구강 Biofilms의 종합, 생물 구조 및 Transcriptome 평가를위한 분석 도구 - 상자가 Mutans Streptococci의 중재

치아 표면에 형성된 생물막은 매우 복잡하고 구조화되어 있습니다. 세포 외 기질에 얽혀 있는 미생물 군집은 지속적인 환경 문제에 노출되어 있습니다. 여기서의 전반적인 목표는 새로운 형광 이미징 기술과 데이터 처리 및 분석을 위한 맞춤형 소프트웨어를 결합하여 구강 생물막의 복잡한 특성을 고려하여 구조 및 분자 연구를 용이하게 하도록 설계된 분석 도구 상자의 두 가지 특정 구성 요소를 보여주는 것입니다.

이는 먼저 EPS와 박테리아의 동시 시각화를 위한 새로운 컨포칼 이미징 접근법을 포함하여 생물막, 전사체 및 구조 분석을 위한 특정 분석을 선택하여 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 생물 검정에서 원시 데이터를 수집하는 것입니다. 세 번째 단계는 공동 국소화 분석을 위해 새로 개발된 duo stat를 포함한 특정 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터를 처리하는 것입니다.

마지막 단계는 마이크로어레이 데이터 마이닝 및 조직 소프트웨어 마이크로어레이, 데이터 시각화 도우미 또는 MDV의 사용을 포함하여 프로세스 데이터를 분석하는 것입니다. 궁극적으로, 구강 병원체가 복잡한 식단에 반응하여 전사체와 생물막의 구조를 어떻게 변화시키는지, 고유하게 통합된 분석 도구 상자를 사용하여 미생물 상호 작용을 숙주하여 보다 포괄적인 생물막 분석 및 데이터 해석을 제공하는 방법을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 제 이름은 미셸 쿠(Michelle Kuh)로, 로체스터 메디컬 센터(Rochester Medical Center)의 포랄(Foral) 생물학 센터 부교수입니다.

오늘은 생물막 분석을 위한 분석 도구 상자를 소개합니다. 이 도구 상자는 생물막 세포가 어떻게 구조화되고 세포 외 기질로 배열되는지, 전사체 수준에서 복잡한 환경 문제에 어떻게 반응하는지와 같은 생물막 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 제 이름은 진이고, 박사님, 박사님과 박사후연구원입니다.

오늘은 도구 상자의 이미징 부분을 시연해 보겠습니다. 안녕하세요, 저는 Aise Klein입니다. 저는 Dr.Ks 연구실의 연구 조교수입니다.

오늘은 마이크로레이 데이터 분석을 위한 MDV 소프트웨어에 대해 소개하겠습니다. 이 절차에서는 타액으로 코팅된 하이드록시 식욕 디스크(hydroxy appetite disc)가 생물막이 자라는 치아 표면 대리물로 사용됩니다. 먼저, 덱스트린 접합 LOR 6 47 염료에서 빛으로부터 플레이트를 보호하는 24 웰 플레이트의 각 웰에 S 돌연변이가 접종된 2.8 밀리리터의 배양 배지를 1 마이크로몰의 최종 농도로 추가하고 피펫을 위아래로 여러 번 수행하여 염료를 배양 배지에 혼합합니다.

다음으로, 멸균 겸자 딥을 사용하여 멸균 타액으로 코팅된 하이드록시아파타이트 디스크를 멸균 AB 완충액에서 두 번 세척하여 과도한 타액 또는 결합되지 않은 타액 성분을 제거합니다. 그런 다음 염료가 보충된 배양 배지에 디스크를 수직으로 놓고 각 디스크가 완전히 잠겼는지 확인합니다. 플레이트를 알루미늄 호일로 덮고 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 20시간 동안 배양하여 생물막이 형성되고 접합된 질감이 박테리아 세포에서 생성된 엑소 다당류에 통합되도록 합니다.

박테리아 세포를 먼저 라벨링하려면 웰당 2.8ml의 멸균 milli Q 물이 들어 있는 24웰 플레이트를 준비합니다. 각 웰에 1.5마이크로리터의 cyto nine dye를 1마이크로몰의 최종 농도로 추가하고 플레이트를 빛으로부터 보호합니다. 생물막이 형성되면 인큐베이터 딥에서 디스크가 들어 있는 플레이트를 제거합니다.

각 디스크를 0.89% 염화나트륨 용액으로 세척하십시오. 그런 다음 cyto nine dye가 들어있는 새 플레이트로 옮깁니다. 접시를 알루미늄 호일로 덮고 실온에서 30분 동안 배양합니다.

세포가 염색되면 이전과 같이 생물막과 염화나트륨을 세척합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 와이어의 생물막을 염화나트륨이 포함된 페트리 접시로 방출합니다. 페트리 접시를 알루미늄 호일로 감쌉니다.

생물막은 이제 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 컨포칼 현미경으로 시각화할 준비가 되었습니다. 무작위로 선택된 5-10개의 위치에서 각 생물막을 스캔하고 각 위치에서 Z 시리즈를 생성합니다. 3D 재구성을 허용하려면 컨포칼 이미지를 열고 미러 소프트웨어를 사용하여 처리합니다.

프로그램을 사용하여 생성된 컨포칼 이미지의 이 3차원 렌더링인 Amira는 시연된 절차를 사용하여 무관심 표면에 형성된 S 돌연변이 생물막을 보여줍니다. 박테리아 세포와 마이크로 콜로니는 녹색으로 볼 수 있으며 엑소 다당류를 포함하는 생물막 매트릭스에 내장되어 있습니다. 빨간색에서는 선택한 영역의 클로즈업 뷰를 생성할 수 있으며, 이는 마이크로 스케일에서 특정 박테리아 EPS 구조적 관계를 보여줍니다.

duos stat 프로그램을 사용하여 박테리아 및 엑소 다당류와 같은 별도의 생물막 구성 요소의 공동 국소화 양을 정량화합니다. 먼저, MATLAB 버전 5.1에서 새로 개발된 duo stat의 경로를 설정하고 두 생물막 구성요소의 Z 시리즈 이미지가 포함된 이미지 폴더를 엽니다. 다음으로, 상관 관계 및 분석할 두 개의 채널을 선택합니다.

두 이미지 스택은 모든 차원에서 픽셀 크기가 동일해야 하며 각 스택에서 동일한 수의 이미지를 가져야 합니다. 각 채널에 대한 임계값을 설정하고 소프트웨어 인터페이스의 지침에 따라 분석을 위해 데이터 처리 파일에 데이터를 입력합니다. 이 그림은 duo stack이 박테리아와 DBS 간의 공간적 관계를 정량적으로 해석하는 방법을 보여줍니다.

생물막 내에서 Duo 스택은 박테리아의 경우 녹색 선, EPS의 경우 빨간색 선에서 볼 수 있듯이 디스크 표면에서 유체 상태까지 박테리아와 DPS의 수직 분포를 계산합니다. 또한 생물막 두께에 걸쳐 박테리아와 DPS의 공동 국소화를 계산합니다. 노란색 선에서 볼 수 있듯이 데이터는 생물막 깊이에서 박테리아보다 EPS의 비율이 더 높다는 것을 보여주며, 대부분의 박테리아 세포는 특히 중간층과 위쪽에서 EPS와 관련이 있으며, 3D 렌더링을 통한 Duo stat는 생물막에서 박테리아와 DPS의 구조적 조직 및 상호 작용에 대한 이해를 향상시킵니다.

생물막에서 고품질 RNA를 얻기 위해 2007년에 발표된 Curian KU의 논문에 설명된 생물막 특정 프로토콜에 따라 RNA 추출을 수행하는 것이 좋습니다. 저널에서는 CD NA 마이크로어레이 준비 및 정량적 realtime PCR 분석에 분석 생화학 표준 프로토콜이 사용됩니다. 마이크로어레이 실험에 의해 생성된 대규모 데이터 세트의 분석을 용이하게 하기 위해 당사는 데이터 마이닝 및 조직 소프트웨어인 마이크로어레이 데이터 시각화 도구 또는 MDV를 설계했으며, 이는 www.oralgen.anl.gov 에서 온라인으로 사용할 수 있습니다.

MDV에 데이터를 제출하기 전에 클래스 비교를 위해 컷오프 P 값이 0.001인 온라인에서 사용할 수 있는 BRB 배열 도구 소프트웨어를 사용하여 무작위 분산 모델을 사용한 쌍 T-테스트와 같은 통계 분석을 수행합니다. 양고기에 대한 이 예시 분석에서는 3개의 뚜렷한 당 농도와 4개의 시점으로 성장한 생물막을 수행했습니다. 쌍을 이루는 비교를 수행하였다: 3개의 BRB 파일 조건, A 0.5% 자당 플러스 1% 전분 대 1% 자당 조건 B 0.5% 자당 플러스 1% 전분 대 0.5% 자당 및 조건 C 0.5% 자당 대 1% 자당.

이 패널은 BRB 어레이 도구를 사용하여 표준 클래스 비교를 통해 평가된 각 조건 및 시점에서 차등적으로 발현된 것으로 검출된 유전자의 수를 나타내며, 그 결과 BRB 원시 데이터라는 이름의 많은 유전자가 생성됩니다. MDV 데모를 위해 Excel을 사용하여 30시간 시점에 초점을 맞춥니다. BRB 원시 데이터를 MDV 탭 제한 텍스트 파일로 변환합니다.

유전자 궤적 탭 번호와 함께 오는 모든 문자(예: SMU dot 1432 C)를 제거해야 합니다.문자 C를 삭제하고 MDV를 엽니다. 파일 메뉴를 열고 주석 소스 선택을 선택합니다. 대화 상자가 나타나면 플랫 파일 옵션을 선택합니다.

찾아보기 버튼을 사용하여 유전자 온톨로지 번호, 경로 경로, 기능 분류 데이터 및 유전자 이름에 대한 주석이 포함된 파일을 선택합니다. 파일로 이동하여 MDV 형식으로 변환된 각 파일을 가져옵니다. 각 파일은 실험 조건을 나타냅니다.

벤 다이어그램 기능을 사용하여 각 실험 조건 A와 B에서 발현된 유전자를 이 예시 C.In 비교하여 비교합니다. 이 시연을 위해 우리는 자당과 전분을 조합하여 미치는 영향과 고유하게 관련된 차등적으로 발현된 유전자에 초점을 맞춥니다. 벤 다이어그램 기반 기능은 이러한 다양한 조건에서 발현되는 고유하고 공유된 유전자의 수를 시각화하는 데 사용되며 추가 분석을 위해 선택해야 할 유전자를 식별하는 데 도움이 됩니다.

여기서 우리는 조건 A 및/또는 B에서 고유한 차등적으로 발현된 유전자만 선택하지만, 여기에 표시된 것처럼 회색으로 표시된 것처럼 C에서 검출된 유전자는 선택하지 않습니다. MDV는 분석해야 할 총 유전자 수를 크게 줄였으며 동시에 실험 사례에서 관련 없는 유전자를 걸러냈습니다. 파일 메뉴에서 내보내기 옵션을 선택하여 데이터를 저장합니다.

탭으로 제한된 파일로, 데이터 출력을 구성하고 원하는 그래픽 디스플레이로 변환할 수 있는 Excel에서 파일을 열 수 있습니다. Excel의 데이터 구성을 통해 MDV 출력을 그래픽으로 표시할 수 있습니다. 이 그래프는 생물막 발달의 뚜렷한 단계에서 전분과 자당의 조합에 의해 영향을 받는 유전자의 고유한 기능적 부분 집합의 차등 발현에 대한 개요를 보여줍니다.

S 돌연변이 전사체에 대한 영향은 다른 시점보다 생물막 발달 30시간에서 더 두드러집니다. 이 결과는 유전자 선택 및 추가 검증 프로세스를 용이하게 하는 시간적 효과를 고려하여 우리의 작업 가설과 관련된 유전자의 특정 기능적 하위 집합을 정확하게 식별하는 데 도움이 되었습니다. 이 절차에 따라, 생화확적이고 단백질체학 방법은 또한 biofilm 내의 유기체의 특정한 생리와 변화 반응은인 무슨과 같은 추가 질문에 응답하기 위하여 실행될 수 있습니다.

이러한 포괄적이고 통합된 분석은 생물막이 매우 역동적이고 복잡한 환경인 실내 공동에서 병원성을 조절하는 방법을 더 이해하는 데 확실히 도움이 될 것입니다. 자세한 내용은 이 동영상 기사에 첨부된 PDF 파일을 확인하시기 바랍니다.