멀티 모달 분자 이미징 애플리케이션을위한 Biofunctionalized 프 러시안 블루 나노 입자

본 절차의 전체적인 목표는 다중 모드 분자 이미징 제제로 사용하기 위해 바이오 기능화된 프러시안 블루 나노입자를 합성하는 것입니다. 이는 우선 MRI 신호를 강화하는 가돌리늄 또는 망간 이온을 포함하는 프러시안 블루 나노입자를 합성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 나노입자 표면에 형광 아비딘(avadon)을 부착하는 것이며, 이를 통해 형광 이미징 능력을 부여합니다.

다음으로, 아바돈(avadon) 코팅 나노입자를 원하는 세포 표적 비오틴화 항체로 바이오 기능화합니다. 마지막 단계는 바이오 기능화된 나노입자의 크기, 제타 전위 및 시간적 안정성을 측정하여 품질 관리 검사를 수행하는 것입니다. 최종적으로, 바이오 기능화된 나노입자는 형광 이미지 및 MRI를 사용하여 혼합물 내의 특정 표적 세포군을 시각화하는 다중 모드 분자 이미징 응용 분야에 활용됩니다.

현재 상용화된 영상 조영제는 일반적으로 단일 모드이며 해상도가 해부학적 수준에 머물러 있습니다. 프러시안 블루 나노입자는 MRI와 형광이라는 두 가지 상호 보완적인 영상 모드를 결합하여 분자 영상 및 세포 하위 수준의 영상을 가능하게 합니다. 이러한 다중 모드 나노입자의 응용 분야는 치료 반응 모니터링뿐만 아니라 암 및 염증성 질환의 진단까지 확장됩니다.

이는 생체 기능화된 나노입자가 신체의 특정 영역 내에 있는 세포 집단을 표적하여 결합할 수 있기 때문입니다. 이 방법은 암 및 염증성 질환의 진단과 치료 반응에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 분자 영상의 민감도와 특이성으로부터 이점을 얻을 수 있는 다른 병리적 상태에도 적용될 수 있습니다. 형광 및 MRI를 활용하는 이 나노입자의 제조 아이디어는, 프러시안 블루와 FDA 승인을 받은 인체 경구 섭취 가능 성분을 단일 단계 합성법으로 안정적으로 합성할 수 있으며, 표준 생체 접합 기술을 통해 견고하게 생체 기능화할 수 있다는 점을 확인했을 때 처음 얻게 되었습니다.

먼저, 탈이온수 5 mL에 potassium hexacyanoferrate(II) 5 mM 용액을 조제하여 용액 A를 만듭니다. 다음으로, 망간 프러시안 블루 나노입자 합성을 위해 탈이온수 10 mL에 2.5 mM iron(III) chloride와 2.5 mM manganese(II) chloride가 포함된 용액 B를 조제합니다. 다른 나노입자는 텍스트 프로토콜에 기재된 대로 합성할 수 있습니다. 용액 B를 라운드 바텀 플라스크로 옮기고 실온에서 1000 RPM으로 교반합니다.

연동 펌프를 사용하여 용액 A를 시간당 10 milliliters의 속도로 용기에 한 방울씩 첨가합니다. 용액 A의 첨가가 완료되면, 혼합물을 1000 RPM으로 30분 동안 추가로 교반합니다. 그런 다음 혼합물을 1 milliliter씩 분주하여 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고, 각 튜브에 5 milli sodium chloride 0.2 milliliters를 첨가합니다.

튜브를 20,000 ×g에서 최소 10분 동안 원심분리한 후, 나노입자 펠렛만 남기고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 각 펠렛에 탈이온수 1 mL를 첨가합니다. 마이크로 팁을 사용하여 초음파 처리를 통해 나노입자가 용액 내에 균일하게 부유하도록 분산시킵니다.

마지막 원심분리 후 현탁액에서 초기 반응 성분을 제거하기 위해 나노입자를 최소 3회 더 세척하십시오. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 나노입자를 형광 염료로 코팅한 후, 나노입자를 1 mL의 탈이온수에 다시 현탁하십시오. 냉장고에서 비오틴화 항체 스톡을 꺼냅니다. 여기서는 anti neuron glial antigen 2와 anti-human eotaxin 3를 사용하십시오. 비오틴화 항체를 0.2 µm 나일론 마이크로 원심분리 필터로 옮긴 다음, 튜브를 14,000 ×g에서 10분 동안 원심분리하십시오.

다음으로, Aden 코팅 나노입자 1mg당 0.05mg 이하의 항체를 첨가하고 빛을 차단하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 튜브를 4°C에서 2~4시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 항체 부착 후, 1mg/mL 농도의 나노입자 샘플 10µL를 일회용 플라스틱 튜브의 탈이온수 990µL에 넣고, 튜브 캡을 닫은 후 vortexing하여 혼합합니다.

그런 다음, 측정 각도가 173도인 동적 광산란(dynamic light scattering) 시스템을 사용하여 나노입자의 평균 크기를 측정하십시오. 먼저, 약 100,000 cells/mL 농도로 PBS에 세포를 부유시킨 10 mL 현탁액을 준비합니다. 각 세포주의 비율이 서로 다른 혼합 배양 튜브는 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 준비해야 하며, 각 튜브에 세포를 차단하고 비특이적 결합을 최소화하기 위해 5% BSA 2 mL를 첨가합니다. 그 다음, 각 튜브에 1 mg/mL 농도의 생체 기능화 나노입자 1 mL를 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 배양합니다.

다음으로, 튜브를 1000 ×g에서 5분 동안 원심 분리하고 펠렛을 1 mL의 PBS로 다시 현탁하여 결합되지 않은 나노입자를 씻어냅니다. 이 과정을 최소 두 번 더 반복합니다. PBS에 포함된 10% formaldehyde를 사용하여 세포를 고정한 후, 세포 염색을 위해 PBS에 10 µg/mL의 seven amino actin 및 mycin D를 첨가합니다. 튜브를 얼음 위에서 30분 동안 배양한 후 PBS로 세포를 세척합니다.

다음으로, 유세포 분석기에 샘플을 로딩하고 각 샘플에서 게이팅된 세포 10,000개를 분석합니다. 레이저 공초점 현미경을 사용하여 형광 나노입자에 결합된 세포의 이미지를 촬영하는 유사한 절차는 텍스트 프로토콜에 설명되어 있습니다. 우선, T 75 플라스크에서 세포를 약 80% 정도의 밀도로 배양한 다음, 5 mL의 PBS로 세포를 헹구어 배지를 제거합니다.

1% BSA/PBS 5 mL를 첨가하여 세포를 1시간 동안 블로킹합니다. 그 다음, 0.5 mg/mL 농도의 항체 코팅 나노입자 5 mL를 플라스크에 넣고 세포를 1시간 동안 배양하여 나노입자가 결합되도록 합니다. 이어서, 결합되지 않은 나노입자를 제거하기 위해 PBS 5 mL로 세포를 3회 세척합니다.

그 후 0.25% trypsin EDTA 용액 2 mL를 첨가하고, 5분 동안 배양하여 플라스크에서 세포를 분리합니다. trypsin을 중화시키기 위해 DMEM 8 mL를 첨가한 후, 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮깁니다. 1000 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 형성합니다.

다음으로, 상층액을 흡입하여 제거하고 1 mL의 PBS로 세포를 재부유시킵니다. 세포를 고정하기 위해 10% formaldehyde in PBS 1 mL를 첨가한 후, 각 샘플 100 µL를 96-well flat bottom plate의 개별 웰로 옮깁니다. 각 웰에 탈이온수에 녹인 1% agarose 100 µL를 첨가하고 피펫팅으로 섞어줍니다.

겔을 4°C에서 12시간 동안 응고시켜 팬텀을 제작합니다. 겔이 응고된 후, 팬텀을 2% agar로 제작된 150 cm 정육면체 블록 옆의 수평 3 T 임상 자기공명영상 장치에 배치합니다. 그런 다음 팬텀과 agar 블록을 8채널 HD 뇌 코일 중심에 고정합니다. 이완 시간을 측정하기 위해 96-웰 플레이트의 중간 높이에서 0.5 mm 두께의 관상면 슬라이스를 촬영합니다. 생성된 나노입자의 수력학적 직경을 결정하기 위해 동적 광산란 분석법을 사용하였습니다. 안정성 연구를 통해 수성 및 세포 배양액 기반 실험 모두에서 나노입자의 장기 안정성을 확인하였습니다.

레이저 공초점 현미경 분석 결과, EOT three 항체가 탑재된 형광 나노입자가 EOL one 세포 표면에 특이적으로 결합한 것이 확인되었습니다. NG two 항체를 사용했을 때는 BSG 뉴로스피어 표면에 특이적으로 결합하였습니다. 생체 기능화된 나노입자는 유세포 분석으로 측정한 결과, 표적 세포 집단을 성공적으로 형광 표지할 수 있었습니다.

또한, 나노입자는 표적 세포와 대조 세포의 비율이 낮은 혼합물 내에서도 세포의 특정 하위 집단을 표적화할 수 있었습니다. 마지막으로, 생체 기능화된 나노입자는 표적 세포의 MRI 대조도를 증가시켰으며, nng가 적재된 나노입자로 처리된 세포와 두 종류의 항체 처리 세포는 대조 입자로 처리된 세포에 비해 T1 강조 영상에서 고신호를 나타냈습니다.

이와 대조적으로, A NNG two 나노입자는 대조군 입자와 비교하여 T two 가중 시퀀스에서 저신호 강도를 나타냈습니다. Once masters. 바이오 기능화된 프러시안 블루 나노입자의 합성은 적절하게 수행될 경우 2일 이내에 완료될 수 있습니다.

이 절차와 유사하게, 나노입자는 다양한 바이오폴리머 및 표적 리간드로 바이오 기능화하여 새로운 질병과 새로운 상태를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 세포군을 표지하기 위한 형광 및 이미징 응용 분야의 프러시안 블루 나노입자 합성 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 임상 MRI 자기장 내에서 연구를 수행할 때 안전 가이드라인과 표준 작업 절차를 엄격히 준수하는 것을 잊지 마십시오.