뇌의 작은, 해부학적인 몸의 구조 정의 분야의 DNA Methylation과 유전자 발현의 최적화 분석

본 실험 절차의 전반적인 목적은 초기 생애 스트레스에 따른 DNA 메틸화 및 유전자 발현 변화를 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 갓 태어난 생쥐 새끼를 모성 분리시켜 초기 생애 스트레스를 유도하며, 두 번째 단계로 관심 뇌 영역인 PVN을 in loco 미세 절제술로 적출한 뒤, 단일 조직 펀치로부터 DNA와 RNA를 동시에 분리합니다.

다음으로, 얻어진 DNA를 아황산염으로 처리하고, 관심 영역을 바이설파이트 PCR로 증폭합니다. 그 후 이를 벡터에 결합시켜 박테리아에 형질전환합니다. 형질전환의 성공 여부는 마커 발현과 PCR 단편 크기를 통해 확인합니다.

마지막으로, 메틸화 상태를 평가하기 위해 비설파이트 시퀀싱(bisulfide sequencing)을 사용합니다. 이 워크플로우의 주요 장점은 환경적 자극에 대응하는 후성유전학적 프로그래밍을 편리하게 분석할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 초기 생애 역경에 의한 후성유전학적 프로그래밍에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

이 방법은 다른 시스템에도 적용 가능합니다. 메틸화와 유전자 발현을 조직 특이성이 매우 높은 환경에서 분석해야 하거나 조직 확보가 제한적인 경우에 유용합니다. 초기 생애 스트레스를 유도하기 위해, 시기 조절 임신을 한 C 57 black six N 모체로부터 태어난 새끼 쥐를 대상으로 모성 분리 실험을 수행하여 모성 분리 효과를 유도합니다.

생후 1일부터 10일까지 매일 3시간 동안 각 리터를 가열된 깨끗한 케이지로 옮깁니다. 스트레스를 주지 않은 대조군 새끼들은 그대로 둡니다. 3시간의 분리 외에, 모든 리터는 생후 21일째 이유 시까지 어미와 함께 둡니다. 그 후 새끼들은 성별을 맞춘 그룹으로 나누어, 표준 사육 조건 하에 케이지당 3~5마리의 마우스로 수용합니다. 뇌 조직 수집을 시작하기 위해 마우스의 뇌를 두개골에서 제거하고 즉시 isop 드라이아이스로 급속 냉각하여 -80°C에서 보관합니다.

조직 펀치를 수집할 준비가 되면, -80°C 냉동고에서 뇌를 꺼내 드라이아이스 위에 올립니다. 먼저 뇌를 앞쪽(rostral)에서 뒤쪽(caudal) 방향으로 10 µm 두께의 관상면(coronal) 섹션으로 동결 절편합니다. 절편을 super frost 유리 슬라이드에 마운트하고 크레실 바이올렛(cresyl violet) 염색을 위해 건조시킵니다.

추가 분석(예: in situ hybridization)을 위해 추가 슬라이드를 제작하여 -20°C에 보관할 수 있습니다. 펀칭을 준비할 때, 관심 있는 뇌 구조를 식별하기 위해 슬라이드를 크레실 바이올렛(cresyl violet)으로 염색합니다. 그런 다음 펀칭 니들을 사용하여 in loco microdissection 방식으로 관심 영역에서 0.8 mm 크기의 펀치를 채취합니다.

펀치는 -80°C에서 보관해야 합니다. 유전자 발현과 메틸화는 조직 특이성이 매우 높으므로, 마이크로 펀칭을 표준화된 방식으로 수행하는 것이 매우 중요합니다. 피펫을 사용하여 400 µL의 qadium thiocyanate 버퍼 내에서 펀치를 균질화한 후, 실온에서 볼텍싱하십시오.

다음으로, 생성된 용해물을 29게이지 주사기로 통과시킵니다. 펀치 흔적이 더 이상 보이지 않을 때까지 여러 번 반복합니다. 용해물을 동일한 양으로 나눕니다.

하나는 RNA 처리용으로 가장 먼저 수행해야 하며, 다른 하나는 DNA 처리용으로 RNA 처리가 완료될 때까지 상온에서 보관할 수 있습니다. RNA 정제를 위해 1/10 부피의 sodium acetate, 1 부피의 aqua phenol, 그리고 1/2 부피의 24:1 chloroform to isoamyl alcohol을 첨가합니다. 각 성분을 추가할 때마다 혼합물을 격렬하게 vortex 하고, 최종 혼합물을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 그 후 혼합물을 원심 분리합니다.

수층을 수집하고 이와 동일한 부피의 70% ethanol을 첨가합니다. RNA 스핀 컬럼 키트를 사용하여 컬럼 상에서 DNA 소화를 수행하고 세척한 후, 25 µL의 물로 RNA를 용출합니다.

이제 RNase 소화를 포함하도록 수정된 키트 프로토콜을 사용하여 DNA를 정제하되, 사용 전 용출 버퍼와 용출 컬럼을 70 °C로 가온하십시오. 컬럼의 경우 70 °C에서 10분간 가온하는 것으로 충분합니다. 마지막으로, 분광광도계를 사용하여 DNA 및 RNA 농도를 측정하십시오.

전형적인 PVN 펀치는 약 600 ng의 DNA와 약 400 ng의 RNA를 생성하며, 이 중 약 100 ng의 RNA는 아황산염 처리 전 정량적 PCR을 이용한 유전자 발현 분석을 위해 따로 보관합니다. 분리된 DNA 200 ng을 시판 키트로 처리하여 메틸화된 영역의 DNA를 증폭합니다. 비설파이트(bisulfite) 전환 DNA 전용으로 설계된 프라이머를 주문하십시오. 비설파이트 PCR에서 최적의 프라이머 설계는 필수적인데, 이는 PCR 증폭 산물의 품질과 특이성이 후속 단계의 성공 여부를 결정하기 때문입니다.

프라이머가 도착하면, 예비 실험을 통해 최적의 어닐링 온도를 결정하십시오. 각 25 µL PCR 혼합물에 대해 bisulfite 처리된 DNA 2 µL를 템플릿으로 사용하십시오.

95°C에서 6분간 변성시키는 것으로 시작하여, 45~50회의 증폭 사이클을 거친 후, 마지막으로 72°C에서 5분간 신장시켜 혼합물을 증폭합니다. PCR 산물 7µL를 아가로스 겔 전기영동으로 분석하여 증폭 산물의 크기를 확인합니다. 남은 PCR 산물은 시판되는 PCR 정제 키트를 사용하여 이후의 라이게이션을 위해 정제합니다.

원치 않는 PCR 산물이 생성된 경우, 젤 정제를 통해 본 프로토콜에 필요한 목적 산물을 분리하십시오. 상용 클로닝 키트를 사용합니다. 클로닝 효율은 삽입물의 특성에 따라 크게 달라집니다.

따라서 재조합 클론의 수가 반복적으로 적게 얻어지는 경우, 다른 클로닝 벡터를 사용해 보십시오. 벡터 1 µL와 정제된 PCR 산물 3 µL를 사용하여 10 µL ligation 반응을 설정합니다. 파이펫팅으로 반응물을 혼합하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날 사용하십시오.

전형적인 에탄올 침전법으로 라이게이션 반응물을 정제하고, 생성물을 박테리아에 형질전환합니다. 펄스 전달 직후에 미리 데워둔 SOB 배지 1 mL를 직접 첨가하고, 형질전환된 박테리아를 반응 튜브로 옮깁니다. 37 °C에서 1시간 동안 박테리아를 회복시킨 후, 각 현탁액 100 µL를 IPTG가 코팅된 LB ampicillin 플레이트에 도말합니다.

콜로니를 분리할 수 있을 때까지 플레이트를 하룻밤 동안 배양합니다. 96웰 플레이트에 각 반응당 2.5 millimolar magnesium chloride 3 µL를 사용하여 25 µL 용량의 콜로니 PCR 반응을 설정합니다. 파이펫 팁으로 양성 흰색 클론을 선택하여 PCR 믹스에 가볍게 찍어 옮깁니다.

4분간의 용해 사이클로 PCR을 시작합니다. 이어서 결합 온도를 56 °C로 설정하여 10회의 증폭 사이클을 수행합니다. 각 사이클의 단계별 시간은 30초입니다.

그 다음 어닐링 온도를 48 °C로 낮추어 30회의 증폭 사이클을 추가로 진행합니다. 5분간의 신장 사이클로 마무리합니다. 이제 각 생성물 5 µL를 아가로스 겔에 로딩하여 적절한 크기의 삽입단이 포함된 반응물을 확인합니다.

시판되는 키트를 사용하여 관심 있는 PCR 산물을 정제하여 BigDye terminator cycling sequencing 방식으로 시퀀싱할 수 있도록 합니다. 96웰 플레이트의 각 웰에 3 µL의 BigDye 반응 마스터 믹스를 넣고, 이어서 정제된 colony PCR 산물 2 µL를 넣습니다. 서멀 사이클러에서 96 °C에서 1분간 반응시킨 후, 96 °C에서 10초, 50 °C에서 5초, 60 °C에서 4분 동안 35회 반복합니다.

bisulfite 반응이 완료되면, bisulfite 정제 플레이트를 사용하여 반응물을 정제합니다. 서열을 얻은 후, 온라인 bisulfite 분석기 또는 B-I-S-M-A 툴을 사용하여 분석함으로써 조사 대상 DNA 영역의 메틸화 패턴을 도출하고, 초기 생애 스트레스(ELS)가 avp 발현 및 메틸화 상태에 미치는 영향에 대한 통찰을 얻습니다. C57BL/6 마우스를 기술된 프로토콜에 따라 처리하였으며, DNA 분리를 위해 뇌실주위핵과 시각상핵을 펀칭하였습니다. DNA는 bisulfite 처리 후 avp 인핸서 특이적 프라이머로 증폭하였으며, PCR 생성물을 클로닝하여 각 마우스당 최소 20개의 재조합 클론을 시퀀싱하였습니다.

PCR 분석을 통해 P-V-N-E-L-S 조직 내 PCR 증폭 산물에 포함된 CpG의 메틸화 빈도를 측정하였습니다. 그 결과, A VP 인핸서의 네 곳에서 유의미한 저메틸화가 유도되었으며, 이는 초기 생애 경험을 통해 이 조절 영역에 후성유전학적 표식이 형성되었음을 시사합니다. PVN과 대조적으로, SON에서는 A VP 인핸서의 메틸화가 ELS의 영향을 받지 않았으며, 이는 후성유전학적 효과의 조직 특이성을 보여줍니다. 대조군 동물에서 CpG 10의 DNA 메틸화 상태는 A VP 유전자 발현과 음의 상관관계를 보였으며, 이는 DNA 메틸화가 A VP 유전자 발현의 미세 조정에 역할을 한다는 점을 나타냅니다. 이 절차 이후, 분석된 조직의 유전자 발현 변화와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 분리된 RNA를 대상으로 UPCR과 같은 다른 방법들을 용이하게 수행할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후에는 환경적 자극이나 경험 의존적 자극에 반응하여 나타나는 DNA 메틸화 변화를 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.