뇌의 작은, 해부학적인 몸의 구조 정의 분야의 DNA Methylation과 유전자 발현의 최적화 분석

이 절차의 전반적인 목표는 DNA를 연구하는 것입니다. 메틸화와 유전자 발현은 생애 초기의 스트레스에 따라 변화합니다. 이것은 먼저 갓 태어난 새끼 쥐에게 모계 분리를 가하여 두 번째 단계 뇌 관심 영역인 초기 생활 스트레스를 유도함으로써 수행되며, PVN은 로코 마이크로 해부에 의해 얻어지고 DNA와 RNA는 단일 조직 펀치에서 동시에 분리됩니다.

다음으로, 얻어진 DNA는 아황산염 처리에 의해 처리되고, 관심 영역은 바이 아황산염 PCR에 의해 증폭됩니다. 그런 다음 벡터로 접합되어 박테리아로 변형됩니다. 성공적인 형질전환은 marker 발현과 PCR 단편 크기로 식별됩니다.

마지막으로, 이중 황화물 염기서열분석은 메틸화 상태를 평가하는 데 사용됩니다. 이 워크플로우의 주요 장점은 환경 자극에 대한 반응으로 후성유전학적 프로그래밍을 편리하게 분석할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 초기 삶의 역경에 의한 후성유전학적 프로그래밍에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 메틸화 및 유전자 발현이 고도로 조직 특이적인 환경에서 분석되는 모든 곳과 조직 가용성이 제한된 모든 곳에서 초기 생활 스트레스를 유발합니다. 모성 분리는 모성 분리에 영향을 미치기 위해 시간이 지정된 임신 C 57 black six N dams의 새끼에서 수행됩니다.

각 새끼를 출생 후 1일부터 10일까지 매일 3시간 동안 가열된 깨끗한 케이지로 옮기고 스트레스를 받지 않은 대조군 새끼를 방해받지 않도록 합니다. 3시간의 간격을 제외하고, 모든 새끼는 출생 후 21일째에 젖을 뗄 때까지 어미와 함께 남겨집니다. 그런 다음 새끼는 뇌 조직 수집을 시작하기 위해 표준 사육 조건에서 케이지 당 3-5 마리의 쥐를 성별로 일치하는 그룹에 수용하고 쥐의 뇌를 두개골에서 제거하고 즉시 isop 드라이 아이스에서 냉동하여 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

조직 펀치를 채취할 준비가 되면 영하 80도의 냉동고에서 뇌를 꺼내 드라이아이스에 넣습니다. 뇌를 상부에서 코들까지 10미크론의 관상 절편으로 냉동 절제하는 것으로 시작합니다. 슈퍼 프로스트 유리 슬라이드에 섹션을 장착하고 크레스트 바이올렛 염색을 위해 건조시킵니다.

추가 슬라이드를 가져와 영하 20도에서 저장하여 현장 2 하이브리드화와 같은 추가 분석을 할 수 있습니다. 펀치를 날릴 준비가 되면 슬라이드를 크레탈 바이올렛으로 염색하여 관심 있는 뇌 구조를 식별합니다. 그런 다음 펀칭 바늘을 사용하여 로코 미세 해부를 사용하여 관심 영역을 0.8mm 펀치합니다.

펀치는 섭씨 영하 80도에서 보관해야 합니다. 마이크로 펀칭은 유전자 발현과 메틸화가 조직 특이성이 높기 때문에 표준화된 방식으로 수행되는 것이 매우 중요합니다. 400마이크로리터의 카듐 티오시아네이트 완충액에 있는 펀치를 피펫을 사용하여 균질화한 다음 실온에서 와동

다음으로, 생성된 용해물을 29 게이지 주사기에 통과시킵니다. 여러 번 펀치가 더 이상 보이지 않아야 합니다. 용해물을 동일한 부분으로 나눕니다.

하나는 RNA를 처리하는 것인데, 이는 먼저 수행되어야 하고 다른 하나는 DNA를 처리하는 것으로, RNA가 아세트산나트륨 10분의 1, 아쿠아 페놀 1부피, 24 대 1 클로로포름의 절반 부피에서 이소아밀 AML 와류로 처리될 때까지 실온에서 보관할 수 있습니다. 각 첨가 후 혼합물을 격렬하게 배양하고 최종 혼합물을 얼음에서 10 분 동안 배양합니다. 그런 다음 혼합물을 원심 분리하십시오.

수성상을 수집하고 동일한 부피의 70% 에탄올을 첨가합니다. RNA 스핀 컬럼 키트 사용. on column DNA의 분해를 수행하고 25마이크로리터의 물로 RNA를 세척 용리합니다.

이제 RN a의 분해액을 첨가하도록 수정된 키트 프로토콜을 사용하여 DNA를 정제하고, 사용하기 전에 엘루시안 완충액과 엘루시안 컬럼을 섭씨 70도로 예열합니다. 컬럼은 섭씨 70도에서 10분이면 충분합니다. 마지막으로 분광 광도계를 사용하여 DNA 및 RNA 농도를 측정합니다.

일반적인 PVN 펀치는 약 600 나노그램의 DNA와 약 400 나노그램의 RA를 산출하며, 아황산염에 의한 증폭 전에 정량적 PCR에 의한 유전자 발현 분석을 위해 약 100 나노그램의 RNA를 생성합니다. 메틸화된 영역에서 DNA를 증폭하기 위해 시판되는 키트로 분리된 DNA 200나노그램을 처리합니다. bi-sulfite converted DNA를 위해 특별히 설계된 프라이머 주문PCR 앰플리콘의 품질과 특이성이 다음 단계의 성공 여부를 결정하기 때문에 bi PCR에서 최적의 프라이머 설계가 필수적입니다.

프라이머가 도착하면 파일럿 실험을 통해 최적의 무릎 온도를 결정합니다. 2마이크로리터의 비스 아황산염 처리된 DNA를 각 25마이크로리터에 대한 템플릿으로 사용합니다. PCR 혼합물.

섭씨 95도에서 6분 변성으로 시작하여 45-50회의 증폭 주기로 혼합물을 증폭한 후 섭씨 72도에서 최종 5분 연장을 수행합니다. 앰플리콘의 크기를 확인하기 위해 Agros gel 전기영동으로 7마이크로리터의 PCR 산물을 분석합니다. 시판되는 PCR cleanup kit를 사용하여 후속 ligation을 위해 나머지 PCR 산물을 정제합니다.

원치 않는 PCR 산물을 얻은 경우 겔 정제를 사용하여 이 프로토콜에 대한 관심 산물을 분리합니다. 상업용 클로닝 키트가 사용됩니다. 클로닝 효율성은 인서트에 따라 크게 달라집니다.

따라서 적은 수의 재조합 클론이 반복적으로 얻어지는 경우 다른 클로닝 벡터를 사용해 보십시오. 1마이크로리터의 벡터와 3마이크로리터의 클린업된 PCR 산물로 10마이크로리터 결찰 반응을 설정합니다. 피펫팅으로 반응을 혼합하고 다음날 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

고전적인 에탄올 침전에 의한 결찰 반응을 정리하고 제품으로 박테리아를 변형시킵니다. 펄스 전달 직후 1ml의 예열 SOB 배지를 추가하고 형질전환된 박테리아를 반응 튜브로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 박테리아를 회복한 후 IPTG로 코팅된 LB 암피실린 플레이트에 각 현탁액을 100마이크로리터씩 펴 바릅니다.

Xal은 군체를 선택할 수 있게 되면 하룻밤 동안 플레이트를 배양합니다. 각 반응에서 3마이크로리터의 2.5 밀리몰 염화마그네슘을 사용하여 96 웰 플레이트에서 25 마이크로리터 콜로니 PCR 반응을 설정합니다. 피펫 팁으로 positive white clone을 선택하고 간단한 dip으로 PCR mix로 옮깁니다.

4분 용융 주기로 PCR을 시작합니다. 이를 따라 섭씨 10도의 링 온도에서 56번의 증폭 주기를 수행합니다. 이러한 주기의 각 단계는 30초입니다.

그런 다음 30회 더 증폭 주기를 위해 ealing 온도를 섭씨 48도로 낮춥니다. 5분 연장 주기로 마무리합니다. 이제 각 제품의 5마이크로리터를 aros gel에 로드하고 올바른 크기의 인서트가 포함된 반응을 식별합니다.

시중에서 판매되는 키트를 사용하여 관심 있는 PCR 산물을 세척하여 대형 염료 터미네이터 사이클링 염기서열분석을 사용하여 염기서열분석을 수행할 수 있습니다. 96 웰 플레이트에서 3 마이크로 리터의 큰 DI 반응 마스터 믹스를 적재 한 웰과 2 마이크로 리터의 클린 업 콜로니 PCR 산물을 적재합니다. 96°C에서 1분으로 시작하여 96°C에서 10초, 50°C에서 5초, 60°C에서 4°C로 구성된 35주기로 구성된 35주기로 Thermocycler에서 반응을 실행합니다.

큰 다이 반응이 완료된 후 큰 다이 정제 플레이트를 사용하여 반응을 청소합니다. 염기서열을 얻은 후 온라인 대형 분석기 또는 B-I-S-M-A 도구를 사용하여 분석하여 조사된 DNA 영역의 메틸화 패턴을 도출하고 VP 발현 및 메틸화 상태에 대한 초기 생활 스트레스 또는 ELS의 영향에 대한 통찰력을 얻습니다. C 57 블랙 스틱 및 마우스를 기재된 프로토콜에 따라 처리하고, 뇌실주위핵 및 시신경상핵을 펀칭하여 DNA를 분리하고, R-N-A-D-N-A를 바이아황산염으로 처리하고, VP 인핸서에 특이적인 프라이머로 증폭하고, PCR 산물을 클로닝하고 각 마우스로부터 20개 이상의 재조합 클론을 염기서열분석하였다.

PCR을 분석하여 P-V-N-E-L-S의 조직에서 PCR 앰플리콘에 포함된 CPG의 메틸화 빈도를 측정하여 A VP 인핸서의 4개 위치에서 상당한 저메틸화를 유도하여 초기 생활 경험을 통해 이 조절 영역의 후성유전학적 표시를 제안했습니다. 대조군 동물에서 후성유전학적 효과의 조직 특이성을 보여주는 SON에서 A VP 인핸서의 PVN 메틸화가 ELS의 영향을 받지 않은 반면, CPG 10에서의 DNA 메틸화 상태는 VP 유전자 발현과 음의 상관관계를 보였으며, 이는 VP 유전자 발현의 미세 조정에서 DNA 메틸화의 역할을 나타냅니다. 이 절차에 따라 분석된 조직의 유전자 발현 변화와 같은 추가 질문에 답하기 위해 분리된 RNA에서 UPCR과 같은 다른 방법을 쉽게 수행할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 환경적 또는 경험된 의존성 자극에 대한 반응으로 DNA 메틸화 변화를 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.