 시료 20 NG / μL의 농도를 제공한다. 분광 광도계 (31)를 통해 중아 변환 된 DNA의 농도를 확인합니다. </li><li> 표 1 및 2에 따른 5 μM 농도에서 바람직한 DNA 폴리머 라제 및 프라이머를 사용하여 MS-HRM 증폭 용 셋업 20 μL 반응. 중으로, FACS의 DNA 메틸화 및 표준을 포함하여 모든 샘플을 실행할. </li><li> 분석 소프트웨어에 따라, 미리 설정하고 시작 매개 변수를 중지 포스트용융 곡선의 천이 주위. 세트 미리 용융 개시 및 둘 사이의 차이가 0.​​2 정도로 미리 용융 정지 파라미터 - 0.5 ° C. 후 용융 시작 및 사후 용융 유사 중지를 설정합니다. 각 샘플에 대한 피크 온도 차이 데이터의 압축을 풉니 다. </li><li> 메틸화 백분율 기준 (Y 값)과 대응하는 평균 피크 온도차 (x 값)을 사용하여 선형 회귀 방정식 (도 3A-B, 표 3-4)을 생성한다. 미지 시료 (35)의 메틸화 상태를 추정하기 위해 선형 회귀 방정식을 사용합니다. </li></ol> 3. 루시퍼 라제 분석의 사용을 통해 하이퍼 메틸화 발기인 활동 평가 <ol><li> 표적 유전자 (2.1 단계)의의 CpG 섬을 식별합니다. 이 PCR의 CpG 섬 luc2-37 플라스미드를 제조 luc2 반딧불 루시퍼 라제 리포터 유전자의 상류에 관심 36 클론의 영역을 증폭. </li><li> 제한을 통해의 CpG 섬 - luc2 플라스미드의 30 μg의 선형화효소 소화 38. 제한 다이제스트에 대한 사이트를 확인하고 원하는 커터 소프트웨어 (38)를 사용하여 두 번 상처를 피할 수 있습니다. 제조 업체의 프로토콜에 따라 소화를 다음과 같은 적절한 온도와 시간에 효소를 열 - 불 활성화. DNA의 최소 손실은 선형화 단계에서 발생합니다. </li><li> 30 ° C에서의 CpG 메틸화 (M.Sssl) O / N을 사용하거나 다음과 같은 조정을 제외하고 처리되지 않은 다음과 같은 제조 업체 프로토콜을 남겨 메틸화 선형화 플라스미드. </li><li> 50 μL 반응을 수행합니다. </li><li> 선형화 플라스미드 700 NG 메틸화에의 CpG 메틸화의 5 단위를 사용합니다. </li><li> 13 ~ 19 시간 동안 반응 O / N을 실행합니다. </li><li> 의 CpG 메틸화 반응에 따라, 시판되는 실리카 - 겔 막의 제조 업체의 프로토콜에 따라 키트를 정리 표준을 사용하여 DNA 정리를 수행합니다. DNA의 상당한 손실은 메틸화 된 CpG 반응 30-60 %의 감소에 따라 발생한다. </li><li> HPA II 제한 다이제스트를 통해 플라스미드의 메틸화를 확인합니다. </lI&gt; <li> 메틸화 또는 비 메틸화 된 DNA 1 μg의를 가지고 제한은 37 ℃에서 1 시간 동안 HPA II 다이제스트. 각 μg의 DNA를 위해 HPA II의 5 ~ 10 단위를 사용합니다. HPA II 소화에 따라, 선호, 시판되는 실리카 - 겔 막 청소 키트를 사용하여 DNA 정리를 수행합니다. 시각화를위한 45 분 (그림 4B) 100 V에서 TAE 나 TBE 버퍼에 1 % 아가 로스 DNA 젤에 모두의 CpG 메틸화 및 비 메틸화 된 플라스미드를 실행합니다. </li><li> 적절한 제한 효소와 더블 소화에 따라 모두 메틸화 및 비 메틸화 플라스미드는 전체 길이 루크 2 (벡터)과의 CpG 섬 (삽입) 38 조각을 분리합니다. 제조 업체의 프로토콜에 따라 소화 다음 적절한 온도와 열을 비활성화 효소에서 더블 소화 O / N을 수행합니다. DNA 농도의 손실을 최소화 이중 제한 다이제스트 동안 발생합니다. </li><li> O를 분리 할 수​​ 있도록 1 시간 동안 100 V에서 1 %의 DNA 아가 로스 젤을 두 번 소화 플라스미드를 실행F 벡터 삽입 (그림 4C). 주의. 보호 자외선 얼굴 가리개를 착용, 밴드를 시각화 탁상 블랙 라이트에 DNA 젤을 배치합니다. 깨끗한 수술 블레이드를 사용하여 크기, 소비세 메틸화 및 비 메틸화 삽입 및 비 메틸화 된 벡터 기준으로합니다. </li><li> 포화 페놀, pH가 6.6을 사용하여 젤 추출 DNA. 간단히, 벡터 또는 삽입을 포함하는 DNA 젤 무게. DNA 젤 0.1 g 당 페놀의 100 μl를 사용합니다. 유리 다운스 균질 기에서 페놀을 사용하여 DNA 겔 균질화. </li><li> 클로로포름 (페놀 량의 1/5 사용)을 추가하고 20 초 동안 샘플을 흔들. 2 ~ 3 분 동안 실온에서 샘플을 품어. 4 ° C에서 최대 속도 (16.1 X 1,000 XG)에서 15 분 동안 원심 분리기. </li><li> 수용액을 제거하고, 3 M 아세트산 나트륨 및 에탄올 2.5 배 부피의 0.1X 볼륨. -80 ° C에서 1 시간 동안 샘플을 품어. 인큐베이션 후, 에탄올을 제거하고 바람직한 완충액 30 μL에 DNA를 다시 일시. DNA의 상당한 손실이 삽입 및 벡터의 다음 분리를 발생, 30 % ~ 50 % 싸다SS. </li><li> 재 결찰을 메틸화 및 비 메틸화 된 인서트 T4 DNA 리가 제 (38)를 이용하여 벡터를 비 메틸화. 결찰 반응에 삽입하는 벡터의 4 비율 : 1을 사용합니다. 제조업체의 지침에 따라 설치 반응. 반응 50 μL의 총 부피를 사용하여 C ° 또는 얼음 양동이 위에 뚜껑 얼음에 -20 O / N을 품어. </li><li> 결찰 후, 선호, 시중에서 판매하는 실리카겔 막 청소 키트를 사용하여 DNA 정리를 수행합니다. DNA의 상당한 손실은 연결 반응, DNA의 대략 30 % ~ 50 %의 손실에 따라 발생한다. 45 분 동안 100 V에서 1 % 아가 로스 DNA 젤에 실행하여 재 결찰을 확인하고 재 결찰 플라스미드 (그림 4D)의 농도를 평가합니다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 형질 전환 시약을 이용하여 세포 내로 D54 메틸화 또는 비 메틸화 된 플라스미드를 형질 감염. 잘 0.14 × 10 6 세포 / 12 웰 판에 씨앗 D54 셀. </li><li> 24 시간 후, 형질 세포 위스콘신(1) 비 methyated의 CpG-luc2 플라스미드 + 레 닐라 또는 다른 제어 루시 페라 벡터 또는 (2) 메틸화 된 CpG-luc2 플라스미드 + 레 닐라 또는 다른 제어 루시 페라 벡터 중 하나의 일 동일 농도. </li><li> 세포가 듀얼 루시 페라 제 분석을 수행하기 전에 24 시간 동안 형질을 허용합니다. 제조업체의 지침에 따라 분석을 수행합니다. 루미를 사용하여 측정을 수행합니다. 세중에서 잘 각을 읽어보십시오. </li><li> 레 닐라하는 반딧불 루시 페라 제 활동의 비율 또는 기타 제어 루시퍼 라제 활성을 계산합니다. 비 메틸화를 제어 반딧불 루시페라아제 활성 : 메틸화 반딧불 정상화 제어 루시퍼 라제 활성을 비 메틸화 된 루시퍼 라제 활성에 의해 메틸화 된 루시퍼 라제 활성을 나누어 </li></ol>

저자는 공개하지 않았습니다.

이 프로토콜은 FACS를 통한 풍부한 성상세포 집단의 분리뿐만 아니라 DNA 메틸화와 유전자 발현 사이의 상관 및 원인 연구를 모두 허용하는 다양한 기술을 설명합니다. 단독으로 또는 조합하여 사용되는 이러한 기술은 세포 이질성이 높은 조직으로 작업하거나 특정 유전자 또는 유전자 영역의 DNA 메틸화 상태와 전반적인 DNA 메틸화 변화에 관심이 있는 실험실에 특히 유용합니다. CNS의 후성유전체 연구에서 비교적 독특한 과제 중 하나는 세포 집단의 다양성입니다. 관심 유전자는 CNS에서 시간적 및 공간적으로 고유한 패턴으로 다양한 정도로 발현될 수 있으므로 전체 조직을 사용하면 전사 및 DNA 메틸화 연구 모두에서 데이터를 혼란스럽게 하는 경우가 많습니다. 
관심 단백질인 Kir4.1은 성상세포, 희소돌기아교세포 및 뇌실막 세포에서 공간적, 시간적으로 조절됩니다 13,14,40-47. 따라서, FACS를 위한 eGFP-S100β 형질전환 동물( 27</s...

후성유전학은 게놈의 전사 활성에 영향을 줄 수 있는 화학적 변형에 대한 연구입니다. 본질적으로, DNA 염기서열의 변화 없이, DNA 메틸화, 히스톤 아세틸화, 히스톤 메틸화와 같은 후성유전학적 변형은 유전자 발현 패턴을 가역적으로 변경하기에 충분합니다 1. 유전자 발현의 강력한 조절자인 DNA 메틸화는 가장 잘 특성화된 후성유전학적 변형입니다. DNA 메틸화는 시토신의 C5 위치에 메틸 그룹의 공유 결합이며, 일반적으로 CpG 부위라고도 하는 시토신-구아닌 디뉴클레오티드의 시토신입니다. CpG 사이트의 높은 밀도를 포함하는 영역을 CGI(CpG 고립)라고 합니다. CGI는 전사 시작 부위(TSS) 및 유전자 프로모터 1-3과 자주 연관되어 있습니다. 따라서 CGI에서 DNA 메틸화의 변화가 항상 세포 발현 또는 기능의 변화와 수반되는 것은 아니지만, CGI에서 DNA 메틸화의 변화는 전사 활성에 강력한 조절을 발휘할 수 있습니다 2. 
역사적으로 DNA 메틸화는 배아 발생, 각인 및 발달에 필수적인 것으로 관찰되었으며, 유사분열 후 세포에서 발생하는 DNA 메틸화 수준의 변화는 거의 없었습니다(암 관련 유전자의 변형 제외) 4,5. 그러나 신경후성유전학 분야에서는 DNA 메틸화에 대한 중요한 비발달적 역할을 강조했습니다. 특히, 인지 후성유전학은 DNA 메틸화를 학습과 기억 과정에 필수적인 유전자의 전사 활성화와 억제를 중재하는 데 필수적인 고도의 가소성 메커니즘으로 재정의했습니다 6. 인지적 후성유전학(cognitive epigenetics)과는 별개로, 허혈성 손상(ischemic injury)과 신경병성 통증(neuropathic pain)을 모델링한 연구에서는 DNA 메틸화(methylation)를 다양한 중추신경계(CNS) 모욕에 빠르게 반응하는 불안정한 메커니즘으로 규정한다 7-9. 성상세포와 관련하여, DNA 메틸화가 성상교세포형성(astrogliogenesis)에 중요한 역할을 한다는 것을 시사하는 몇 가지 증거가 있습니다. Fan 등은 신경전구세포(NPC)에서 DNMT1의 조건부 KO가 저메틸화(hypomethylation)의 전반적인 상태와 일치하는 성상세포의 조숙한 발달을 초래한다는 것을 발견했다 10. 또한, Perisic 등은 GLT-1 프로모터의 DNA 메틸화의 차등적 수준이 피질과 소뇌에서 글루타메이트 수송체의 발현의 차등적 수준을 매개한다고 결론지었으며, 성상세포 유전자 발현의 뇌 영역 특이적 패턴을 확립하는 데 있어 DNA 메틸화의 역할을 강조했다 11. 전반적으로, 수많은 연구는 환경, 약물 및 부상이 모두 DNA 메틸화와 종종 유전자 발현을 변화시키는 것으로 나타남에 따라 CNS에서 DNA 메틸화의 역동적이고 불안정한 특성을 강조합니다 4,9. 이러한 신경후성유전학적 연구는 DNA 메틸화가 다양한 중추신경계 병리학을 완화할 수 있는 잠재력을 가진 실현 가능한 치료 표적으로 지적합니다.
후성유전학 분야가 신경 발달 및 질병에서 DNA 메틸화의 역할에 대한 이해를 확장함에 따라, DNA 메틸화를 치료 표적 쪽으로 이동시키는 과제는 상관관계뿐만 아니라 특정 유전자 표적 및 부위를 정의하는 원인 연구를 수행하는 것입니다. 또한 뇌 영역과 세포 유형에 특이적인 DNA 메틸화의 변화를 조사하는 것은 신경후성유전학 분야에서만 볼 수 있는 지속적이고 시간 가치가 있는 과제로 남아 있습니다. 이 프로토콜은 성상세포의 형광 활성화 세포 분류(FACS), 메틸화에 민감한 고분해능 용융 분석(MS-HRM) 및 메틸화 루시페라제 분석을 포함한 다양한 기술을 활용하여 Kir4.1을 암호화하는 유전자인 KCNJ10의 DNA 메틸화 상태를 조사합니다. Kir4.1은 CNS 12-16에서 뇌 영역과 세포 특이적 발현 패턴을 모두 보여주는 신경교 특이적 칼륨 채널입니다. Kir4.1 발현은 주부에서 꼬리 중추신경계 부위로 이동하면서 증가하며, 척수에서 가장 높은 발현이 나타난다 15. 채널은 뇌실막세포, 희소돌기아교세포 및 그 전구세포에서 발현되지만, Kir4.1은 주로 성상세포에서 발현되며 성상세포 휴지막 전위를 과분극 -80mV 12,16-19로 설정하여 글루타메이트 흡수를 지원할 뿐만 아니라 칼륨의 항상성 수준을 유지하는 데 필수적인 것으로 생각됩니다. 중요한 것은 Kir4.1의 발현이 발달 중과 여러 형태의 CNS 손상 20-25 이후에 모두 비정적이라는 것입니다. 우리는 이 채널의 후성유전학적 조절, 특히 발달 중 성상세포에서 조사하고자 했습니다. 사용된 기술은 KCNJ10 유전자 발현을 조절하는 DNA 메틸화의 역할에 대한 인과 증거를 제공하는 유전자 특이적 및 표적 CpG 부위 분석을 제공합니다. 이러한 기술은 다른 유전자에도 적용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Papain 해리 시스템</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>메틸 프라이머</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>CpG Islands</td></tr><tr><td>EZ DNA 메틸화 키트</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td></td></tr><tr><td>Rat Premixed Calibration Standard</td><td>EpiGenDx</td> 국소화를 위한 온라인 소프트웨어<td>80-8060R-프리믹스</td><td></td></tr><tr><td>CpG 메틸라제 (M.Sssl)</td><td>Zymo Research</td><td>E2010</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction&nbsp;</td><td>QIagen</td><td>28704</td><td>겔 추출 및 DNA 정제에 사용</td></tr><tr><td>제한 효소</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEB 커터</td><td>New England BioLabs</td><td>온라인</td><td>제한 분해 사이트 확인</td></tr><tr><td>이중 Luciferase 리포터 분석 시스템</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td></td></tr><tr><td>Luc2 벡터, pGL4.10</td><td>Promega</td><td>E6651</td><td></td></tr><tr><td>레닐라 벡터, pGL4.74</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr><tr><td>TD-20/20 광도계</td><td>터너 설계</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX 및 Plus 시약</td><td>Life Technologies</td><td>A12621</td><td></td></tr><tr><td>페놀, 포화 pH 6.6/6.9</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 17501-100</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c 분광계</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MeltDoctor 마스터 믹스</td><td>Life Technologies</td><td>4415440</td><td></td></tr><tr><td>고해상도 용융(HRM) 소프트웨어 v2.0</td><td>Life Technologies</td><td>4397808</td><td></td></tr><tr><td>AB SDS 소프트웨어 v2.3</td><td>Life Technologies</td><td>온라인</td><td></td></tr><tr><td>AB 고해상도 용융 시작 가이드&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>온라인</td><td></td></tr><tr><td>AB 7900HT 고속 실시간 시스템</td><td>생명 기술</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

유전자 특이 발현과 dna 메틸화 변화와 성상 세포의 전사 활동의 상관 관계<em&gt; kcnj10</em&gt; (kir4.1)

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA 메틸화는 시토신-구아닌 디뉴클레오티드에서 시토신의 C5 위치에 메틸기를 공유 부착하여 유전자 발현을 조절하는 역할을 합니다. DNA 메틸화는 유전자 발현의 오래 지속되고 안정적인 변화를 제공하지만, DNA 메틸화의 패턴과 수준도 다양한 신호와 자극에 따라 변경될 수 있습니다. 이와 같이 DNA 메틸화는 유전자 발현의 강력하고 역동적인 조절자로 기능합니다. 신경후성유전학(neuroepigenetics)에 대한 연구는 DNA 메틸화의 전반적 및 유전자 특이적 변화와 관련된 다양한 생리학적 및 병리학적 상태를 밝혀냈습니다. 특히, 유전자 발현의 변화와 DNA 메틸화 사이의 현저한 상관관계는 신경정신 질환 및 신경퇴행성 질환, 시냅스 가소성 동안, 중추신경계 손상 후에 존재합니다. 그러나 신경후성유전학 분야가 CNS 생리학에서 DNA 메틸화의 역할에 대한 이해를 계속 확장함에 따라 유전자 발현 및 DNA 메틸화의 변화와 관련하여 인과 관계를 설명하는 것이 필수적입니다. 더욱이, 신경과학의 더 큰 분야와 관련하여, 광대한 영역과 세포 특이적 차이의 존재는 전사체, 단백질체 및 후성유전체를 연구할 때 이러한 차이를 해결하는 기술을 필요로 합니다. 여기에서는 RNA 전사와 DNA 메틸화에 대한 후속 검사를 가능하게 하는 피질 성상세포의 FACS 분류에 대해 설명합니다. 또한 DNA 메틸화, 메틸화에 민감한 고분해능 용융 분석(MS-HRMA) 및 루시페라제 프로모터 분석을 검사하는 기술에 대해 자세히 설명합니다. 이러한 결합된 기술의 사용을 통해 DNA 메틸화와 유전자 발현 사이의 상관적 변화를 탐구할 수 있을 뿐만 아니라 주어진 유전자 영역의 DNA 메틸화 상태의 변화가 전사 활성에 영향을 미치기에 충분한지 직접 평가할 수 있습니다.

성상 세포의 풍부한 인구는 eGFP는-S100β 형질 전환 동물 (27)의 FACS 정렬을 통해 인수되었다. 때문에 P0-P40 세 세포와 출생 후 하루 50 (P50)보다 오래된 동물에서 분리 된 분자 분자, 동물의 품질을 감소 그러한 실험에 최적이다. 대뇌 피질 조직을 다음 실험에 사용 하였다. 2-6 동물의 피질 함께 모았다. FACS는 UAB 종합 유동 세포 계측법 핵심 시설에서 수행되었다. 정렬은 벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson) FacsAria II 시행 하였다. eGFP는 음원은 488 nm의 레이저를 사용하여 얻었다; 보상은 필요 없었다. 게이트 인구는 앞으로 및 측면 산란 (그림 1B)를 기반으로 대상으로 하였다. 생균 인구 티듐 브로마이드 사균 표시기를 사용하여 측정하고 (도 1C)을 게이팅 하였다. 두 개의 다른 개체군은 eGFP는 프로파일 (도 1D)에 기초하여 관찰 하였다. 경험적 ...

DNA 메틸화는 다양한 자극에 대한 반응으로 유전자 발현의 역동적인 변화를 허용할 뿐만 아니라 안정적인 수준의 유전자 발현을 유지할 수 있습니다. DNA 메틸화의 유전자 특이적 변화와 이러한 변화가 유전자 발현에 미치는 영향을 연구할 수 있는 기술에 대해 자세히 설명합니다.

유전자 특이 발현과 DNA 메틸화 변화와 성상 세포의 전사 활동의 상관 관계<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 농축된 성상교세포 집단에서 KCNJ 10의 DNA 메틸화 상태를 평가하고, 프로모터의 DNA 메틸화 변화와 전사 활성 사이의 상관관계를 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 FACS sorting을 통해 설치류의 전체 뇌에서 농축된 피질 성상교세포 집단을 분리한 다음, 해당 성상교세포 집단으로부터 DNA를 분리합니다. 그 후, 메틸화 민감성 고해상도 융해 분석(methylation sensitive high resolution melt analysis, MS.HRMA)을 사용하여 KCNJ 10의 DNA 메틸화 상태를 평가합니다.마지막으로, KCNJ 10 프로모터는 과메틸화되어 있으며, 루시페레이스 분석법을 이용하여 프로모터의 DNA 메틸화 변화와 전사 활성 사이의 상관관계를 분석합니다. 최종적으로 MS-HRMA와 루시페레이스 분석법을 사용하여 KCNJ 10의 DNA 메틸화 상태를 측정하고, 프로모터의 메틸화 변화와 유전자의 전사 활성 간의 상관관계를 측정합니다. 해당 절차의 시연이 이어지겠습니다. 본 실험은 본 연구실의 박사후 연구원이 수행하였으며, 모든 동물 실험은 미국 국립보건원(NIH) 가이드라인을 준수하였고, 앨라배마 대학교 버밍엄 캠퍼스의 동물실험윤리위원회(Animal Care and Use Committee)로부터 동물 사용 승인을 받았습니다.모든 완충액과 시약은 텍스트 프로토콜에 따라 준비하였습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 안락사시킨 동물의 머리에서 대뇌 피질을 적출한 후, 50 milliliter 원심분리관 상단에 튜브를 삽입할 수 있도록 구멍을 뚫거나 드레멜로 가공합니다. 그 다음, 관에 파파인 용액을 넣습니다.분리한 피질을 95%O2 및 5%CO2로 평형을 맞춘 해리 배지가 담긴 10 millimeter 배양 접시에 넣고, 깨끗한 면도날을 사용하여 조직을 1 by 1 square millimeter 크기로 잘게 다집니다. 10 milliliter 피펫을 사용하여 조직을 pepane 용액이 들어 있는 50 milliliter 튜브로 옮깁니다. 조직을 배출하기 전, 전송 피펫 바닥에 조직이 가라앉을 때까지 기다립니다.pepane 용액에 기포가 생기지 않게 하면서 해리 배지의 잔류량을 최소화하기 위해, 37 °C 항온수조에서 20분 동안 배양하는 동안 표면 가스 교환을 통해 95% O2 및 5% CO2를 지속적으로 공급합니다. 배양이 끝나면, 10 mL 전이 피펫을 사

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

초기 생활 스트레스시의 DNA methylation 및 유전자 발현 변화를 공부하는 능률적인 작업 흐름이 나타납니다. 갓 태어난 생쥐와 이산 뇌 조직의 고립 모성 분리 월부터, 우리는 동시에 후속 bisulfite의 시퀀싱 및 RT-PCR 분석을위한 두뇌 조직 펀치에서 DNA와 RNA를 분리하기위한 프로토콜을 나타냅니다.

뇌의 작은, 해부학적인 몸의 구조 정의 분야의 DNA Methylation과 유전자 발현의 최적화 분석

절연 hippocampi에서 급성 뇌 조각뿐만 아니라 astrocytes와의 뉴런의 동시 electrophysiological 레코딩의...

급성 Hippocampal 슬라이스에 Synaptically-evoked Astroglial와 Neuronal 응답의 듀얼 Electrophysiological 레코딩

이 연구는 소설 neuronal 축삭과 (천체) glia 공동 문화 플랫폼을 설정하는 절차를 설명합니다. 이 공동 문화 시스템에서 하나의 축삭 (및 단일 glial 세포) 사이의 직접 상호 작용 조작은 glial 신호에 대한 상호 신경 세포의 기계론의 분석을 수 있도록 가능한된다.

마이크로 유체 문화 플랫폼에 Glia 상호 작용 (MCP) 기반 Neuronal 축삭과 Glia 공동 문화 시스템에 신경의 영상 분석

여기에서 우리는 성상 교세포 G 단백질 결합 수용체의 가소성 연구를위한 신경 세포의 항상성 가소성을 유도하기 위해 사용되는 프로토콜의 적응을 설명합니다. 최근 성상 세포 그룹 청소년 생쥐 내가 mGluRs의 변화를 검사하는 데 사용되는 방법은 현장에서 생체 성인 마우스의 조직에서, 다양한 성상 세포의 GPCR의 확장을 측정하고, 성상 세포 수용체의 감도의 더 나은 인식을 얻기 위해 적용 할 수있는 신경 활동의 변화에​​.

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

선조체에서 성상교세포 세포 내 Ca2+ 신호의 특성과 기능은 불완전하게 탐구된 상태로 남아 있습니다. 혈청형 2/5(AAV2/5)의 아데노 관련 바이러스를 사용하여 선조체 성상세포에서 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 발현하는 방법과 선조체 성상세포 내 Ca2+ 신호를 안정적으로 이미지화하는 절차를 설명합니다.

이미징 세포 내 칼슘 2 + 유전자 인코딩 된 칼슘 표시기를 사용하여 성인 마우스의 선조체 성상의 신호

이 프로토콜의 목표는 형광 활성화 세포 분류(FACS) 기술을 사용하여 세포 유형별 유전자 발현, 후성유전학적 마커 및/또는 단백질 발현의 후속 분석을 위해 특정 유형의 신경 세포를 분류하는 것입니다.

쥐 뇌 조직 검사 정렬 형광 활성 셀을 사용하여 셀 타입 별 유전자 발현

5-methylcytosine (oxi mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC)의 산화 형태를 새로 발견 하 고 5-carboxylcytosine (5caC) 독특한 기능 역할을 가진 고유한 DNA 수정 나타낼 수 있습니다. 여기 oxi mCs의 공간 배급, 신호 강도 프로 파일링 및 colocalization의 시각화를 위한 반 정량 워크플로 설명 되어 있습니다.

DNA 수정에 대 한 Immunostaining: 공초점 이미지의 계산 분석

이 보고서의 목적은 강력한 immunohistochemical epigenetic 마커의 검출을 위한 프로토콜을 설명 하기 위해, 5-methylcytosine (5mC) 및 5-hydroxymethylcytosine (5hmC)을 개발 하 고 postmitotic 마우스 망막.

5-Methylcytosine 개발에 5-Hydroxymethylcytosine의 Immunohistochemical 검출 및 Postmitotic 마우스 망막

성상 세포는 대뇌 피질을 균일하게 타일로 만들어 세포 수준에서 복잡한 형태에 대한 분석을 어렵게 만듭니다. 여기에 제공된 프로토콜은 자궁 전기포레이션을 기반으로 하는 다색 라벨을 사용하여 피질 성상신구를 선별하고 사용자 친화적인 이미지 분석 파이프라인을 사용하여 볼륨 및 형태를 분석합니다.

피질 마우스 성상세포를 개별화하기 위해 다각형 게놈 통합 색상(MAGIC) 마커의 자궁 전기포게에서

이 프로토콜은 여러 기억 관련 뇌 영역에 걸쳐 뉴런과 성상교세포로부터 칼슘 신호를 동시에 기록하는 방법을 포괄적으로 설명하며, 학습 및 기억 행동 패러다임에서의 적용 방식을 시연합니다.

학습 및 기억 행동 중 여러 뇌 영역에 걸친 성상교세포-뉴런 활동을 기록하는 이중 색상 섬유 광도 측정법

배우세요 KCNJ10 유전자의 DNA 메틸화 상태를 성상 세포에서 평가하고 메틸화 변화와 전사 활동의 상관 관계를 분석하는 방법을. MS.HRMA와 루시퍼라제 분석을 활용하여 후성유전학적 조절 메커니즘을 규명합니다.

유전자 특이 발현과 DNA 메틸화 변화와 성상 세포의 전사 활동의 상관 관계

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