멀티 모달 분자 이미징 애플리케이션을위한 Biofunctionalized 프 러시안 블루 나노 입자

이 절차의 전반적인 목표는 다중 모드 분자 이미징 에이전트를 사용하기 위해 생체 기능화된 프러시안 블루 나노 입자를 합성하는 것입니다. 이것은 먼저 MRI 신호를 향상시키는 가돌리늄 또는 망간 이온을 포함하는 프러시안 블루 나노 입자를 합성하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 형광 이미징 기능을 부여하는 나노 입자 표면에 형광 아바돈을 부착하는 것입니다.

다음으로, 아바돈 코팅된 나노입자는 비오틴화 항체를 표적으로 하는 원하는 세포로 생체 기능화됩니다. 마지막 단계는 생체 기능화 나노 입자의 크기, 제타 전위 및 시간적 안정성을 측정하여 생체 기능화 나노 입자에 대한 품질 관리 검사를 수행하는 것입니다. 궁극적으로, 생체 기능화된 나노 입자는 형광 이미징 및 MRI를 사용하여 혼합물 내에서 특정 표적 세포 집단을 시각화하기 위해 다중 모드 분자 이미징 응용 분야에 활용됩니다.

현재 상용 이미징 에이전트는 일반적으로 단일 모드이며 해부학적 수준에서만 해상도를 제공합니다. 프러시안 블루 나노 입자는 MRI와 형광의 두 가지 상보적 이미징 모드를 결합하고 분자 이미징 및 세포 내 수준을 허용합니다. 다중 모드 나노 입자의 응용은 치료 반응 모니터링 외에도 암 및 염증성 질환의 진단으로 확장됩니다.

이는 생체 기능화 나노 입자가 신체의 지정된 영역 내의 세포 집단을 표적으로 삼고 결합할 수 있기 때문입니다. 이 방법은 암 및 염증성 질환 진단 및 치료에 대한 반응에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 분자 이미징의 민감도와 특이성으로부터 이점을 얻을 수 있는 다른 병리학적 상태에도 적용할 수 있습니다. 형광과 MRI를 사용하여 프러시안 블루와 FDA 승인 인체 경구용 제제를 1액형 합성 방식을 사용하여 안정적으로 합성하고 표준 바이오 접합체 기술을 사용하여 강력하게 생체 기능화할 수 있다고 판단했을 때 이러한 나노 입자를 생산하기 위한 아이디어를 처음 떠올렸습니다.

시작하려면 탈이온수 5밀리리터에 헥사 사노페레이트 2의 500만 몰 용액을 준비하여 2.5 밀리몰 철 3 염화물과 2.5 밀리몰 망간을 포함하는 용액 A 다음 수리 용액 B를 만듭니다. 망간 프러시안 블루 나노 입자의 합성을 위해 10 밀리리터의 탈 이온수에 2 개의 염화물. 다른 나노 입자는 텍스트 프로토콜에 표시된 바와 같이 합성할 수 있습니다: 용액 B를 둥근 바닥 플라스크로 옮기고 용액을 실온에서 1000RPM으로 교반합니다.

연동 펌프를 사용하여 용액을 첨가하고, 시간당 10 밀리리터의 속도로 용기에 A를 적가합니다. 용액 A의 첨가가 완료된 후 혼합물을 1000RPM에서 추가로 30분 동안 저어줍니다. 그런 다음 혼합물의 1ml 분취액을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 각 튜브에 0.2ml의 5밀리리터 염화나트륨을 추가합니다.

20, 000 시간 G에 적어도 10 분 동안 관을 원심 분리하고, 그 후에 주의깊게 supinate를 제거해, nanoparticles의 펠릿을 남겨두. 다음으로, 각 펠릿에 1ml의 탈이온수를 추가합니다. 마이크로 팁을 사용하여 초음파 처리에 의해 나노 입자를 용액에 고르게 현탁시킵니다.

나노 입자를 최소 3회 더 세척하여 최종 스핀 후 현탁액에서 초기 반응 성분을 제거하고, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 나노 입자를 형광 덴으로 코팅한 후 나노 입자를 1ml의 탈이온수에 다시 현탁시키고, 냉장고에서 비오틴화 항체 스톡을 제거합니다. 여기. 반대로 neuron glial 항원 2 및 반대로 인간적인 eotaxin 3를 이용하십시오. 비오틴화된 항체를 0.2 마이크로 나일론 마이크로 퍼지 필터로 옮긴 다음 14, 000배 G에서 10분 동안 튜브를 원심분리합니다.

다음으로, Aden 코팅 나노 입자 1 그램 당 0.05mg 이하의 항체를 추가하고 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 보호합니다. 섭씨 4도에서 2-4시간 동안 부드럽게 흔들면서 튜브를 배양합니다. 항체를 부착한 후 일회용 플라스틱 베트 캡에 1밀리리터 나노입자 샘플 10마이크로리터를 1밀리리터당 1밀리그램 나노입자 샘플 990마이크로리터에 넣고 베트와 V를 혼합합니다.

그런 다음 측정 각도가 173도인 동적 광 산란 시스템을 사용하여 나노 입자의 평균 크기를 결정합니다. 약 100, 000 ml의 농도로 PBS에서 세포의 10 밀리리터 현탁액을 준비하는 것으로 시작하십시오 각 세포주의 다양한 비율을 포함하는 혼합 배양 튜브의 경우 각 세포주에 대해 5%BS, A의 2 밀리리터에서 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포를 차단하고 비특이적 결합을 최소화하기 위해 각 튜브에 대해 A를 준비해야 합니다. 그런 다음 밀리리터당 1밀리그램 1밀리리터를 첨가하고 각 튜브에 나노 입자를 생체 기능화하고 혼합물을 1시간 동안 배양합니다.

다음으로, 5분 동안 1000배 G로 튜브를 회전시키고 1밀리리터의 PBS에서 펠릿을 다시 구부려 결합되지 않은 나노 입자가 없는 세포를 헹굽니다. 이 과정을 두 번 이상 반복합니다. PBS에 10%포름알데히드를 사용하여 세포를 고정한 다음 밀리리터당 10마이크로그램, PBS에 7개의 아미노 액틴 및 마이신 D를 첨가하여 세포를 염색하고 얼음에서 튜브를 30분 동안 배양한 다음 PBS로 세포를 헹굽니다.

다음으로, 샘플을 유세포 분석기에 로드하고 각 샘플에서 10, 000개의 게이트 세포를 분석합니다. 레이저 컨포칼 현미경을 사용하여 형광 나노 입자에 결합된 세포를 이미지화하는 것과 유사한 절차가 텍스트 프로토콜에 설명되어 있습니다. 시작하려면 T 75 플라스크의 세포를 약 80% 합류점으로 착용한 다음 5밀리리터의 PBS로 배지가 없는 세포를 헹굽니다.

PBS에 1%BSA 5ml를 넣고 1시간 동안 세포를 차단합니다. 그런 다음 0.5 milligrams per millilit 항체 코팅 나노 입자 5 ml를 플라스크에 추가하고 나노 입자가 결합할 수 있도록 1시간 동안 세포를 배양합니다. 다음으로, 결합되지 않은 나노 입자를 제거하기 위해 5 밀리리터의 PBS로 세포를 세 번 헹굽니다.

그런 다음 2 밀리리터의 0.25 % 트립신 EDTA 용액을 넣고 세포를 5 분 동안 배양하여 플라스크에서 세포를 분리합니다. 8ml의 DMEM을 첨가하여 tryin을 퀀닝한 다음 세포 현탁액을 원심분리 튜브로 옮깁니다. 1000배 G로 5분 동안 회전시켜 세포를 펠릿화합니다.

다음으로, supinate를 흡인하고 1ml의 PBS에 세포를 재현탁합니다. PBS에 10% 포름알데히드 1밀리리터를 첨가하여 세포를 고정한 다음 각 샘플 100마이크로리터를 96웰 평면 바닥 플레이트의 별도 웰로 옮깁니다. 탈이온수에 용융된 1%aros 100마이크로리터를 각 우물에 넣고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.

젤이 섭씨 4도에서 12시간 동안 응고되어 팬텀을 생성하도록 합니다. 젤이 응고된 후 팬텀을 2%한천의 단단한 150cm 큐브 블록 옆에 수평 3T 임상 자석에 놓습니다. 그런 다음 이완 시간을 측정하기 위해 8 채널 HD 브레인 코일의 중앙 내에 팬텀과 한천 블록을 고정하고, 96 웰 플레이트의 중간 높이에서 촬영 한 0.5mm 두께의 코로나 슬라이스를 사용하여 동적 광 산란 분석을 사용하여 생성 된 나노 입자의 유체 역학적 직경을 결정하고, 안정성을 측정하고, 연구는 나노 입자의 장기 안정성이 수성 및 세포 배지 기반 실험 모두에 사용된다는 것을 확인했습니다.

레이저 컨포칼 현미경 검사는 EOL 1 세포의 표면에 특이적으로 발견되는 EOT 3에 대한 항체가 적재된 형광 나노 입자를 보여주었습니다. NG two에 대한 항체가 사용되면 BSG 신경구의 표면에 특이적으로 결합됩니다. bio functionalized nanoparticles는 유세포 분석에 의해 측정된 대로 표적 세포의 집단을 성공적으로 형광 표지할 수 있었습니다.

또한, 나노 입자는 세포 비율을 제어하기 위해 낮은 표적 세포에서도 혼합물에서 세포의 특정 하위 모집단을 표적으로 삼을 수 있었습니다. 마지막으로, 생체 기능화 나노 입자는 NNG가 적재된 나노 입자로 처리된 세포인 표적 세포의 MRI 대비를 증가시켰습니다. 2개의 항체는 대조군 입자로 처리된 세포와 비교하여 T, one 가중 서열에서 초강도를 보였습니다.

대조적으로, A NNG 두 개의 나노 입자는 대조 입자와 비교하여 T 두 개의 가중 서열에서 저강도를 부여했습니다. 일단 마스터. 생체 기능화 프레젼 블루 나노 입자의 합성은 적절하게 수행되면 2 일 이내에 완료 될 수 있습니다.

이 절차와 유사하게, 나노 입자는 새로운 질병과 새로운 상태를 조사하기 위해 다양한 생체 고분자 및 표적 리간드로 생체 기능화될 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세포 집단을 라벨링하기 위한 형광 및 이미징 응용 분야를 위해 프러시안 블루 나노 입자를 합성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 임상 MRI 자석에 대한 연구를 수행하기 위한 안전 지침과 표준 운영 절차를 엄격하게 따르는 것을 잊지 마십시오.