Name: 뇌의 작은, 해부학적인 몸의 구조 정의 분야의 DNA Methylation과 유전자 발현의 최적화 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 11 s
Description: 학습하세요 생쥐 모델에서 모성 분리를 통한 초기 생활 스트레스가 뇌 조직의 DNA 메틸화와 유전자 발현에 미치는 영향을 분석하는 방법을. 이 프로토콜은 신경과학 및 후성유전학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 정신과의 맥스 플랑크 연구소와 유럽 연합의 마리 퀴리 초기 교육 네트워크 (니나 계약 238665)에 의해 재정 지원되었다.

1. 조기 삶의 역경에 의해 프로그래밍 모성 분리 (MS)를 초과-임신한 C57BL/6N 마우스 (출생 날에 출생 후의 일 0 (P0))에 의해 전달 새끼 일찍 생활 스트레스 (ELS)을 유도하기 위해 수행됩니다. <ol><li> 개별 새끼는 P1-10에서 3 시에 매일을 위해 (손난로 포함) 깨끗한 새장에 배치됩니다. </li><li> 제어 (비 ELS) 새끼가 전역 산모 둥지에 그대로 남아 있습니다. </li><li> 새끼들은이 표준 실험실 동물 주택 조건 하에서 섹스와 일치하는 그룹 (케이지 당 3-5 생쥐)에 보관되어있는 시간 후 (P21) 이유 때까지 어미와 함께 유지됩니다. </li></ol> 2. 뇌 세포의 분리 및 해부 <ol><li> . 마우스는 경추 탈구 참고하여 원하는 나이에 사망 :이 프로토콜은 스트레스 패러다임 관련이 있기 때문에 어떤 마취는 스트레스 호르몬의 정상적인 생리 조절을 방해하지 않도록, 경추 전위 이전에 부여되지 않습니다. 두개골이 열리고있다두뇌는 -80 ° C.에 저장되기 전에, ISO-pentane-드라이 아이스의 침수에 의해 조심스럽게 제거하고 즉시 스냅인 얼었어 </li><li> 두뇌 (10 μm의 두께) cryosectioned이므로 섹션은 Superfrost 유리 슬라이드에 장착된 및 -20 ° C.로 유지됩니다 PVN - - 주동이의 PVN, bregma의 수준에서 시작하는 부분을 수집하는 표준 마우스 stereotaxic 아틀라스에 대한 참조 (예 : Paxinos 6) 해부 정밀도를 확인하고 관심 영역의 포함 (paraventricular 핵의 뉴런에 예 수 있도록하는 데 사용됩니다 -0.75로 -0.85). </li><li> 섹션은 서로 다른 뇌 구조의 식별을 용이하게하기 위해 cresyl 보라색 물들일 수 있습니다. 관심 지역의 펀치 (0.8 mm)을 (예 : PVN) 로코병의 microdissection에 의해 얻을 수 있습니다. </li></ol> 3. 뇌 펀치에서 핵산 추출 동시에 작은 neuroanatomically 정의 두뇌 레지에서 DNA와 RNA를 추출하기위한 최적화된 프로토콜bisulfite와 유전자 표현 분석을위한 이온은 7 설명되어 있습니다. 참고 : RNA은 GTC - 버퍼에서 DNA보다 덜 안정적인 것을 생각하면, 우리는 RNA가 먼저 처리하는 것이 좋습니다. DNA의 정화에 사용 homogenate 그 시간 동안 실온 (RT)에 보관하실 수 있습니다. <ol><li> guanidinium thiocyanate (GTC) 버퍼 (4.5 M guanidinium thiocyanate, 2퍼센트 N-lauroylsarcosine, 50 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 산도 8.25 MM 트리스-HCL pH는 7.5, 0.1 M 베타 - 메르 캅 토 에탄올, 0.2 % antifoam 400 μl에 피펫과 vortexer를 사용하여 펀치를 Homogenize ) RT에서, 피하 주사기 (29G) (그림 2)를 통해 여러 번 나온다. </li><li> 동등한 부분으로 lysate 분할, RNA와 DNA 모두 특별한 실험적인 필요에 따라 별도로 동시에 추출하거나 수 있습니다. </li><li> isoamyl (24:1) lysate하기 : RNA 정화 들어 NaOAc 중 10분의 1 볼륨, 1 볼륨 AquaPhenol (Appligene) (산도 4) 및 클로로포름 1 / 2 볼륨을 추가합니다. 노골적인 협상 각 단계 이후에 소용돌이와aequous 단계에 70 % EtOH의 동등한 볼륨을 추가합니다;. 10 분, 원심 분리기 (4시 10,000g시 20 분 ° C)에 얼음을 품어 </li><li> RNA의 스핀 열 (Macherey-Nagel의 예 Nucleospin RNA II)로 혼합을 전송하고 온 - 컬럼 DNase - 소화와 세탁 단계 (제조 업체의 프로토콜을 수행)를 수행, 25 μl H 2 O에 관련 elute RNA </li><li> DNA를 정제 위해 Qiagen DNeasy의 혈액 및 조직 키트의 최적화된 프로토콜이 사용됩니다. 버퍼 AL의 동등 권과 100 % EtOH, 스핀 열 원심 분리기에 대한 부하 (RT에서 10,000그램시 1 분)과 lysate와 흐름을 통해 폐기 평형. </li><li> 칼럼에 5 μl RNAse (1 밀리그램 / ML)를 포함하여 500 μl 버퍼 AW1을 넣고 RT에서 10 분 알을 품다. 스핀 (10,000g에서 1 분, RT)과 흐름을 통해 폐기. </li><li> 500 μl 버퍼 AW2와 열을 워시 흐름을 통해 그리고 스핀 - 건조 빈 열 (1만5천g시 1 분) 버리고. </li><li> 추가 prewarmed (70 ° C) 70시 버퍼 AE와 10 분 품어 열 ° C. (1 분 원심 분리하여 Elute, 10,000 G), 흐름을 통해 다시 적용하고 원심 분리 단계를 반복하십시오. </li></ol> DNA와 RNA의 농도를 결정하는 분광 광도계를 사용합니다. 전형 PVN 펀치 수율 ~ 600 NG의 DNA와 RNA ~ 400 NG. 정량 PCR (qPCR)에 의한 유전자 발현 분석을 위해서는 일반적으로 역 전사 반응에서 RNA의 ~ 100 NG를 사용합니다. 4. Bisulfite 전환 나트륨 Bisulfite는 uracils에 비 methylated cytosines로 변환하는 데 사용됩니다. 대조적으로, methylated cytosines가 변환으로부터 보호됩니다. 따라서 bisulfite PCR-amplicon의 마지막 순서에서 검색된 모든 cytosines는 methylated cytosines를 나타냅니다. Bisulfite 변환은 PCR 분석에 제한 요소가 될 수있는 실질적인 DNA의 저하를 일으 킵니다. , 사이 토신 변환을 극대화 DNA의 단편화를 줄이고 더 낮은 온도에서 단일 좌초된 DNA를 유지하는 최적의 반응 조건을 사용하여 달성될 수Qiagen의 EpiTect Bisulfite 키트. 우리 손에 ~ micropunches에서 정화의 DNA 200 NG는 bisulfite 반응에 대한 자료를 시작하는 충분한 양의를 제공합니다. 전환 반응의 효율성의 차이를 방지하기 위해 템플릿 DNA의 금액은 실험 기간 동안 처리된 모든 샘플 중에서 일정한 보관해야합니다. 또한, 시퀀스가​​ 아닌 변환 비 CpGs의 속도를 검사하여 변환 효율을 위해 시시콜콜 따지는해야 읽습니다. 이 비율은 98 %를 초과해야합니다. 낮은 값은 불완전하거나 비효율적인 bisulfite 변환을 나타내고 기본 시퀀스는 분석에서 제외해야합니다. 5. Bisulfite PCR <ol><li> 메틸 프라이머 익스프레스 소프트웨어 (; 디자인 bisulfite는 bisulfite 변환된 DNA (토론 참조)에만 해당하는 primers 시퀀스 <a href="https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&amp;catID=602121" target="_blank">https://products.appliedbiosystems.com/ab을</a>/ EN / 미국 / adirect / AB? cmd를 = catNavigate2 &amp; catID = 602,121)이 도움 및 파일럿 실험에서 최적의 어닐링 온도를 결정하는 데 도움이 될 것입니다. </li><li> 다음과 같이 PCR-마스터 - 믹스 (한 반응에 대한)를 준비 : 2.5 μl 10X PCR 버퍼 0.5 μl 10 밀리미터 dNTPs 앞으로 1 μl 10 μm의 프라이머 1 μl 10 μm의 역방향 프라이머 0.125 μl Qiagen Hotstart DNA 형성 촉매 플러스 H 2 O와 23 μl까지 기입 </li><li> 반응을 2 μl bisulfite-대우 DNA를 추가합니다. </li><li> 다음 조건을 사용하여 증폭 : 1 사이클 6 분 95 ° C 1 분 95 ° C의 45-50주기, 최적 소둔 온도에서 1 분, 1 분 72 ° C 한 사이클 5 분, 72 ° C </li></ol> amplicon의 크기를 확인하고 상업적으로 이용 가능한 PCR 청소 키트를 (사용하는 후속 내고 대한 남아 PCR 반응을 정화 아가로 오스 겔 전기 영동하여 PCR 제품 7 μl를 분석 예 Macherey - 나겔 Nucleospin)을 추출합니다. 추가 바람직하지 PCR 제품이 취득되는 경우, 겔 정화 권장합니다. 6. Bisulfite의 장면 단일 클론 결과에서 추론 고해상도의 DNA methylation 프로필은 DNA의 methylation의 작은 변화를 감지 및 치료 (환경 프로그램)에 반응 규제 영역을 식별할 수 있습니다. bisulfite의 시퀀싱 프로세스는 세 연속 작업 단계로 구성되어 있습니다. 첫째, 사전 bisulfite PCR로 얻은 PCR 제품은 벡터로 출혈도 잡았 및 박테리아로 변환됩니다. 둘째, 단일 클론으로부터 식민지 PCR은 삽입의 정확한 크기를 결정하기 위해 고용됩니다. 셋째, 긍정적인 이민 PCRs는 청소 및 대형 염료 시퀀싱 반응를 받게됩니다. 청소 단계에 따라 제품은 모세관 시퀀서에 electrophoresed됩니다. 6.1 결합 및 변환 주 : 우리는 정기적으로 pGEM-T 벡터 CL에게 사용oning 키트 (Promega). 우리의 경험에서 복제 효율성은 출혈도 잡았되는 삽입이 매우 다릅니다. 재조합 클론의 낮은 숫자가 반복적으로 얻을 수있다 경우에 다른 벡터는 테스트해야합니다. <ol><li> 결합 반응을 설정합니다 : 5 μl 2X 내고 버퍼 1 μl pGEM-T 벡터 한 T4-Ligase μl 3 μl 청소 업 PCR 제품 </li><li> 4에서 밤새도록 pipetting과 부화에 의해 반응을 섞어서 ° C. 참고 : 결합도 역시 RT에서 1 H에 대해 수행됩니다. 4에서 야간 결합을 통해, 재조합 클론의 수를 늘리려면 ° C에서 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 청소 에탄올 침전에 의한 결합 제품 : <ol class="lalpha"><li> 1 μl 글리코겐, 1 μl 3M NaAc 및 액체 질소 1 분 내고 반응 및 석출물 ~ 25 μl 100 % EtOH를 추가합니다. </li><li> 원심 분리기 (4시 30 분 대한 15,0000 g ℃)과 뜨는 버리고. </li><li> 300 μl로 씻으십시오70 % EtOH 및 원심 분리기 (4시 20 분 대한 1만5천그램 ° C는), RT (10 분)에 뜨는 건조 펠릿를 버리고. </li><li> 10 μl H 2 O에 관련 Resuspend 펠릿 </li></ol></li></ol> electrocompetent 박테리아 내고 제품 6.2 변환 <ol><li> 얼음 얼음과 electrocompetent DH5α 박테리아의 영유권에 나누어지는에 Precool electroporation의 cuvettes (1 밀리미터 폭). </li><li> 내고 제품을 청소 10 μl (위 참조) 45 μl DH5α 박테리아를 추가하고 cuvette에 전송할 수 있습니다. </li><li> 1.5 kV, 200 Ω, 15 μF에서 박테리아를 변형하고 직접 펄스 전송 후 prewarmed 개자식 매체의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 37 ° C,에서 1 H 위해 박테리아를 살려내는 IPTG / X-걸 코팅 / 암피실린 플레이트 LB에 현탁액을 100 μl 뿌리 더군요. </li><li> 37 하룻밤 접시 ° C를 품어 </li></ol> 6.3 식민지 PCR 참고 : 단일 클론에서 콜로니 PCR 그 삽입이되도록 실시됩니다예측의 크기. 블루 / 화이트 심사, 내고, oligomeric 프라이머 쌍을 법인 또는 잘린 PCR 제품 중 바람직하지 않은 재조합 이벤트에서 지연 색상 개발은 달리 결함이 시퀀싱 결과가 발생할 수 있습니다. 우리는 정기적으로 복제된 삽입을 증폭하기 위해 T7 및 SP6 primers를 사용, 약 150 BP의 추가 벡터 시퀀스에서이 접근법 결과입니다. T7의 프라이머는 이후 단계에서 시퀀싱 반응에 사용됩니다. <ol><li> 96 - 웰 플레이트에서 식민지 PCR 반응을 설정합니다. 한 반응을 사용할 경우 : 3 μl 2.5 밀리미터 MgCl 2 2.5 μl DNA 형성 촉매 10X 버퍼 1.5 μl 10 밀리미터 dNTP 2 μl 2.5 MM T7의 프라이머 2 μl 2.5 MM SP6 프라이머 1 μl Fermentas DNA 형성 촉매의 중합 효소 H 2 O 25 μl까지 기입 </li><li> / 잘 마스터 믹스로 각 잘 96 - 웰 플레이트의 25 μl를 분배. </li><li> PCR 반응에 피펫 팁 및 물놀이가있는 접시에서 긍정 (흰색) 클론을 선택하십시오. </li><li> fol를 사용하여 증폭lowing 조건 : 95 1주기를 4 분 ° C 94 10 사이클의 30 ° C, 56 30의 72에 ° C ~ 30 ° C의 94 30 사이클의 30 ° C, 48 30의 72에 ° C ~ 30 ° C의 72 1 사이클 5 분 ° C </li><li> 아가로 오스 겔에 식민지 PCR의 5 μl를로드하고 바로 삽입 크기를 포함하는 반응을 결정합니다. </li><li> 원하는 amplicons를 포함하는 콜로니 PCRs는 상용 키트 (Machery Nagel Nucleofast)을 사용하여 청소합니다. </li></ol> 6.4 빅 - 다이 터미네이터 반응과 시퀀싱 <ol><li> 빅 - 염료 반응을 마스터 믹스를 준비합니다. 한 반응을 사용할 경우 : 1 μl H 2 O 0.5 μl 빅 염색 시약 1.5 μl 장면 버퍼 </li><li> 각 잘 청소 식민지 PCR 제품의 2 μl를 추가하고 다음 매개 변수가있는 thermocycler 대한 반응을 실행하려면 μl / 잘 96 - 웰 플레이트의 각도에 3 분배 : 96 10의 35주기 ° C, 5의 50 60 ° C와 4 분 ° C </li><li> 빅 염색 반응은 상용 키트 (Millipore 몽타쥬 96 청소 키트를 배열)을 사용하여 청소 및 모세관 시퀀서 (예 : ABI 3100 DNA)에 처리됩니다. </li><li> 시퀀스는 Biq 분석기 (사용 분석하고 <a href="http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/" target="_blank">http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/</a> ) 또는 온라인 도구 BISMA ( <a href="http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/" target="_blank">http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/를</a> ) 조사의 DNA 영역 (그림 4)의 methylation 패턴을 도출합니다. </li></ol> 7. 대표 결과 Avp 표현과 methylation 상태에서 ELS의 영향에 대한 통찰력을 얻으려면 C57BL/6N 마우스는 위에서 설명한 작업 흐름에 따라 처리되었다. 간단히, C57BL/6N 마우스의 그룹들이었다제어 그룹이 그대로 남아있는 동안 ELS에 ubjected. 단일 펀치에서 PVN과 supraoptic 핵 (아들은) 천공되었으며 DNA와 RNA를 동시에 격리되었다. RNA는 역방향 베꼈는데되었고 Avp의 성적 수준은 qPCR 분석 및 Hprt 및 Gapdh의 가사 유전자의 표현에 대한 표준에 의해 측정되었다. DNA는 Avp 향상제 (그림 4A)과 PCR 제품에 특정 primers로 증폭, bisulfite 처리했습니다 복제 및 순서가되었다. 각 마우스 / PCR에서 최소한 20 재조합 클론은 PCR amplicon (그림 4B)에 포함된 CpGs위한 methylation 주파수를 결정하기 위해 분석되었다. 컨트롤과 비교했을 때, ELS는 epigenetic 일찍 생활 경험을 통해 이러한 규제 지역의 마킹 제안 Avp 향상제의 CpG10, CpG12, CpG13 및 Cpg14 (P &lt;0.05, N = 6-8 동물)에 상당한 hypomethylation을 유도. 의 PVN, methylation과는 달리Avp 향상제는 epigenetic 마킹 (그림 4c)의 아들이 보여주는 조직 특이성에 영향을받지 ELS했습니다. CpG10 및 Avp 유전자 발현 제어 동물에서 DNA의 methylation 상태 분석 (N = 6) AVP의 유전자 발현 (그림 4D)의 미세 조정에 DNA methylation의 역할을 가리키는 부정적인 상관 관계를 입증. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig1.jpg" /> 그림 1. Micropunches는 제어 및 조기 생활 스트레스 생쥐의 두뇌를 해부에서 얻은됩니다. bisulfite 치료 유전자가 증폭되고 정화 제품은 화이트 / 블루 선택에 의한 재조합 클론의 적합한 벡터 있도록 신분으로 복제하는 동안 DNA와 RNA 분리에 따라 유전자 발현이 qRT-PCR에 의해 결정됩니다. 올바른 삽입 크기에 의해 확인됩니다이전 모세관 시퀀서에 큰 염색 반응 및 가공을 수행에 식민지 PCR. Methylation 패턴 적절한 소프트웨어 도구에 의해 시각입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig1large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig2.jpg" /> 그림 2. DNA / RNA 추출에서 bisulfite의 시퀀싱에 대한 타임 라인. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig3.jpg" /> 그림 3. DNA와 RNA의 동시 추출을위한 워크플로우. paraventricularis hypothalamic 핵, 뇌 영역을 표현하는 작은 Avp 유전자의 펀치는 주사기 (29G)를 통해 전달하여, 400 μl GTA 버퍼에 배치 중단될 때까지 vortexed하고 더 균질하고 있습니다. homogenate 그 다음 RNA와 DNA의 정화를 위해 나뉩니다. 분할 1:1 있거나 따라 다른 비율의 수특히 실험에 대한 질문. Homogenates은 몇 시간 이내에 처리하여야한다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3938/3938fig4.jpg" /> 그림 4 6. 주 된 제어 및 ELS 동물의 Avp의 현장에서 CPG methylation. () Avp과 옥시토신의 유전자 중심의 꼬리 투 - 꼬리 계획 및 intergenic 지역 (IGR)으로 구분합니다. Exons는 개방 (번호가) 상자가 표시됩니다. CPG 잔류물의 분포가 표시되고 크기와 CpG14에 CPG 10을 포함하는 각각의 PCR의 amplicon의 위치는 굵은 선으로 표시됩니다. (B) 제어 및 ELS 동물의 PVN의 Avp 향상제의 Methylation (n은 = 6-8). 제어 및 ELS 동물의 아들 (N = 8-10)의 Avp 향상제의 (C) Methylation. (D) Avp 유전자 발현은 서로 관련되었다CpG10에서 methylation과 (N = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3938/3938fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> .

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</ol>

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Epigenetic 프로그래밍은 점점 더 중요한 메커니즘 밑에있는 건강과 질병으로 인식된다. 여기 micropunches과 bisulfite의 시퀀싱을 통해 DNA의 methylation 프로파일을 얻을 수있는 후속 단계에서 DNA와 RNA의 동시 분리를위한 세련된 방법을 제시. 최적화된 작업 흐름은 환경 자극에 대한 응답으로 뇌의 epigenetic 프로그래밍의 편리한 분석을하실 수 있습니다. 또한, 이러한 방식은 모두가 같은 샘플에서 분석할 때 DNA의 methylation와 유전자 발현 사이의 기능적 관계의 조사를 용이하게합니다. 마지막으로, 실험에 필요한 동물의 숫자가 크게 줄어들 수 있습니다. 제시 워크플로우를 수행하는 동안 특정주의 사항과 지침을 따라야한다. methylation과 표현 패턴 세포와 조직을 특정 방식으로 다를 수 있기 때문에 특별한 복잡 성과 두뇌의 이질을 고려하고 그것은 최고입니다중요성이 그 micropunching는 표준화된 방식으로 수행됩니다. 지점에서 사례로서 Avp의 epigenetic 프로그래밍이 paravaventriuclar에서 감지되고 있지만 supraoptic 핵에 (그림 4B-D), 두 Avp은 시상 하부 4 영역을 표현. 이러한 측면에서, 동일한 조직 펀치의 DNA와 RNA의 여부는 RNA의 특정 조직이 특정 마커 유전자의 표현이 올바른 영역 천공 것을 증명하는 경우에 사용할 수있는 등 유리한 것입니다. micropunching는 세포 이질을 줄일 수 있지만, 그것은이 접근법은 단일 셀 유형이나 집단의 고립으로 이어질하지 않는 기억되어야한다. 추가 정화 단계는이 주제를 해결하기 위해 고려해야 할 수도 있습니다. 내용은 PCR 증폭 다음 bisulfite 처리를위한 최적 프라이머 설계를 시퀀싱 bisulfite은 필수적입니다. 길이 400 BP를 초과하는 PCR 제품은 B에 의해 DNA의 저하로 인해 문제가 될 수 있습니다isulfite 치료. 또한 단지 몇 그대로 템플릿 증폭 과정에 기여하는 경우 중첩된 PCR은 편향된 결과를 줄 수 있다고 언급한다. 수정된 amplicon에 대한 구체적인 프라이머 쌍 설계되어야, 그들의 시퀀스는 methylation-바이어스 증폭을 방지하기 위하여 CPG dinucleotides 없어야합니다. 또한, primers는 수정되지 않은 또는 불완전하게 변환된 DNA의 증폭을 막기 위해 비 CPG cytosines를 포함해야합니다. 일부 템플릿의 증폭은 핫 시작 PCR을 실시하는 혜택을 누릴 수 있습니다. 귀중한 실험 표본의 변질을 방지하기 위해 같은 있도록 어떠한 경우에도, 프라이머 쌍 적합성은 파일럿 실험에서 확인해야합니다. 그것이 안정적으로 정확하게 allele 특정 방식으로 8 단일 CPG 잔류물의 methylation를 감지할 수로 Bisulfite의 시퀀싱는 사이트 관련 methylation 분석을위한 표준 방법을 나타냅니다. PCR 제품의 직접 시퀀싱은 혼합 methylation O 통보를하지 않습니다FA CPG 잔여물 걱정이 사이트에서 methylation의 부량을 예방할 수 electropherogram에서 C / T 더블 피크로 나타납니다. 이러한 이유로 중간 복제 단계가 실시되고 여러 클론은 methylation의 정도를 결정하기 위해 (~ 20-30) 순서가있다. Pyrosequencing은 DNA의 methylation을 정량하기위한 다른 방법을 나타냅니다. 또한 bisulfite 변환과 bisulfite PCR 대신 복제 및 amplicon이 CPG 잔여물의 methylation 상태가 쉽게 계량 할 수있는 C / T 단일 염기 다형성으로 읽어 직접 pyrosequencing 반응에 노출되는 시퀀스를 활용합니다. 두 가지 방법 methylation 9와 비슷한 수준을 감지하지만, 복제 단계를 생략할 수 있기 때문에 pyrosequencing 시간이 더 효율적입니다. 단, 템플릿에 따라서만 40-100 세포핵이 다른 시퀀싱 프라이머와 pyrosequencing 여러 라운드가 필요하므로 한 번에 순서가 수 있습니다. 이것은 THA에게 주어진 중요한 제한 사항입니다DNA의 t보다 높은 금액 (반응 당 약 1 μg)은 작은 뇌 조직 펀치에서 사용할 수있는 금액을 초과 예측하는 필요합니다. 따라서 pyrosequencing에 의한 여러 kilobases의 범위에서 지역의 초기 검사는 단일 클론 독서 같은 덜 적합한 나타납니다. 그럼에도 불구하고, 관심 pyrosequencing의 작은 영역의 신분에 따라 고려되어야한다. 이하, 위에서 설명한 프로토콜은 epigenetic 변화를위한 두뇌 micropunches의 신속하고 비용 효과 분석을위한 정확하고 효율적이고 능률적인 접근 방식을 제공합니다. 여러 개의 표본은 하나의 실행 작업을 중간 크기의 실험에서 샘플을 실행할 때 방법은 적합 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> DNeasy 혈액 및 조직 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 69,506 </td></tr><tr><td> Nucleospin RNA II </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740955.50 </td></tr><tr><td> Bisulfite 키트 Epitect </td><td> Qiagen </td><td> 59,104 </td></tr><tr><td> Nucleospin 추출 </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 740609.50 </td></tr><tr><td> pGEM-T 벡터 복제 키트 </td><td> Promega </td><td> A3600 </td></tr><tr><td> Nucleofast 96 </td><td> Macherey-Nagel </td><td> 743100.50 </td></tr><tr><td> 몽타쥬 96 장면 청소 </td><td> Millipore </td><td> LSK09624 </td></tr><tr><td> Hotstar DNA 형성 촉매의 중합 효소 </td><td> Qiagen </td><td> 203,203 </td></tr><tr><td> DNA 형성 촉매의 중합 효소 </td><td> Fermentas </td><td> EP0401 </td></tr></tbody></table>

뇌의 작은, 해부학적인 몸의 구조 정의 분야의 dna methylation과 유전자 발현의 최적화 분석

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

다이어트에 노출, 생명 1,2의 민감한 창문 동안 마약과 초기 삶의 역경은 생리학과 행동 phenotypes의 표시에 기여하는 유전자 발현의 지속적인 변화를 가져올 수 있습니다. 이러한 환경 프로그램은 신진 대사, 심장 혈관과 정신 질환에 3,4로 느끼기 쉬운 성질을 높일 가능성이 높습니다. DNA의 methylation과 히스톤 수정은 유전자 - 환경 대화의 중재로 핵심 프로세스를 고려, 환경 프로그래밍 할 5 밑받침하는 것도 표시됩니다. 포유 동물에서 DNA의 methylation은 일반적으로 CPG dinucleotides의 컨텍스트 내에서 사이 토신의 5 - 위치에 메틸 그룹의 공유 결합 이외로 구성되어 있습니다. CPG methylation은 세포의 이질은 높은 조직 수량이 한정되어 두뇌의 이산, 작은 지역을 공부하기 위해 도전하고 고도로 조직과 세포에 특정한 방식으로 발생합니다. 또한, Because 유전자 발현과 methylation이 밀접하게 이벤트를 연결되었으며, 증가 가치는 동일한 표본에서 두 매개 변수를 비교하여 얻은 수 있습니다. 여기에서 뇌의 epigenetic 프로그래밍의 조사를 위해 단계별로 프로토콜 (그림 1) 설명의 목적을위한 초기 삶의 역경 &#39;모성 분리&#39;패러다임을 사용하여 제공됩니다. 프로토콜 따라서 동일한 샘플의 DNA의 methylation 및 유전자 발현 분석을 허용, DNA와 RNA를 동시에 격리 수있는 differentially 중년 마우스 두뇌에서 micropunches의 준비에 대해 설명합니다.

초기 생활 스트레스시의 DNA methylation 및 유전자 발현 변화를 공부하는 능률적인 작업 흐름이 나타납니다. 갓 태어난 생쥐와 이산 뇌 조직의 고립 모성 분리 월부터, 우리는 동시에 후속 bisulfite의 시퀀싱 및 RT-PCR 분석을위한 두뇌 조직 펀치에서 DNA와 RNA를 분리하기위한 프로토콜을 나타냅니다.

뇌의 작은, 해부학적인 몸의 구조 정의 분야의 DNA Methylation과 유전자 발현의 최적화 분석

생애 초기 민감기 1,2 동안의 식단, 약물 및 초기 생애 역경에 대한 노출은 유전자 발현의 지속적인 변화를 유도하여 ...에 기여할 수 있습니다.

본 실험 절차의 전반적인 목적은 초기 생애 스트레스에 따른 DNA 메틸화 및 유전자 발현 변화를 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 갓 태어난 생쥐 새끼를 모성 분리시켜 초기 생애 스트레스를 유도하며, 두 번째 단계로 관심 뇌 영역인 PVN을 in loco 미세 절제술로 적출한 뒤, 단일 조직 펀치로부터 DNA와 RNA를 동시에 분리합니다.다음으로, 얻어진 DNA를 아황산염으로 처리하고, 관심 영역을 바이설파이트 PCR로 증폭합니다. 그 후 이를 벡터에 결합시켜 박테리아에 형질전환합니다. 형질전환의 성공 여부는 마커 발현과 PCR 단편 크기를 통해 확인합니다.마지막으로, 메틸화 상태를 평가하기 위해 비설파이트 시퀀싱(bisulfide sequencing)을 사용합니다. 이 워크플로우의 주요 장점은 환경적 자극에 대응하는 후성유전학적 프로그래밍을 편리하게 분석할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 초기 생애 역경에 의한 후성유전학적 프로그래밍에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.이 방법은 다른 시스템에도 적용 가능합니다. 메틸화와 유전자 발현을 조직 특이성이 매우 높은 환경에서 분석해야 하거나 조직 확보가 제한적인 경우에 유용합니다. 초기 생애 스트레스를 유도하기 위해, 시기 조절 임신을 한 C 57 black six N 모체로부터 태어난 새끼 쥐를 대상으로 모성 분리 실험을 수행하여 모성 분리 효과를 유도합니다.생후 1일부터 10일까지 매일 3시간 동안 각 리터를 가열된 깨끗한 케이지로 옮깁니다. 스트레스를 주지 않은 대조군 새끼들은 그대로 둡니다. 3시간의 분리 외에, 모든 리터는 생후 21일째 이유 시까지 어미와 함께 둡니다. 그 후 새끼들은 성별을 맞춘 그룹으로 나누어, 표준 사육 조건 하에 케이지당 3~5마리의 마우스로 수용합니다. 뇌 조직 수집을 시작하기 위해 마우스의 뇌를 두개골에서 제거하고 즉시 isop 드라이아이스로 급속 냉각하여 -80°C에서 보관합니다.조직 펀치를 수집할 준비가 되면, -80°C 냉동고에서 뇌를 꺼내 드라이아이스 위에 올립니다. 먼저 뇌를 앞쪽(rostral)에서 뒤쪽(caudal) 방향으로 10 µm 두께의 관상면(coronal) 섹션으로 동결 절편합니다. 절편을 super frost 유리 슬라이드에 마운트하고 크레실 바이올렛(cresyl violet) 염색을 위해 건조시킵니다.추가 분석(예: in situ hybridization)을 위해 추가 슬라이드를 제작하여 -20°C에 보관할 수 있습니다. 펀칭을 준비할 때, 관심 있는 뇌 구조를 식별하기 위해 슬라이드를 크레실 바이올렛(cresyl violet)으로 염색합니다. 그런 다음 펀칭 니들을 사용하여 in loco microdissection 방식으로 관심 영역에서 0.8 mm 크기의 펀치를 채취합니다.펀치는 -80°C에서 보관해야 합니다. 유전자 발현과 메틸화는 조직 특이성이 매우 높으므로, 마이크로 펀칭을 표준화된 방식으로 수행하는 것이 매우 중요합니다. 피펫을 사용하여 400 µL의 qadium thiocyanate 버퍼 내에서 펀치를 균질화한 후, 실온에서 볼텍싱하십시오.다음으로, 생성된 용해물을 29게이지 주사기로 통과시킵니다. 펀치 흔적이 더 이상 보이지 않을 때까지 여러 번 반복합니다. 용해물을 동일한 양으로 나눕니다.하나는 RNA 처리용으로 가장 먼저 수행해야 하며, 다른 하나는 DNA 처리용으로 RNA 처리가 완료될 때까지 상온에서 보관할 수 있습니다. RNA 정제를 위해 1/10 부피의 sodium acetate, 1 부피의 aqua phenol, 그리고 1/2 부피의 24:1 chloroform to isoamyl alcohol을 첨가합니다. 각 성분을 추가할 때마다 혼합물을 격렬하게 vortex 하고, 최종 혼합물을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 그 후 혼합물을 원심 분리합니다.수층을 수집하고 이와 동일한 부피의 70% ethanol을 첨가합니다. RNA 스핀 컬럼 키트를 사용하여 컬럼 상에서 DNA 소화를 수행하고 세척한 후, 25 µL의 물로 RNA를 용출합니다.이제 RNase 소화를 포함하도록 수정된 키트 프로토콜을 사용하여 DNA를 정제하되, 사용 전 용출 버퍼와 용출 컬럼을 70 °C로 가온하십시오. 컬럼의 경우 70 °C에서 10분간 가온하는 것으로 충분합니다. 마지막으로, 분광광도계를 사용하여 DNA 및 RNA 농도를 측정하십시오.전형적인 PVN 펀치는 약 600 ng의 DNA와 약 400 ng의 RNA를 생성하며, 이 중 약 100 ng의 RNA는 아황산염 처리 전 정량적 PCR을 이용한 유전자 발현 분석을 위해 따로 보관합니다. 분리된 DNA 200 ng을 시판 키트로 처리하여 메틸화된 영역의 DNA를 증폭합니다. 비설파이트(bisulfite) 전환 DNA 전용으로 설계된 프라이머를 주문하십시오. 비설파이트 PCR에서 최적의 프라이머 설계는 필수적인데, 이는 PCR 증폭 산물의 품질과 특이성이 후속 단계의 성공 여부를 결정하기 때문입니다.프라이머가 도착하면, 예비 실험을 통해 최적의 어닐링 온도를 결정하십시오. 각 25 µL PCR 혼합물에 대해 bisulfite 처리된 DNA 2 µL를 템플릿으로 사용하십시오.95°C에서 6분간 변성시키는 것으로 시작하여, 45~50회의 증폭 사이클을 거친 후, 마지막으로 72°C에서 5분간 신장시켜 혼합물을 증폭합니다. PCR 산물 7µL를 아가로스 겔 전기영동으로 분석하여 증폭 산물의 크기를 확인합니다. 남은 PCR 산물은 시판되는 PCR 정제 키트를 사용하여 이후의 라이게이션을 위해 정제합니다.원치 않는 PCR 산물이 생성된 경우, 젤 정제를 통해 본 프로토콜에 필요한 목적 산물을 분리하십시오. 상용 클로닝 키트를 사용합니다. 클로닝 효율은 삽입물의 특성에 따라 크게 달라집니다.따라서 재조합 클론의 수가 반복적으로 적게 얻어지는 경우, 다른 클로닝 벡터를 사용해 보십시오. 벡터 1 µL와 정제된 PCR 산물 3 µL를 사용하여 10 µL ligation 반응을 설정합니다. 파이펫팅으로 반응물을 혼합하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날 사용하십시오.전형적인 에탄올 침전법으로 라이게이션 반응물을 정제하고, 생성물을 박테리아에 형질전환합니다. 펄스 전달 직후에 미리 데워둔 SOB 배지 1 mL를 직접 첨가하고, 형질전환된 박테리아를 반응 튜브로 옮깁니다. 37 °C에서 1시간 동안 박테리아를 회복시킨 후, 각 현탁액 100 µL를 IPTG가 코팅된 LB ampicillin 플레이트에 도말합니다.콜로니를 분리할 수 있을 때까지 플레이트를 하룻밤 동안 배양합니다. 96웰 플레이트에 각 반응당 2.5 millimolar magnesium chloride 3 µL를 사용하여 25 µL 용량의 콜로니 PCR 반응을 설정합니다. 파이펫 팁으로 양성 흰색 클론을 선택하여 PCR 믹스에 가볍게 찍어 옮깁니다.4분간의 용해 사이클로 PCR을 시작합니다. 이어서 결합 온도를 56 °C로 설정하여 10회의 증폭 사이클을 수행합니다. 각 사이클의 단계별 시간은 30초입니다.그 다음 어닐링 온도를 48 °C로 낮추어 30회의 증폭 사이클을 추가로 진행합니다. 5분간의 신장 사이클로 마무리합니다. 이제 각 생성물 5 µL를 아가로스 겔에 로딩하여 적절한 크기의 삽입단이 포함된 반응물을 확인합니다.시판되는 키트를 사용하여 관심 있는 PCR 산물을 정제하여 BigDye terminator cycling sequencing 방식으로 시퀀싱할 수 있도록 합니다. 96웰 플레이트의 각 웰에 3 µL의 BigDye 반응 마스터 믹스를 넣고, 이어서 정제된 colony PCR 산물 2 µL를 넣습니다. 서멀 사이클러에서 96 °C에서 1분간 반응시킨 후, 96 °C에서 10초, 50 °C에서 5초, 60 °C에서 4분 동안 35회 반복합니다.bisulfite 반응이 완료되면, bisulfite 정제 플레이트를 사용하여 반응물을 정제합니다. 서열을 얻은 후, 온라인 bisulfite 분석기 또는 B-I-S-M-A 툴을 사용하여 분석함으로써 조사 대상 DNA 영역의 메틸화 패턴을 도출하고, 초기 생애 스트레스(ELS)가 avp 발현 및 메틸화 상태에 미치는 영향에 대한 통찰을 얻습니다. C57BL/6 마우스를 기술된 프로토콜에 따라 처리하였으며, DNA 분리를 위해 뇌실주위핵과 시각상핵을 펀칭하였습니다. DNA는 bisulfite 처리 후 avp 인핸서 특이적 프라이머로 증폭하였으며, PCR 생성물을 클로닝하여 각 마우스당 최소 20개의 재조합 클론을 시퀀싱하였습니다.PCR 분석을 통해 P-V-N-E-L-S 조직 내 PCR 증폭 산물에 포함된 CpG의 메틸화 빈도를 측정하였습니다. 그 결과, A VP 인핸서의 네 곳에서 유의미한 저메틸화가 유도되었으며, 이는 초기 생애 경험을 통해 이 조절 영역에 후성유전학적 표식이 형성되었음을 시사합니다. PVN과 대조적으로, SON에서는 A VP 인핸서의 메틸화가 ELS의 영향을 받지 않았으며, 이는 후성유전학적 효과의 조직 특이성을 보여줍니다. 대조군 동물에서 CpG 10의 DNA 메틸화 상태는 A VP 유전자 발현과 음의 상관관계를 보였으며, 이는 DNA 메틸화가 A VP 유전자 발현의 미세 조정에 역할을 한다는 점을 나타냅니다. 이 절차 이후, 분석된 조직의 유전자 발현 변화와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 분리된 RNA를 대상으로 UPCR과 같은 다른 방법들을 용이하게 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 환경적 자극이나 경험 의존적 자극에 반응하여 나타나는 DNA 메틸화 변화를 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

최근까지, 인간의 두뇌에 대한 표현 연구 RNA 또는 단백질의 양을 정함으로 제한했다. 이 문서에 설명되어있는 염색질 immunoprecipitation 기술과 함께, 그것은 사후 두뇌에서 유전자 발현의 히스톤 methylation 및 기타 epigenetic 규제를지도로 가능합니다.

인간 두뇌 조직에 대한 염색질 어세이

이 원고는 행동 패러다임에 따라 설치류의 특정 뇌핵에서 유도된 전사 프로그램의 분석을 위해 포괄적인 프로파일링을 적용하는 프로토콜을 설명합니다. 본 명세서에서, 이 접근법은 미세유체 qPCR 어레이를 활용하여 급성 코카인 노출 후 마우스의 측좌핵(NAc)에서 유도된 유전자를 프로파일링하는 맥락에서 설명됩니다.

행동 경험에 따라 뇌 샘플에서 전사 역학의 종합 분석

DNA 메틸화는 다양한 자극에 대한 반응으로 유전자 발현의 역동적인 변화를 허용할 뿐만 아니라 안정적인 수준의 유전자 발현을 유지할 수 있습니다. DNA 메틸화의 유전자 특이적 변화와 이러한 변화가 유전자 발현에 미치는 영향을 연구할 수 있는 기술에 대해 자세히 설명합니다.

유전자 특이 발현과 DNA 메틸화 변화와 성상 세포의 전사 활동의 상관 관계<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

BSAS(Bisulfite amplicon sequencing)Bisulfite 앰플리콘 염기서열분석(BSAS)은 관심 대상 게놈 영역에서 시토신 메틸화를 정량화하는 방법입니다. 이 방법은 차세대 염기서열분석 전에 표적 영역의 PCR 증폭과 쌍을 이루는 중아황산염 변환을 사용하여 염기 특이적 수준에서 DNA 메틸화의 절대 정량을 생성합니다.

DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

이 연구는 만성 림프 구성 백혈병 (CLL) 환자에서 차별적으로 메틸화 된 CpG가 풍부한 부위를 확인하기 위해 최적화 된 메틸 -CpG 결합 도메인 (MBD) 시퀀싱 프로토콜과 계산 파이프 라인을 설명합니다.

만성 림프 성 백혈병 환자에서 Methyl-CpG- 결합 도메인 포착 기반 방법을 이용한 포괄적 인 DNA 메틸화 분석

5-methylcytosine (oxi mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC)의 산화 형태를 새로 발견 하 고 5-carboxylcytosine (5caC) 독특한 기능 역할을 가진 고유한 DNA 수정 나타낼 수 있습니다. 여기 oxi mCs의 공간 배급, 신호 강도 프로 파일링 및 colocalization의 시각화를 위한 반 정량 워크플로 설명 되어 있습니다.

DNA 수정에 대 한 Immunostaining: 공초점 이미지의 계산 분석

본명, 위장관암에서 DNA 메틸화의 게놈 전체 분석을 위한 절차를 기술하고 있다. 절차는 유전자의 메틸화 패턴과 위장암에 있는 발암발생에 기여하는 요인 사이 관계를 조사하는 연구 결과에 관련성입니다.

위장암에서 DNA 메틸화의 게놈 전체 분석

우리는 마우스 뇌 제거 및 신선한 뇌 조직에서 분리 된 영역의 해부를위한 실습, 단계별, 신속한 프로토콜을 제시합니다. 분자 분석을위한 뇌 영역을 얻는 것은 많은 신경 과학 실험실에서 일상화되었습니다. 이러한 뇌 영역은 시스템 레벨 분석을 위한 고품질 전사체 데이터를 얻기 위해 즉시 동결된다.

마우스 뇌를 기능적으로나 해부학적으로 다른 영역으로 미세 해부

본 연구는 마이크로어레이 기술로 얻은 DNA 메틸화 데이터를 관리하기 위한 워크플로우를 기술한다. 이 프로토콜은 샘플 준비에서 데이터 분석에 이르는 단계를 보여 줍니다. 모든 절차가 자세히 설명되어 있으며 비디오에서는 중요한 단계를 보여줍니다.

DNA 메틸화의 생물 정보학 분석에 대한 샘플 준비 : 비만 및 관련 특성 연구를위한 협회 전략

본 연구는 조직 절편의 직접 공간 바코딩과 단일 세포 다중옴 분석을 결합한 공간적 Trekker–CUT&amp;Tag 멀티옴 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 유전자 발현과 히스톤 H3K27ac 변형의 공간적으로 분리된 단일 세포 프로파일링을 동시에 가능하게 하여, 조직 미세해부학 맥락에서 유전자 조절에 대한 기전적 통찰을 제공합니다.

냉동 조직 절편에서 전사체 및 후생유전체 표적의 공간적으로 분리된 단일 세포 통합 다중체체 프로파일링

학습하세요 생쥐 모델에서 모성 분리를 통한 초기 생활 스트레스가 뇌 조직의 DNA 메틸화와 유전자 발현에 미치는 영향을 분석하는 방법을. 이 프로토콜은 신경과학 및 후성유전학 연구에 활용됩니다.

뇌의 작은, 해부학적인 몸의 구조 정의 분야의 DNA Methylation과 유전자 발현의 최적화 분석

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