유전자 특이 발현과 DNA 메틸화 변화와 성상 세포의 전사 활동의 상관 관계 KCNJ10 (Kir4.1)

이 절차의 전반적인 목표는 농축된 성상세포 집단에서 KCNJ 10의 DNA 메틸화 상태를 평가하고 프로모터의 DNA 메틸화 변화를 전사 선택적 활성과 연관시키는 것입니다. 이것은 먼저 사실을 분류하여 전체 설치류 뇌에서 풍부한 피질 성상 세포 집단을 분리함으로써 달성되며, 다음 DNA는 농축 된 성상 세포 집단에서 분리됩니다. 그런 다음 메틸화에 민감한 고해상도 용융 분석 또는 MS를 사용하여 KC J 10의 DNA 메틸화 상태를 평가합니다. 인사말.

마지막으로, KC J 10 프로모터는 과메틸화되고 루시퍼 분석은 프로모터의 DNA 메틸화 변화와 전사 활성의 상관관계를 갖기 위해 활용됩니다. 궁극적으로, MS. HRMA 및 루시페라제 분석법은 KCNJ 10의 DNA 메틸화 상태를 측정하고 프로모터의 메틸화 변화와 유전자의 전사 활성의 상관관계를 파악하기 위해 사용되며, 이를 입증하는 절차를 확인할 수 있습니다. 내 연구실의 박사 후 연구원인 모든 동물은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 지침(National Institutes of Health Guidelines)에 따라 취급되었으며, 버밍엄에 있는 앨라배마 대학의 동물 관리 및 사용 위원회(Animal Care and Use Committee)는 동물 사용을 승인했습니다.

모든 완충액 및 시약은 텍스트 프로토콜에 따라 준비되었습니다. 안락사된 동물의 머리에서 피질을 해부한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 50ml 원뿔형 튜브 상단의 구멍을 잘라내거나 잘라 튜브에 튜브를 공급할 수 있도록 합니다. 그런 다음 튜브에 파핀 용액을 추가합니다.

절개된 피질을 95%O2에서 5%CO2로 평형을 이룬 해리 매질이 들어 있는 10mm 배양 접시에 넣고 깨끗한 면도날을 사용하여 조직을 1제곱밀리미터 조각으로 다집니다. 10 밀리리터 피펫을 사용하여 남성은 조직을 페판 용액이 들어있는 50 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 배출하기 전에 조직이 전사 피펫 바닥에 가라앉도록 합니다.

페판 용액을 버블링하지 않고 운반되는 해리 매체의 양을 최소화하려면 섭씨 37도의 수조에서 20분 동안 배양하는 동안 표면 가스 교환을 통해 95%O2에서 5%CO2의 일정한 흐름을 적용합니다. 배양 후 10ml 전사 피펫을 사용하여 조직을 천천히 10회 테이팅하고 상온에서 300G의 탁한 세포 현탁액을 5분 동안 원심분리합니다. 표면 가스 교환을 통해 DNA의 알부민 억제제 용액을 평형화하고 펠릿화된 세포를 용액 3ml에 재현탁합니다.

그런 다음 제조업체의 지침에 따라 상업용 불연속 밀도 구배를 준비합니다. 불연속 밀도 구배를 70G에서 6분 동안 돌립니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 배지를 흡인하여 튜브 바닥에서 해리된 세포를 분리합니다.

0.02% 소 혈청 알부민과 함께 2-3밀리리터의 DPBS와 1밀리리터의 DNA 또는 선호하는 배지를 사용합니다. reus하려면 해리된 세포를 현탁시킵니다. 텍스트 프로토콜에 따라 사실 분류 및 DNA 또는 RNA 추출을 수행하기 전에 40마이크로그램 필터를 통해 세포를 통과시킵니다.

비스무트 아황산염에 대하여 뇌관을 디자인하고 원본 의정서에 따라 DNA를 증폭한 후에, 아황산염에 의하여 각 표본 및 100%년까지의 DNA를 0에서 100%에 배열하는 메틸을 섞은 DNA 기준의 500에서 1000 nanograms를 선호하는 DNA 폴리메라이제 및 5개의 micromolar 뇌관을 사용하여 동일한 동물성 종에서 메틸을 넣었습니다. Ms HRM 증폭을 위해 20마이크로리터 반응을 설정합니다. 이 표에 따르면 분석 소프트웨어 세트, 사전 및 사후 시작 및 용융 곡선 전이 주변의 중지 매개변수에 따라 팩스, DNA 및 메틸화 표준물질을 포함한 모든 샘플을 3배로 실행합니다.

prem melt, start 및 prem melt stop 매개변수를 설정합니다. 따라서 둘 사이의 차이는 섭씨 0.2도에서 0.5도입니다. 용융 후, 시작 및 중지를 유사하게 설정하고 퍼센트 메틸화 표준물질 및 해당 피크 온도 차이를 사용하여 각 샘플에 대한 피크 온도 차이 데이터를 추출합니다.

선형 회귀 방정식을 생성합니다. 이 선형 회귀 방정식을 사용하여 관심 CPG 섬을 식별하고 텍스트 프로토콜에 따라 CPG 섬 Luke 2 플라스미드를 증폭 및 복제한 후 알 수 없는 샘플의 메틸화 상태를 추정할 수 있습니다. 선호하는 커터 소프트웨어를 사용하여 제한 분해 부위를 확인하여 이중 절단을 피하고 시료가 적절한 효소로 분해된 후 30마이크로그램의 플라스미드를 선형화합니다.

50마이크로리터 반응에서 적절한 온도와 지속 시간으로 효소를 가열합니다. 메틸레이트에 5단위의 CPG 메틸레이트를 사용합니다. 섭씨 30도에서 13-19시간 동안 700마이크로그램의 선형화된 플라스미드

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DNA를 세척한 후 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하여 메틸화된 DNA의 1마이크로그램 샘플에 대해 HPA 2 제한 분해를 수행합니다. DNA를 세척한 후 1%agros에서 샘플을 실행하고 시각화를 위해 100볼트에서 45분 동안 DNA 젤을 사용합니다. 다음 주제, 메틸화 및 비메틸화 플라스미드를 사용하여 하룻밤 사이에 적절한 제한 효소로 이중 소화하여 전체 길이 Luke 2 벡터 및 CPG 섬 단편을 방출합니다.

가열은 소화 후 효소를 비활성화합니다. 1 시간 동안 100 볼트에 1%DNA agros 젤에 두 배 소화된 표본을 달리십시오 벡터를 분리하고 UV 광에 대하여 보호를 착용하고 있는 동안, 까만 빛에 그리고 청결한 외과용 잎으로, 젤 원본 의정서에 따라 DNA를 추출한 후에 메틸화하고 비 메틸을 섞은 삽입을 절제하십시오, T 4 DNA 리가아제와 1-4 비율의 벡터를 사용하여 메틸화 및 비 메틸화 삽입물을 메틸화되지 않은 벡터로 강등시킵니다. 영하 20도의 온도에서 배양하거나 결찰술 후 밤새 얼음 위에서 배양합니다.

DNA를 세척하고 1%DNA aros gel에서 샘플을 실행하여 결찰을 확인하고 12웰 플레이트에서 웰당 140, 000개의 세포에서 재결찰된 플라스미드 CD 54 세포의 농도를 평가합니다. 24시간 후. 시판되는 transfection 시약을 사용하여 non methylated CPG loop two plasmid plus RAN, vanilla 또는 기타 control ferous vector 또는 methylated c pg Luke two plasmid plus ELLA 또는 기타 control lucifer 벡터의 농도가 동일한 농도로 세포를 transfection합니다.루시퍼 분석을 수행하기 전에 세포가 24시간 동안 transfection할 수 있도록 합니다.

제조업체의 지침에 따라 광도계를 사용하여 각 웰을 세 번 읽으십시오. 반딧불이 루시퍼 활동과 런 바닐라 또는 다른 대조군의 비율을 계산합니다. 루시퍼 활동.

메틸화된 반딧불이 제어 루시페라제 활성을 메틸화된 반딧불이 제어 루시페라제 활성으로 정규화하여 메틸화된 반딧불이 제어 루시페라제 활성을 정규화합니다. 여기에서 입증된 바와 같이, E-G-F-P-S 100 베타 형질전환 동물의 팩스 분류를 통해 풍부한 성상세포 집단을 획득했습니다. 게이트 모집단은 전방 및 측면 산란을 기반으로 표적화되었으며, 살아있는 세포 모집단은 브롬화물 사멸 세포 지표 및 게이팅을 사용하여 결정되었으며, 여기에 표시된 것은 해리 후 EGFP 양성 성상세포의 대표적인 이미지이지만, 분류 전과 분류 후, 이 그림은 성상교세포 특이적 마커에 대한 mRNA가 40배 증가한 분리된 EGFP 양성 세포 모집단을 보여줍니다.

LDH 1 L 1. 또한, S 100 beta 및 NG 2 양성 OPC 및 성상세포의 발현을 공유했음에도 불구하고, NG 2 mRNA의 4배 감소, 희소돌기아교세포 전구세포에 대한 마커가 관찰되었는데, 이는 풍부한 성상세포 집단의 분리를 나타냅니다. 이 표는 다양한 연령과 동물의 수에서 분리된 총 RNA 및 DNA를 나열하고 다음 사실을 바탕으로 분자 분자의 예상 수율에 대한 참조로 나열됩니다.

마지막으로, 이중 루시퍼 분석을 사용하여 메틸화된 삽입물을 메틸화되지 않은 벡터로 이동한 후 관심 유전자의 과메틸화 영역의 전사 활성을 평가했습니다. 메틸화되지 않은 DNA만을 분해하는 HPA two를 사용하여 플라스미드의 메틸화 상태를 검증하였다. 이 동영상을 시청한 후에는 메틸레이션 민감성 고해상도 용융 분석 및 루시페라제 분석을 각각 사용하여 유전자의 DNA 메틸화를 측정하고 프로모터의 DNA 메틸화 변화와 전사 활성의 상관관계를 파악하는 방법뿐만 아니라 사실을 사용하여 풍부한 성상세포 집단을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.